SerbestÇe Hareket Eden Hayvanlarda Nöral AktiviteYi Kaydetmek Için Çoklu Fiber Fotometri

Özet

Bu protokol, çok fiberli fotometri kayıtlarının nasıl uygulanacağını ve gerçekleştirildirilebildiğini, kalsiyumdan bağımsız eserlerin nasıl düzeltilebildiğini ve çift renkli fotometri görüntüleme için önemli hususları ayrıntılarıyla anlatır.

Özet

Serbestçe hareket eden bir hayvanda bir grup nöronların aktivitesini kaydetmek zorlu bir girişimdir. Ayrıca, beyin daha küçük ve daha küçük fonksiyonel alt gruplara bölündükçe, projeksiyonlardan ve/veya genetik olarak tanımlanmış nöronların alt popülasyonlarından kaydetmek çok önemli hale gelir. Fiber fotometri bu zorlukların üstesinden gelebilir erişilebilir ve güçlü bir yaklaşımdır. Optik ve genetik metodolojileri birleştirerek, nöral aktivite, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ifade edilerek derin beyin yapılarında ölçülebilir, bu da nöral aktiviteyi kolayca ölçülebilen bir optik sinyale dönüştürür. Mevcut protokol, çok fiberli fotometri sisteminin bileşenlerini, ışık teslim etmek ve toplamak için derin beyin yapılarına nasıl erişilmeyi, hareket yapılarını hesaba katmak için bir yöntem ve floresan sinyalleri nasıl işleyip analiz edileteceklerini ayrıntılarıyla anlatıyor. Protokol, tek veya birden fazla implante optik liflerden tek veya çift renkli görüntüleme yaparken deneysel hususları ayrıntılarıyla anlatır.

Giriş

Nöral tepkileri bir hayvanın davranışının belirli yönleriyle ilişkilendirme yeteneği, belirli bir nöron grubunun bir eylemi veya uyarıcıyı yönlendirmede veya yanıtlamada oynadığı rolü anlamak için önemlidir. Hayvan davranışının karmaşıklığı göz önüne alındığında, en basit eylemleri bile etkileyebilecek sayısız iç durum ve dış uyaran göz önüne alındığında, tek deneme çözünürlüğü ile bir sinyal kaydetmek araştırmacıları bu eylemlerin üstesinden gelmek için gerekli araçlarla donatır. Sınırlama.

Fiber fotometri, diğer in vivo kayıt teknikleri, yüksek sinyal-gürültü oranı ve çeşitli kayıt yeteneği ile karşılaştırıldığında göreceli basitliği nedeniyle sistem nörobilim alanında birçok araştırmacı için tercih edilen teknik haline gelmiştir davranış salk›r›mlar›^1,2,3,4,^5,6,^7,8. Geleneksel elektrofizyolojik yöntemlerin aksine, fotometri en sık genetik kodlanmış kalsiyum göstergeleri ile birlikte kullanılan optik yaklaşımdır (GECIs, GCaMP serisi)⁹. GECIs kalsiyum bağlı olup olmadığını dayalı floresan yeteneklerini değiştirmek. Nöronlardaki kalsiyumun iç konsantrasyonu çok sıkı bir şekilde düzenlendiğinden ve bir nöron bir eylem potansiyeli ateşlediğinde voltaj kapılı kalsiyum kanalları açıldığından, iç kalsiyum konsantrasyonunda geçici artışlar meydana gelir ve bu da floresan bir GECI yeteneği, nöronal ateş için iyi bir proxy olabilir⁹.

Fiber fotometri ile uyarma ışığı beyne ince, çok modlu optik fiberden aşağı doğru yönlendirilir ve aynı lif aracılığıyla bir emisyon sinyali toplanır. Bu optik lifler hafif ve bükülebilir olduğundan, bir hayvan büyük ölçüde engelsiz hareket edebilir, davranış testleri ve koşulları geniş bir dizi ile uyumlu bu tekniği yapma. Hızlı hareketler veya fiber optik yama kablosunun toplam iç yansımayı koruyabileceği yarıçapın ötesinde bükülme gibi bazı koşullar, sinyal yapıtlarına neden olabilir. Sinyalin gürültüden uzakdur, "izosbestik nokta" olarak bilinen GCaMP özelliğinden yararlanabiliriz. Kısaca, GCaMP ile, uyarma ışığının dalga boyu sola kaydırıldıkça, kalsiyuma bağlı durumdaki salınımı azalır ve kalsiyum-bağlı olmayan durumdaki emisyon marjinal olarak artar. Bu iki emisyonun göreceli yoğunluğunun eşit olduğu nokta sisosbestik nokta olarak adlandırılmaktadır. GCaMP bu noktada heyecanlı olduğunda, emisyon iç kalsiyum konsantrasyonlarında değişiklikler etkilenmez, ve sinyal varyans en sık fiber optik yama kablosu veya nöral doku hareketi aşırı bükme gelen sinyalin zayıflaması nedeniyle implante fiber göreli.

Tek birimelektrofizyoloji, tek hücreli ve tek başak seviyesindeçözünürlüğü sayesinde in vivo kayıtları serbestçe hareket eden altın standarttır. Ancak, kaydedilen hücrelerin moleküler kimliğini saptamak zor olabilir ve post-hoc analizi oldukça zahmetli olabilir. Fiber fotometri tek hücreçözünürlüğü yok iken, araştırmacılar geleneksel teknikler ile ele almak imkansız sorular sormak için izin verir. Viral stratejilerin transgenik hayvanlarla birleştirilmesiyle, GECIs'in ekspresyonu, kalsiyum sinyalinin doğrudan aksonda izlenmesi yle yapilebilen popülasyon veya projeksiyon tanımlı nöral aktiviteyi kaydetmek için genetik olarak tanımlanmış nöronal tiplere yönlendirilebilir. terminalleri^10,11. Ayrıca, birden fazla fiber optik kanüller implante ederek, aynı anda aynı hayvan^12,13çeşitli beyin bölgeleri ve yolları nöral aktivite izlemek mümkündür.

Bu el yazmasında, tek ve çok fiberli fotometri için bir teknik, kalsiyumdan bağımsız eserler için nasıl düzeltilme ve mono-ve çift renkli kayıtların nasıl yapılacağını ayrıntılı olarak anlatacağız. Ayrıca, kişinin sormasını sağladığı soru türlerine ve artan karmaşıklık düzeylerine örnekler salıyoruz (bkz. Şekil 1). Bu protokolde ayrıntılı olarak yer alan çok fiberli kayıtlar için fiber fotometri kurulumu, https://sites.google.com/view/multifp/hardware bulunan malzemelerin bir listesi kullanılarak oluşturulabilir (Şekil 2).

Sistemin GCaMP6 veya varyantlarından kalsiyumbağımsız ve kalsiyuma bağımlı floresan emisyonu için hem 410 nm hem de 470 nm uyarma dalga boyları için donatılması esastır. Özel olarak oluşturulmuş kurulumlar için veya sistemi çalıştıracak kullanılabilir bir yazılım yoksa, ücretsiz, açık kaynak programı Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) kullanılabilir. Alternatif olarak, fiber fotometri MATLAB (örneğin, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)¹² veya diğer programlama dili¹⁴üzerinden çalıştırılabilir. Sistemin yazılım ve donanım ı 410 nm ve 470 nm LED'lerin ve kameranın manipülasyonuna, görüntülerin çıkarılmasına(Şekil 2)ve liflerin etrafına çizilen ilgi bölgelerindeki ortalama floresan yoğunluğunun hesaplanmasına izin vermelidir. görüntüler. Çıkış, yama kablosundaki her bir elyaftan 470 nm ve 410 nm LED ile kaydedilen ortalama yoğunluk değerlerinin bir tablosu olmalıdır. Çok fiber deneyler yaparken, 400 μm paketlenmiş lifler farelerin hareketini sınırlayabilir. Bu gibi durumlarda, daha fazla esneklik sağlayan 200 μm yama kablosu kullanmanızı öneririz. Farelerin eğitimi sırasında daha küçük kukla kablolar kullanmak da mümkün olabilir.

Bu fiber fotometri edinimi sırasında ilgi olayları için zaman noktaları ayıklamak mümkün olmak çok önemlidir. Sistem belirli olaylar için TTL'leri tümleştirmek için yerleşik bir sistem sağlamazsa, alternatif bir strateji deneme sırasında belirli zaman ve olaylarla hizalamak için kaydedilen tek tek zaman noktalarına bir zaman damgası atamaktır. Zaman damgalama bilgisayar saati kullanılarak yapılabilir.

Protokol

Tüm deneyler Kaliforniya Üniversitesi, San Diego Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kanada Rehberi uyarınca yapıldı ve Université Laval Hayvan Koruma tarafından onaylandı Komitesi.

1. CMOS (tamamlayıcı metal oksit yarı iletken) kamera ile bireysel veya dallanma yama kablosu arasındaki optik yolun hizalanması

1. 5 eksenli çevirmendeki tüm vidaları gevşetin (11, Şekil 2B).
2. 5 eksenli çevirmene yapıştırılmış olan adaptöre [SMA (alt minyatür A) veya FC (fiber optik konektör)] yama kablosunu (12, Şekil 2B)vidalayın.
3. 470 nm uyarma ışığını (1, Şekil 2B)düşük güçte (100 μW) açın ve otofloresan plastik kaydırağa işaret eden yama kablosunun ucunu yerleştirin. Bu gelecekteki kayıtları herhangi bir etkisi yoktur ama sadece hizalama işlemi görselleştirmek içindir.
4. Canlı modda CMOS kameradan (13, Şekil 2B)kayıt yapın. Görüntü tamamen siyah olmayana kadar kazancı artırın veya arama tablosunu (LUT) ayarlayın. Amaç odak noktasında bir görüntü görebilmektir (10, Şekil 2B).
5. 5 eksenli çevirmeni hedefe doğru ilerleterek, 470 nm'lik ışığın yama kablosunun SMA veya FC ucundaki lif üzerinde ortalanmasını sağlayarak, kamerada bir görüntü çözülene kadar ilerleyin.
6. Görüntü ortalanana ve iyi çözülene kadar X ve Y eksenlerini ayarlayın.
7. Yama kablosunun ferrule ucundan yayılan ışığı görselleştirin. Bir iotropik daire olarak görünmelidir. Dallanma yama kablosu kullanılırsa, her yama kablosunun ferrule uçlarında yayılan ışık miktarı benzer olmalıdır. Daire isotropik değilse veya yayılan ışık eşit değilse, X-Y eksenindeki 5 eksenli çevirmeni ayarlayın.

2. Ortalama floresan yoğunluğunun ölçülmesi için lifler in etrafında ROI kurulumu

1. Lifleri daha iyi görselleştirmek için tüm uyarma ışıklarını açın. Kamerayı, hiçbir pikselin doygun luk tasnİf edilebis olması ve liflerin net bir görüntüsünün mevcut olacak şekilde kazanisini ayarlayın.
2. Canlı kayıt veya bir ön görüntü almak.
3. Liflerin etrafına ROI'lar çizin ve kayıtlar sırasında ortalama yoğunluk değerlerinin ölçümü için saklayın (Şekil 2A).
4. Birden fazla fiber kayıt için, sinyalleri bağımsızlık için test edin.
   1. Tüm liflerden canlı kayıt.
   2. Bir lifi ışık kaynağına doğru işaretle ve parmağınızla dokunun. Çok büyük dalgalanmalar sadece bu kanalda meydana gelmelidir (kabul edilebilir sızıntı 1:1000).
   3. Sinyaller bağımsız değilse, daha muhafazakar ROI'ları yeniden çizin ve bağımsızlık testini tekrarlayın.
5. Hangi YG'nin hangi elyaf, renkli bant veya ojeye karşılık gelir etiketlemek ve takip etmek için liflerin sonuna uygulanabilir. İkincil bir anımsatıcı olarak herhangi bir denemebaşlamadan önce bir resim alın.

3. Kayıt alanının kurulumu

1. Standları, kelepçeleri veya tutucuları kullanarak yama kablosunu arenanın üzerine asın.
2. Hayvan serbestçe tüm arena boyunca hareket edebilirsiniz emin olun, lif uzunluğu ile sınır tanımayan.
3. Operant kutusu veya açık alan kullanılsın, yama kablosunun hayvana en az bükme ile ulaşmasını sağlayın. Bu bir burun dürtme gerektiriyorsa, lif bükme önlemek için yeterli oda yükü olduğundan emin olun. Yama kablosunun aşırı bükülmesinden veya bükülmesinden kaçının.

4. In vivo kayıtları

NOT: Fiber fotometri deneyleri için optik fiber kanül implantasyonu prosedürü Sparta ve ark^15'teaçıklandığı gibi optogenetik prosedürü ile aynıdır. Kafa kapağının kafatası kemiğine sağlam bir şekilde sabitlenir etmesini sağlayan diş çimentosu (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanmanızı öneririz. Diş çimentosu özellikle demirleme vidalarının kullanılamadığı durumlarda yararlı olacaktır.

1. Yama kablosunun liflerinin distal ucunu göz ve minifiber mikroskopla görsel olarak inceleyin. Liflerin yüzeyi çizilirse, liflerince kum (1 μm ve 0,3 m) ile lif parlatma/lapping film kullanarak yeniden parlatılır.
2. Yama kablosunun distal uçlarını %70 etanol ve pamuk uçlu aplikatör ile temizleyin.
3. %70 etanol ve pamuk uçlu aplikatör kullanarak fiber optik kanülleri temizleyin.
4. Yama kablosunun ferrule ucunu, siyah bir shrink tüpüyle kaplı seramik split kollu kullanarak implante edilen elyafa bağlayın. Bağlantı sırasında, kılıfın sıkı olduğundan emin olun, aksi takdirde yeni bir kılıf kullanın.
   NOT: Yama kordonu ferrule ve implant arasında herhangi bir boşluk varsa büyük miktarda sinyal kaybı olacaktır ve kayıtlar çalışmaz.
5. Davranışsal testlerbaşlamadan önce hayvanın birkaç dakika lığına iyileşmesine izin verin.
6. Optik sinyali kaydetmeye başla ve deneyi çalıştır.
7. Kayıt sırasında, kaliteli kayıtları sağlamak için canlı izleme dikkatli bir göz tutmak. Sinyalin, ilk 2 dakika kayıtta zamanın bir fonksiyonu olarak hızla azalması beklenmektedir. Bu etki ısı aracılı LED bozunma neden olur, Böylece ısı artışı optik elemanın direncini artırır.
8. GCaMP'nin açık/kapalı kinetiklerini aşan sinyalde bir sıçrama meydana gelirse, bu genellikle kılıfın yeterince sıkı olmadığının ve yama kablosu ile implant arasındaki boşluğun değiştiğini gösterir. Bu durumda, deneyi durdurun ve hayvanı yeni bir kılıf kullanarak yeniden bağlayın.

5. Fiber fotometri veri analizi

NOT: Bu, çoğu kayıt için iyi çalışan bir veri analizi yöntemidir. Ancak, alternatif yaklaşımlar uygulanabilir. Veri analizi için örnek kodu burada bulabilirsiniz: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.

1. Ekstrakt ortalama floresan yoğunluğu değerleri 470 nm(Int470) ve 410 nm(Int410) LED'lerden, her bir lif için karşılık gelen kaydedildi.
2. Hareketli ortalama algoritma kullanarak her sinyali düzleştirin (Şekil 3A).
3. Eğimi ve düşük frekansı kaldırmak için uyarlanabilir yinelemeli olarak yeniden ağırlıklandırılan Penalized En Az Kareler (airPLS) algoritmasını (https://github.com/zmzhang/airPLS) kullanarak her sinyalin temel düzeltmesini(Şekil 3A ve 3B)gerçekleştirin sinyallerdeki dalgalanmalar.
4. Her sinyali ortalama değer ve standart sapmayı kullanarak standartlaştırın (Şekil 3C):
   
5. Negatif olmayan sağlam doğrusal regresyon kullanarak, standartlaştırılmış zInt410 -zInt470 sinyallerini(Şekil 3D)regresyon fonksiyonuna sığdırın:
   
   1. ZInt 470 'e uygun zInt410(fitInt410, Şekil 3D,E)yeni değerleri bulmak için doğrusal regresyon parametrelerini kullanın (a, b)
      
6. Normalleştirilmiş dF/F (z dF/F)(Şekil 3F) hesaplayın:
   

6. Eşzamanlı çift renkli kayıtlar

1. Kırmızı floresan kalsiyum sensörü ve uygun dikroik aynalar ve filtreler heyecanlandırmak için fotometri sistemine 560 nm LED ekleyin (ayrıntılı açıklama için Kim ve ark., 2016 bakınız)¹².
2. Yeşil ve kırmızı emisyon dalga boylarını ayırmak için hedef ve CMOS kamera arasında bir görüntü ayırıcı ekleyin (Bkz. Şekil 5). Görüntü ayırıcı, kamera sensöründe kırmızı ve yeşil sinyallere karşılık gelen iki aynalı görüntü oluşturacaktır (örn. 3 dallı bir yama kablosu 6 fiberden bir görüntü oluşturur).
3. Yukarıda ayrıntılı olarak her iki renkte tüm lifler etrafında ROIs çizin. Her yatırım getirisini ilgili lif ve kanal (yeşil ve kırmızı) ile net bir şekilde tanımladığından emin olun (Şekil 4A).
4. 470 nm ve 560 nm LED ile eşzamanlı uyarma tetikleyin ve 410 nm LED ile değiştirin(Şekil 5A).

7. Çift renkli veri analizi

1. Int470 sinyali için fitint410'u bulmak ve z dF/F'yihesaplamak için Bölüm 5'teki adımları izleyin.
2. Kırmızı yalıtılı GECIs'lerin izosbestik noktası genellikle bilinmemekle birlikte, yeşil kanalda 410 nm LED ile kaydedilen sinyal her iki kanalda da hareket düzeltmesi için kullanılabilir. Int560 sinyali için fitint410'u bulmak ve z dF/F'yihesaplamak için Bölüm 5'teki adımları izleyin.

Sonuçlar

Davranışsal yanıtların nöral korelasyonları çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebilir. Bu örnekte, lateral habenulada (LHb) sonlandırılabilen lateral hipotalamik bölgeden (LHA) akson terminallerinin aktivitesini ölçmek için in vivo fiber fotometri kullandık. Yabani tip farelere LHA'da GCaMP6 (AAV-hSyn-GCaMP6s) kodlayan bir adeno ilişkili virüs (AAV) enjekte edildi ve lhb'nin hemen üzerinde bir optik lif ucu ile implante edildi(Şekil 4A). GCaMP6s ek...

Tartışmalar

Fiber fotometri, araştırmacıların serbestçe hareket eden hayvanlarda tanımlanmış nöronal popülasyonlardan toplu kalsiyum dinamiği kaydetmelerine olanak tanıyan erişilebilir bir yaklaşımdır. Bu yöntem, zorunlu yüzme testleri 2 , korku-klima¹⁸, sosyaletkileşimler^1,4, ve diğerleri⁷ gibi "hareket ağır" görevleri de dahil olmak üzere davranış testleri geniş bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long	Thorlabs	SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long	Thorlabs	SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long	Thorlabs	SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable	Thorlabs	M59L01
12.7 mm Optical Post	Thorlabs	TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder	Thorlabs	PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube	Thorlabs	KPS101
20x objective	Thorlabs	RMS20X	#10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount	Thorlabs	CM1-DCH/M	#8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED	Doric Lenses	CLED_405	#2 in Figure 2
410 nm bandpass filter	Thorlabs	FB410-10	#5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED	Doric Lenses	CLED_465	#1 in Figure 2
470 nm bandpass filter	Thorlabs	FB470-10	#4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter	Semrock	FF01-560/14-25	#5 in Figure 5
560 nm LED	Doric Lenses	CLED_560	#1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount	Thorlabs	K5X1	#11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet	Thorlabs	AC254-035-A-ML	#7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator	Thorlabs	AD11F	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator	Thorlabs	AD127-F	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard	Thorlabs	MB1824
Clamping Fork	Thorlabs	CF125
Cube connector	Thorlabs	CM1-CC
Dual 493/574 dichroic	Semrock	FF493/574-Di01-25x36	#10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6	Semrock	FF01-535/22-25	#6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels	Thorlabs	XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining	Thorlabs	SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder	Thorlabs	SM1QP	#4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light	Thorlabs	F671SMA-405	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light	Thorlabs	F240SMA-532	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter	Semrock	FF01-520/35-25	In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera	Thorlabs	DCC3260M	#13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter	Neurophotometrics	SPLIT	#14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff	Thorlabs	DMLP425R	#8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff	Semrock	FF495-Di03	#9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement	C&B
M8 - M8 cable	Doric Lenses	Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas	Doric Lenses		Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords	Doric Lenses		Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter	Semrock	FF01-600/37-25	In light beam splitter
T7 LabJack	LabJack
T-cube LED Driver	Thorlabs	LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240	Thorlabs	CAB-DCU-T3