Sonraki Adım Taking: Bir Nöral Coaptation Ortotopic Hind Limb Transplant Modeli Sıçan Fonksiyonel Kurtarma Maksimize etmek

Özet

Bu protokol, immünoloji ve fonksiyonel iyileşme nin eşzamanlı çalışmasına yönelik sağlam, tekrarlanabilir vasküler kompozit allotransplant (VCA) modelini sunmaktadır. El dikilmiş vasküler anastomozlar ve nöral coaptation ile sağ orta uyluk arka ekstremite ortopik nakli titiz tekniği yatırım zaman fonksiyonel kurtarma çalışma yeteneği verir.

Özet

Özellikle ekstremite nakli ve genel olarak vaskülarize kompozit allotransplant (VCA) immünsupresif ve fonksiyonel nöromotor kurtarma mevcut sınırlamalar tarafından stymied edilmiştir geniş terapötik söz var. Birçok hayvan modelleri VCA benzersiz özellikleri incelemek için geliştirilmiştir, ama burada aynı anda mevcut VCA sınırlama her iki yönünü araştırmak için tasarlanmış sıçanlarda ortotopik arka ekstremite nakli sağlam bir tekrarlanabilir modeli mevcut: immünsupresyon stratejileri ve fonksiyonel nöromotor kurtarma. Modelin özünde titiz bir taahhüt dinleniyor, el dikilmiş vasküler anastomozlar ve femoral sinir ve siyatik sinir el dikilmiş nöral coaptation gibi zaman test mikrocerrahi teknikleri. Bu yaklaşım, rehabilitasyon, günlük faaliyetlerin devamı ve fonksiyonel testler yeteneğine sahip daha uzun ömürlü hayvanlar için izin dayanıklı ekstremite rekonstrüksiyonları verir. Konvansiyonel immünsupresif ajanların kısa süreli tedavisi ile, allotransplanted hayvanlar nakil sonrası 70 güne kadar hayatta, ve isotransplanted hayvanlar ameliyat sonrası 200 gün ötesinde uzun ömürlü kontroller sağlar. Nörolojik fonksiyonel iyileşme nin kanıtları ameliyat sonrası 30 gün mevcuttur. Bu model sadece VCA ve sinir rejenerasyonu için benzersiz immünolojik soruları sorgulamak için yararlı bir platform sağlar, ama aynı zamanda vca için özel olarak tasarlanmış yeni tedavi stratejileri in vivo test sağlar.

Giriş

Vaskülarize-kompozit allotransplant (VCA) veya kompozit doku allotransplant (CTA) daha geniş kategori altında ekstremite nakli henüz terapötik sözünü yerine getirmemiştir. Lyon, Fransa ve Louisville, Kentucky 1998 ve 1999 yılında ilk başarılı insan el nakli bu yana, 100'den fazla üst ekstremite nakli dikkatle seçilmiş hastalarda dünya çapında yapılmıştır¹. Daha geniş uygulanabilirlik önemli immünsupresyon ve sınırlı fonksiyonel nöromotor kurtarma tarafından stymied olmuştur. Mevcut immünsupresyon stratejileri fırsatçı enfeksiyon^2%77 insidansı karşısında akut ret% 85 insidansı ile sonuçlanır. Öte yandan, el nakli sonrası fonksiyonel iyileşme gerçekleşir; Kol Omuz ve El (DASH) puanları ortalama Sakatlık 71 den 43 geliştirmek, ancak fonksiyon bu düzeyde hala bir sakatlık²olarak nitelendirebilir . Ekstremite naklinin hayat kurtarıcı olmayan doğası göz önüne alındığında, VCA'da bir sonraki adımı atmak için hayvan modellerinde mevcut teknikler rafine edilmelidir.

1978 yılında ekstremite nakli ilk sıçan modeli bu yana³, Birçok yenilikçi hayvan modelleri VCA alanında ilerletmek için geliştirilmiştir⁴, operatif zaman en aza indirmek için vasküler kelepçeli anastomozlar birleştiren^5,6, heterotopik osteomiyokutanöz nakli alıcı^hayvanafizyolojik hakaret en aza indirmek için 7^,8,9,10,11, ve yeni immünolojik yaklaşımlar^7,12,13,14. Burada sunulan ortotopik sağ arka ekstremite orta uyluk naklisıçan modeli aynı anda mevcut VCA sınırlama her iki yönünü araştırmak için sağlam, tekrarlanabilir model platformu bir ön yatırım olarak el dikilmiş vasküler anastomoz ve nöral coaptation gibi titiz, zaman test mikrocerrahi teknikleri vurgulamaktadır: immünsupresyon stratejileri ve fonksiyonel nöromotor kurtarma.

Protokol

Tüm deneyler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yapılmıştır ve Northwestern Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Belirli yordamlar IS00001663 protokolü altında gerçekleştirilmiştir.

NOT: İki sıçan suşları kullanıldı: Lewis sıçanları ve Ağustos Kopenhag x İrlandalı (ACI) sıçanlar. Hayvanlar üç tedavi grubuna ayrıldı: immün baskıolmadan allotransplant (ACI Lewis), konvansiyonel immün baskılama ile allotransplant (Lewis ACI) ve isotransplant (Lewis Lewis veya ACI ACI için). Lewis bir inbred gerginlik, ACI sıçanlar bir out-bred vahşi tip temsil ederken, bu nedenle bu kombinasyon kötü durumda ret yanıtı modellemek için seçildi. Konvansiyonel immünsupresyon postoperatif gün (POD) eksi 1'den POD 28'e kadar rapamisin 1 mg/kg veya POD 0'dan POD 14'e kadar FK506 3 mg/kg olarak ve daha sonra haftada bir kez deri altı uygulandı. Hem erkek hem de dişi sıçanlar, ameliyat sırasında 250 ila 400 gram ağırlığında, 8 ila 16 haftalık tantanaları ydı.

1. Donör sağ arka ekstremite hasat

1. Uygun bir atma sistemi ile bir buharlaştırıcı ile saf oksijen% 5 izofluran ile genel anestezi indüklemek.
2. Parmak tutam ile anestezi yeterli derinliği onaylamak ve sonra sağ arka ekstremite ve sağ kasık cerrahi sitekürk kesmek için saç makası kullanın
3. Down-titrat bir kemirgen burun konisi ile isoflurane için 2-2.5%.
4. Altında ısıtma yastığı olan bir ameliyat panosunda yanlara bantlanmış yayılmış uzuvları ile fare supine konumlandırın. Tüysüz cildi %70 sürtünme alkolile dezenfekte edin ve cerrahi alanı steril gazlı bezle koruyun.
5. Uygun bir mikrocerrahi mikroskop kullanarak, mikrocerrahi aletler, ve bipolar ve monopolar elektrokoter kolay erişim ile, diseksiyon başlar.
6. Sağ arka ekstremite çevresinde bir çevresel deri / deri altı doku kesi yapmak için makas kullanın. Inguinal ligament ile kabaca aynı düzeyde medial olarak başlayın ve çevresel kesi tamamlamak için dorsal-lateral uzatmak.
7. Kesinin hemen altındaki kas tabakasını ortaya çıkardıktan sonra, kas tabakasından proksimal deriye/subkutan flebeye giden yüzeysel epigastrik damarları inceleyin ve kauterize edin.
8. Proksimal flebi inguinal ligamente ve distal deri/subkutan flep inferolateral olarak dize yansıtın.
9. Alanı ortaya çıkarmak için bir tel retraktör veya haddelenmiş gazlı bez kullanın.
10. Farenin inguinal anatomisi insanlara benzer olduğunu gözlemleyin; lateral medial sinir yalan, arter, ve ven.
11. Femoral siniri parçalayın, inguinal ligamentde keskin bir şekilde bölün, mümkünse çatallanmanın proksimal.'ına. Bölünmüş sinirinferior geri, güvenli bir şekilde şekilde tutmak, nemli gazlı bez altında kaplı.
12. Femoral arter ve ven dikkat çevirerek, atravmatik yerine doğrudan onları işleme damarları geri 4 cm 7-0 ipek bağları kullanın.
13. Onlar 7-0 ipek bağları ile ortaya çıkan femoral damarların tüm dalları ligate; dalları bağlar arasında bölün. Çok küçük dallar için bağlar yerine bipolar kateter kullanılabilir.
    NOT: Bölünme gerektiren arteriyel ve venöz dallar arasında yüzeysel circumflex iliak ve kas damarları sayılabilir. Yüzeysel circumflex iliac genellikle en büyük ve insanlarda profunda femoral gibi derin dalış görünür, ama profunda sıçan yok¹⁵. En yüksek geniküler ve safenöz dal gibi femoral damarların daha distal dalları genellikle bölünme gerektirmez.
14. Sistematik bir erkek sıçan donör penis ven yoluyla heparin 500 uluslararası birimleri enjekte. Donör sıçan kadın ise yüzeysel epigastrik ven kullanın.
15. Sonraki adımlara geçmeden önce heparin in 2 dakika boyunca sistemli olarak dolaşmasına izin verin.
16. Mümkün olduğunca inguinal ligament proksimal olarak 7-0 ipek bağları ile femoral arter ligate ve bağlar arasında bölmek.
17. Arter benzer, ligate ve femoral ven bölmek.
18. Arter ve damar inferiora yansıtın, güvenli bir şekilde dışarı, femoral sinir ile birlikte nemli gazlı bez altında daha önce kaplı kaplı. Ventral kas gruplarını inceleyin, ortaya çıkan herhangi bir görünür damar cauterize dikkat. Burada hemostaz dikkat reperfüzyon sonrası alıcı kan kaybını en aza indirecektir.
19. Derin ventral kas grupları, tanımlamak ve keskin dalları için siyatik sinir proksimal bölmek. Üç siyatik dalları genellikle görülebilir: tibial, peroneal ve sural. Üçü de donör uzuvlarında korunmalıdır. Dördüncü kutanöz dal genellikle bu diseksiyon da görülmez^15,16.
20. Titiz hemostaz ile orta uyluk düzeyinde kalan ventral ve dorsal kas grupları bölen bitirmek. Bu kasları bölen tamamlamak için medily ekstremite geri çekmek için gerekli olabilir.
21. Femur kemiğini el tutamayan akülü döner testere kullanarak orta şaftta geçirin.
22. Donörden ekstremite grefti çıkarıldıktan sonra, greft tarafı femoral arter ve damar kütüklerinden ipek bağlı uçları keserek damarları yeniden açar.
23. Greft arter kütüğüne 24-gauge anjiyokateter yerleştirin ve grefti 5 mL buz gibi normal tuzlu suda seyreltilmiş 250 uluslararası heparin birimiyle temizleyin ve açık damardan dışarı akmasını izleyin.
24. Yavaşça, yavaşça yaklaşık 3 dakika boyunca greft floş. Aşırı güçlü yıkama endotel zarar verebilir.
25. Grefti, nakil yapılana kadar buz kovasında iç içe olan soğutulmuş tuzlu bir tabağa koyun.
26. Donör sıçanı bilateral torakotomi ile ötenazi.
27. Tüm cerrahi aletleri uygun şekilde temizleyin.

2. Alıcı yerli sağ arka ekstremite amputasyonu

1. %5 oranında isofluran ile anestezi, derinliği onaylamak, kürk kırpma, hayvan konumlandırma kıvrak ve donör sıçan için açıklandığı gibi alkol ile cildi dezenfekte.
2. Down-titrat isofluran %2-2.5 ve subkutan preoperatif preoperatif analjezi ile buprenorfin 1.2 mg/kg enjekte edilir ve preoperatif profilaksi ile enrofloksasin 7.5 mg/kg.
3. Donör için aynı, inguinal kreaz bir sünnet kesisi yapmak, hemostaz temin deri flepleri yansıtmak, ve femoral sinir dışarı incelemek, arter ve damar, yukarıdaki gibi aynı dal damarları ligating.
4. Femoral siniri donörden daha distal olarak bölün, ancak mümkünse çatallanmaya yakın.
5. Femoral arter ve ven her ayrı inguinal ligament düzeyinde kelepçe lemek için yeterli alan ile diseksiyon. Mikrocerrahi bulldog kelepçeler ile damar ve arter kelepçe. Bir kez kenetlenmiş, makas ile keskin bir şekilde her gemi bölün.
6. Titiz hemostaz ile uyluk orta uyluk düzeyinde ventral ve dorsal kasları bölmek, gerektiğinde medily ekstremite geri çekerek.
7. Yukarıdaki gibi kendi dal noktalarına proksimal siyatik sinirleri tanımlamak ve bölmek.
8. Testereyi kullanarak femuru orta şaftta geçirin.
9. Alıcının sağ arka ekstremitesini çıkarın ve uygun şekilde atın.
10. Burun konisi ile isoflurane%1-1.5'e kadar titrat.

3. Donörden alıcı ekstremite implantasyonuna

1. El testeresini kullanarak, hem donörhem de alıcı uyluk kesim uçlarından kaynaklanan düzensizlikleri önler.
2. Testere kullanarak, femur intramedüller çubuk olacak bir 18-gauge iğne, göbek ucu kesti.
3. Kemik manipüle etmeden önce, reaming işlemi sırasında ilik kanamasını azaltmak için femur kemiğinin alıcı kesim ucuna kemik balmumu küçük bir miktar uygulayın.
4. Bir intramedüller çubuk olarak 18-gauge iğne kullanarak donör ve alıcı femoral kemikleri Coapt. Bazı kuvvet gereklidir, ama şimdiye kadar korteks kırık olarak her iki kemik ream yok.
5. Gerektiği gibi, iğneyi çıkarın ve her iki kemiğin de kemik arasında iğne görünmeden iğnenin üzerine düzgün bir şekilde sığması için uygun bir uzunluğa doğru kırpın.
6. Gerginlikten uzak tutmak için donör ekstremitenin altına gazlı bez veya küçük bir kaya veya modelleme kil gibi küçük bir destek yerleştirin.
7. Greftin femur iğnesi etrafında dönmemesi için 8-10 basit kesilen 5-0 poliglactin dikişleri ile ventral kas gruplarını yeniden approximatea. Bu anastomozlar için ekstremite stabilitesi verir.
8. Daha iyi görüntüleme ve sıcak iskemik reperfüzyon yaralanmasını azaltmak için greft ve cerrahi alanı buz gibi tuzlu suile periyodik olarak sulandırın.
9. Donör ve alıcı femoral arterler hizalayın ve basit kesmeli 10-0 naylon dikiş kullanarak moda sonuna kadar onları anastomose, hem gerginlik ve döngü kaçınarak. Arter ortalama altı dikiş gerektirir.
10. Arter benzer, anastomoz donör ve alıcı femoral damarlar sonunda moda sonuna kadar. Damar altı ila sekiz dikiş gerektirir.
    NOT: Cömert soğuk tuzlu sulama, atravmatik damar işleme tekniği ve damar geri çekilmesi için dikiş olarak hizmet etmek için uzun kuyrukları bırakarak etkili mikrocerrahi anastomozlar için önemli araçlardır.
11. Her iki anastomoz etrafında hemostatik selüloz tozu küçük bir miktar yerleştirin ve sonra damar ve arter proksimal mikrocerrahi bulldog kelepçeler kaldırın.
12. İyi bir açıklık ve akış için her iki anastomoz inceleyin. Nazikçe damar prod ve her iki anastomoz iyi hemostaz sağlamak için pamuklu bez çubukları kullanın. Kanama bölgeleri üzerinde basınç tutun ve gerekirse daha fazla hemostatik selüloz tozu yerleştirin. Başka bir dikiş sadece son çare olarak iğne "arka duvar" riski bir kanama deliğinden yerleştirilebilir.
13. Her iki anastomoz tatmin edici doğrulandığında, kalan uzun süre kalan dikiş kuyruklarını diğerleriyle eşleşecek şekilde kısa kırpın.
14. Sol lateral dekübitus pozisyonuna sıçan repozisyon, herhangi bir reperfüzyon kas kanaması titiz hemostaz elde etmek için liberal elektrokoter kullanın.
15. Kas hemostazı güvence altına alındıktan sonra sinir anastomozlarına dikkat çek. Yırtık gibi görünen sinir kesik uçlarını geri alın.
16. Basit kesilen 5-0 poliglactin sütür ile siyatik sinir altında dorsal kas grupları reapproximate.
17. Siyatik siniri yeniden approximateat. 8-10 10-0 naylon nöral basit kesilmiş dikişler genellikle yeterli olacaktır.
18. Hatırlatan dorsal kas gruplarını yeniden approximatelayın ve sonra 4-0 poliglactin sürekli sütür ile dorsal deri kapatın.
19. Sıçanı supine pozisyonuna geri döndürün ve femoral siniri yeniden canlandırın. 2-3 10-0 naylon nöral basit kesilmiş dikişler genellikle yeterli olacaktır.
20. Ventral deriyi 4-0 poliglactin sürekli sütür le kapatın. Bir kez uyanık sıçan için rahatsız edici olabilir aşırı dikiş kuyruk, kaçının.

4. Ameliyat sonrası bakım

1. Kafesin altında bir ısıtma yastığı ve yiyecek ve suya hazır erişim ile kafeslerinde hayvanları kurtarmak, ilk hafta için her gün erken komplikasyonlar için izleme.
2. POD 2 ile post-operatif analjezi deri altı meloksikam 1 mg/kg günlük enjeksiyon ile sağlayın. Postoperatif antibiyotik profilaksisi seyreltik enrofloksasin sprey sağlayın. Bitter Safe Mist pod 7 ile greft günde iki kez püskürtülür ile ototomi (kendi kendine sakatlanma) için caydırıcı olun.
3. Nakledilen sıçanları diğer sıçanlarla birlikte kafeslerde muhafaza edin, günlük aktivitelere geri dönüşü teşvik edin ve nakledilen uzvun rehabilite edin.

5. Postoperatif duyum testi

1. Termal duyum protokolü Hargreaves test uygulayın, ayrıca başka bir yerde açıklanan^17,18.
2. Test kabına sıçan yerleştirin ve 20 dakika boyunca alışmak için izin verdi. Cihaz camı temiz ve ısı kaynağı nın müfettişin parmağıyla çalıştığı doğrulandı.
3. Testten önce, farenin uyanık olduğunu ve test edilen pençenin kızılötesi hareket dedektörü üzerine yerleştirdiğini doğrulayın.
4. Termal enerjiyi yoğunluk seviyesi 90'da iletin. Hayvanın pençesini ısı kaynağından uzaklaştırmasında zaman gecikmesi kaydedilir. 20 saniye içinde herhangi bir hareket oluşursa, yaralanmayı önlemek için test iptal edilir.
5. Her hayvan için ortalama çekilme gecikme süresini hesaplamadan önce en yüksek ve en düşük değer hariç olmak üzere, test edilen ekstremite başına beş deneme alın.

6. Ameliyat sonrası motor testi

1. Yürüyüş analizi koşu bandı ve entegre yazılım analiz platformu kullanarak, ameliyat sonrası dört ila altı hafta koşu bandı testi için adayları seçin.
2. Testetmeden bir veya iki gün önce tüm fare ayak tırnaklarını kesin.
3. Hayvanları test ten önce bir saat boyunca test odasına alıştırın ve anksiyeteyi yatıştırmak için bir dakikalık ön test petting'e izin verin.
4. Fareyi koşu bandının içine yerleştirerek, koşu bandını 10 cm/s'den 14 cm/s'ye, hedefe 18 cm/s'ye kadar artan hız denemelerinde çalıştırın. Sıçan suskun ve yürümeye ikna edilemez, negatif klima önlemek için o gün test iptal. Yüksek performanslı ların 24 cm/s'ye kadar yürümesine izin verin.
5. Test edilmiş hayvanlar arasında %70 etanol ile koşu bandı aparatını durula.
6. Yürüyüş parametreleri, analiz platformunun tescilli yazılımından elde edilen çıktılardır.

Sonuçlar

Sağkalım ve iyileşme titiz cerrahi tekniğe bağlıdır. Vasküler anastomozlara ve nöral anastomozlara dikkat edilmesi ve yukarıda açıklandığı gibi kemik uyumunun bu modelin başarısını en üst düzeye çıkarmak çok önemlidir. Operatif tasarım ve temsili anastomoz sonuçları Şekil 1'degösterilmiştir.

Genel mortalite immünsupresif stratejisine bağlı ydı ve izotransplante edilen hayvanların çoğunluğu Şekil 2'de

Tartışmalar

Limb transplantasyonu, vaskülarize komponent allotransplantasyonu (VCA) daha geniş bir kategori altında, henüz yerine getirilmemiş olarak yaygın olarak uygulanabilir terapötik söz vardır. Ana barikatlar vca ve nöromotor kurtarma teknikleri şu anda kullanılan benzersiz çözülmemiş immünolojik sorunlar yatıyor. Yeni tekniklerin geliştirilmesi esnek, sağlam ve tekrarlanabilir hayvan modelleme bağlıdır.

VCA'da her biri özel avantajlara sahip⁴hayvan mo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Vet Equip	911103
0.5cc syringe	Exel	26018
18-gauge needle	BD	305196
1cc syringe	BD	309659
22-gauge needle	BD	305156
24-gauge angiocatheter	Sur-Vet	SROX2419V
25-gauge needle	Exel	26403
3 cc syringe	BD	309657
5cc syringe	Exel	26230
Alcohol	Fisher Scientific	HC-600-1GAL
Anesthesia induction chamber	Vet Equip	941443
Anesthetic gas scavenger system	Vet Equip	931401
Bipolar electrocautery	Aura	26-500
Bitter Spray Mist	Henry Schein	5553
Bone wax	CP Medical	CPB31A
Breathing circuit	Vet Equip	921413
Buprenophine	Reckitt Benckiser	12496075705
Castro-Viejos needle drivers	Roboz	RS-6416
Cordless rotary saw	Dremel	8050-N/18
Cotton swab stick	Fisher Scientific	23-400-101	For hemostasis
DigiGait Appparatus and Software	Mouse Specifics	MSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4)	Roboz	RS-4972
Dumont forceps (#5)	Roboz	RS-5035
Enrofloxacin	Norbrook	ANADA 200-495
FK-506	Astellas	301601
Gauze	Kendall	1903
Gauze	Covidien	8044
Gloves	Microflex	DGP-350-M
Hair clippers	Oster	078005-010-003
Handheld monopolar electrocautery	Bovie	AA00
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy	37370
Heating pad	Walgreens	126987
Heparin	Fresenius Kabi	42592K
Hot plate	Corning	PC-351	For warming resusscitation fluid
Isoflurane	Henry Schein	29405
Lactated ringers	Baxter	2B2074
Large petri dish	Fisher Scientific	FB0875713	For donor graft while in chilled saline
Meloxicam	Henry Schein	49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841
Microfibrillar collagen powder	BD	1010590	For hemostasis
Microvascular clips	Roboz	RS-5420
Normal saline	Baxter	2F7124
Opthalmic lube	Dechra	IS4398
Rapmycin	MedChem Express	HY-10219
Small petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	For warmed resusscitation fluid
Sterile drapes	ProAdvantage	N207100
Surgical gown	Cardinal Health	9511
Surgical mask	3M	1805
Surgical microscope, optic model OPMIMD	Zeiss	169756
Surgical microscope, Universal S3	Zeiss	243188
Suture 10-0 nylon	Covidien	N2512
Suture 5-0 vicryl	Ethicon	J213H
Suture 7-0 silk tie	Teleflex	103-S
Tape	3M	1530-1
Ultrasonic instrument cleaner	Roboz	RS-9911
Vessel dilation forceps	Roboz	RS-5047