Fare il passo successivo: un modello di trapianto di arto hind di coaptation neurale per massimizzare il recupero funzionale nel ratto

Riepilogo

Questo protocollo presenta un modello robusto e riproducibile di allotransplant composito vascolarizzato (VCA) orientato allo studio simultaneo dell'immunologia e del recupero funzionale. Il tempo investito in una tecnica meticolosa in un trapianto ortotopico dell'arto posteriore della coscia destra con anastomose vascolari cucite a mano e coaptation neurale produce la capacità di studiare il recupero funzionale.

Abstract

Il trapianto di arti in particolare e l'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) in generale hanno un'ampia promessa terapeutica che sono state ostacolate dalle attuali limitazioni dell'immunosoppressione e del recupero funzionale del neuromotore. Molti modelli animali sono stati sviluppati per studiare caratteristiche uniche della VCA, ma qui presentiamo un robusto modello riproducibile di trapianto ortotopico degli arti posteriori nei ratti progettati per studiare simultaneamente entrambi gli aspetti dell'attuale limitazione VCA: strategie di immunosoppressione e recupero neuromotore funzionale. Al centro del modello riposa un impegno per meticolose tecniche microchirurgiche testate nel tempo come anastomose vascolari cucite a mano e coaptation neurale cucite a mano del nervo femorale e del nervo sciatico. Questo approccio produce ricostruzioni durevoli degli arti che consentono animali più longevi in grado di riabilitazione, ripresa delle attività quotidiane e test funzionali. Con il trattamento a breve termine di agenti immunosoppressivi convenzionali, gli animali allotrapiantati sono sopravvissuti fino a 70 giorni dopo il trapianto e gli animali isotrapiantati forniscono controlli di lunga durata oltre i 200 giorni post-operatori. La prova del recupero funzionale neurologico è presente entro 30 giorni dopo l'intervento operativo. Questo modello non solo fornisce una piattaforma utile per interrogare questioni immunologiche uniche per la VCA e la rigenerazione dei nervi, ma consente anche di testare in vivo nuove strategie terapeutiche specificamente su misura per VCA.

Introduzione

Il trapianto di arti nell'ambito della più ampia categoria di allotransplant vasculare-composito (VCA) o allotransplant di tessuto composito (CTA) deve ancora soddisfare la sua promessa terapeutica. Dopo i primi trapianti di mano umana di successo a Lione, Francia e Louisville, Kentucky nel 1998 e 1999, oltre 100 trapianti di estremità superiore sono stati eseguiti in tutto il mondo in pazienti^{accuratamente selezionati 1}. L'applicabilità più ampia è stata ostacolata da una sostanziale immunosoppressione e da un limitato recupero di neuromotori funzionali. Le attuali strategie di immunosoppressione si traspongono all'85% di incidenza di rigetto acuto a fronte di un'incidenza del 77% dell'infezione^{opportunistica 2}. D'altra parte, si verifica il recupero funzionale dopo il trapianto di mano; Media Disabilità di spalla e mano (DASH) punteggi migliorano da 71 a 43, ma quel livello di funzione può ancora qualificarsi come una disabilità². Data la natura non salvavita del trapianto di arti, le attuali tecniche devono essere perfezionate nei modelli animali per fare il passo successivo in VCA.

Dal primo modello di ratto del trapianto di arti nel 1978^3,sono stati sviluppati molti modelli animali innovativi per far progredire il campo di VCA⁴, incorporando anastomose con manette vascolari per ridurre al minimo il tempo^{operativo 5,6}, ha trapianti osteomiocutanei per ridurre al minimo l'insulto fisiologico all'animale ricevente^7,8,9,10,11e nuovi approcci immunologici^7,12,13,14. Il modello ratto del trapianto di arto posteriore destro ortotopico qui presentato qui sottolinea tecniche microchirurgiche meticolose e collaudate nel tempo come gli anastomi vascolari cuciti a mano e la coaptation neurale come investimento iniziale in una piattaforma modello robusta e riproducibile per studiare simultaneamente entrambi gli aspetti dell'attuale limitazione VCA: strategie di immunosoppressione e recupero neuromotore funzionale.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dei National Institutes of Health (NIH) e sono stati approvati dal Northwestern University Animal Care and Use Committee. Le procedure specifiche sono state eseguite con il protocollo IS00001663.

NOTA: Sono stati utilizzati due ceppi di ratti, i ratti Lewis e i ratti August Copenhagen x Irish (ACI). Gli animali sono stati divisi in tre gruppi di trattamento: allotransplant senza soppressione immunitaria (ACI a Lewis), allotransplant con soppressione immunitaria convenzionale (ACI a Lewis), e isotransplant (da Lewis a Lewis o da ACI ad ACI). Lewis è un ceppo inbred, mentre i ratti ACI rappresentano un tipo selvaggio out-bred, quindi questa combinazione è stata scelta per modellare la risposta di rifiuto peggiore. L'immunosoppressione convenzionale è stata somministrata sottocutaneamente come rapacina 1 mg/kg dal giorno post-operatorio (POD) meno 1 al POD 28 o come FK506 3 mg/kg dal POD 0 al POD 14, e poi una volta ogni settimana in seguito. Sia i ratti maschi che femmine erano beneficiari idonei da 8 a 16 settimane di età, del peso compreso tra 250 e 400 grammi al momento dell'intervento chirurgico.

1. Raccolta degli arti posteriori posteriori destro del donatore

1. Indurre l'anestesia generale con 5% isoflurane in ossigeno puro attraverso un vaporizzatore con un adeguato sistema di scavenging.
2. Confermare un'adeguata profondità di anestesia con pizzico di dita dei piedi, quindi utilizzare tagliacapo per tagliare la pelliccia fuori dell'arto posteriore destro e del sito chirurgico all'inguine destro
3. Down-titrate l'isoflurane attraverso un cono naso roditore al 2-2,5%.
4. Posizionare il ratto supina con gli arti spalmati spinati ai lati su una scheda operativa con un pad di riscaldamento sotto. Disinfettare la pelle senza peli con il 70% di sfregamento dell'alcol e proteggere il campo chirurgico con garza sterile.
5. Utilizzando un microscopio microchirurgico appropriato, strumenti microchirurgici, e con un facile accesso all'elettrocauterino bipolare e monopolare, iniziare la dissezione.
6. Utilizzare le forbici per fare un'incisione circonferente della pelle / tessuto sottocutaneo intorno all'hindlimb destro. Iniziare nella piega inguinale medialmente allo stesso livello del legamento inguinale ed estendere dorsal-lateralmente per completare l'incisione circonferente.
7. Avendo esposto lo strato muscolare direttamente sotto l'incisione, sezionare e cauterizzare i vasi epigastrici superficiali che conducono dallo strato muscolare alla pelle prossimale / lembo sottocutaneo appena creato.
8. Riflettere il lembo prossimale superomedialmente al legamento inguinale e la pelle distale / lembo sottocutaneo inferolateramente al ginocchio.
9. Utilizzare un retrattore di filo o una garza laminata per esporre il campo.
10. Osservare che l'anatomia inguinale del ratto è simile agli esseri umani; dal laterale al mediale si trovano il nervo, l'arteria e la vena.
11. Dizionare il nervo femorale, dividerlo bruscamente al legamento inguinale, prossima alla biforcazione, se possibile. Ritrarre il nervo diviso in modo inferiore, tenendolo al sicuro fuori strada, coperto sotto garza umida.
12. Rivolgendo l'attenzione all'arteria femorale e alla vena, utilizzare le cravatte di seta 4 cm 7-0 per ritrarre atraumaticamente i vasi invece di maneggiarli direttamente.
13. Ligate tutti i rami dei vasi femorali come si presentano con 7-0 cravatte di seta; dividere i rami tra i legami. Per rami molto piccoli, cautery bipolare può essere utilizzato al posto di cravatte.
    NOTA: I rami arterioso e venoso che richiedono la divisione includono il iliaco circonflesso superficiale e i vasi muscolari. Il iliaco circonflesso superficiale è di solito più grande e sembra immergersi in profondità come farebbe il profunda femorale negli esseri umani, ma la profunda è assente nel^{ratto 15}. Più rami distali dei vasi femorali come il più alto genicolare e il ramo saphenous di solito non richiedono divisione.
14. Iniettare sistemicamente 500 unità internazionali di epatina attraverso la vena del pene in un donatore di ratti maschi. Utilizzare la vena epigastrica superficiale se il ratto donatore è femmina.
15. Lasciare che l'epaina circondi sistemicamente per 2 minuti prima di procedere con i passaggi successivi.
16. Ligate l'arteria femorale con 7-0 cravatte di seta il più prossimale possibile al legamento inguinale e dividere tra le cravatte.
17. Simile all'arteria, ligate e dividere la vena femorale.
18. Riflettere sia l'arteria che la vena in modo inferiore, in modo sicuro fuori strada, coperto sotto una garza umida insieme al nervo femorale coperto in precedenza. Dissezionare i gruppi muscolari ventrali, facendo attenzione a cauterizzare qualsiasi vaso visibile che sorge. Attenzione all'emostasi qui ridurrà al minimo la perdita di sangue del destinatario dopo la reperfusione.
19. Profondo ai gruppi muscolari ventrali, identificare e dividere bruscamente il nervo sciatico prossimale ai suoi rami. Tre rami sciatici sono solitamente visibili: tibiale, peroneale e sural. Tutti e tre dovrebbero essere tutti conservati nell'arto del donatore. Un quarto ramo cutaneo non è in genere visto in questa dissezione^15,16.
20. Finisci di dividere i restanti gruppi muscolari ventrali e dorsali a livello di coscia media con emostasi meticolosa. Potrebbe essere necessario ritrarre l'arto medialmente per completare la divisione dei muscoli.
21. Transect l'osso femore a metà albero utilizzando una sega rotante cordless portatile.
22. Dopo aver rimosso l'innesto dell'arto dal donatore, tagliare le estremità legate alla seta dall'arteria femorale laterale dell'innesto e dai ceppi di vena, riasendo così i vasi.
23. Inserire un angiocatetro a 24 calibro nel moncone dell'arteria dell'innesto e lavare l'innesto con 250 unità internazionali di epatina diluita in 5 mL di salina normale ghiacciata, guardandola fluire attraverso la vena aperta.
24. Lentamente, lavare delicatamente l'innesto per circa 3 minuti. L'eccesso di lavaggio forte può danneggiare l'endotelio.
25. Mettere l'innesto in un piatto salino refrigerato nidificato in un secchio di ghiaccio fino al trapianto.
26. Eutanasia del ratto donatore con toractomia bilaterale.
27. Pulire tutti gli strumenti chirurgici in modo appropriato.

2. Amputazione dell'arto posteriore destro nativo del destinatario

1. Indurre l'anestesia con isoflurane al 5%, confermare la profondità, tagliare la pelliccia, posizionare l'animale e disinfettare la pelle con l'alcol come descritto per il ratto donatore.
2. Isoflurane down-titrate al 2-2,5% e iniettare analgesia preoperatoria sottocutanea con buprenorfina 1,2 mg/kg e profilassi preoperatoria con enrofloxacina 7,5 mg/kg.
3. Come per il donatore, fare un'incisione circonferale nella piega inguinale, riflettere i lembi della pelle assicurando l'emostasi e sezionare il nervo femorale, l'arteria e la vena, legando gli stessi vasi di ramo come sopra.
4. Dividere il nervo femorale più distally che per il donatore, ma proximally alla biforcazione, se possibile.
5. Dissezionare l'arteria femorale e la vena con spazio sufficiente per bloccare ciascuno separatamente a livello del legamento inguinale. Bloccare la vena e l'arteria con morsetti bulldog microchirurgici. Una volta bloccato, dividere ogni recipiente bruscamente con le forbici.
6. Dividere i muscoli ventrale e dorsali della coscia a livello di metà coscia con emostasi meticolosa, ritraendo l'arto medialmente secondo le esigenze.
7. Identificare e dividere i nervi sciatici prossimali ai loro punti di diramazione come sopra.
8. Transect il femore a metà albero utilizzando la sega.
9. Rimuovere l'arto posteriore destro nativo del destinatario e smaltire in modo appropriato.
10. Down-titrate l'isoflurane a 1-1,5% attraverso il cono naso.

3. Impianto dell'arto da donatore a ricevente

1. Utilizzando la sega elettrica portatile, radere via eventuali irregolarità sia dal donatore che dal femore ricevente.
2. Utilizzando la sega, tagliare l'estremità del mozzo di un ago a 18 calibro, che diventerà l'asta intramedullaria del femore.
3. Prima di manipolare l'osso, applicare una piccola quantità di cera ossea all'estremità del femore per ridurre il sanguinamento del midollo durante il processo di reaming.
4. Coapt le ossa femorali del donatore e del ricevente usando l'ago a 18 calibro come canna intramedullaria. Una certa forza è necessaria, ma non risme o ossa fino a fratturare la corteccia.
5. Se necessario, rimuovere l'ago e tagliarlo ad una lunghezza appropriata in modo che entrambe le ossa si adattino senza problemi sopra l'ago senza ago che mostra tra l'osso.
6. Posizionare un piccolo supporto come un cuscinetto di garza o una piccola roccia o modellare l'argilla sotto l'arto del donatore per tenerlo lontano dalla tensione.
7. Reapproximate i gruppi muscolari ventrali con otto a dieci semplici suture di poliglactina interrotte 5-0 in modo che l'innesto non ruoti intorno all'ago del femore. Questo dà la stabilità dell'arto per gli anastomoses.
8. Irrigare periodicamente l'innesto e il campo chirurgico con salina ghiacciata per una migliore visualizzazione e per ridurre le lesioni da reperfusione ischemica calda.
9. Allineare le arterie femorali del donatore e del ricevente e anastomose in modo end-to-end utilizzando una semplice sutura di nylon interrotta 10-0, evitando sia la tensione che il looping. L'arteria richiede una media di sei suture.
10. Simile all'arteria, anastomose il donatore e le vene femorali riceventi in modo end-to-end. La vena richiede da sei a otto suture.
    NOTA: La generosa irrigazione salina fredda, la tecnica di movimentazione delle navi atraumatiche e la data di lunga durata per servire come suture di soggiorno per la retrazione della nave sono strumenti importanti per anastomose microchirurgiche efficaci.
11. Mettere una piccola quantità di polvere di cellulosa emostatica intorno a entrambi gli anastomosi, quindi rimuovere i morsetti bulldog microchirurgici prossimali sulla vena e l'arteria.
12. Ispezionare entrambi gli anastomosi per una buona paenza e flusso. Utilizzare bastoncini di cotone per spingere delicatamente la vena e assicurare una buona emostasi di entrambi gli anastomi. Tenere pressione sui siti di sanguinamento e posizionare più polvere di cellulosa emostatica se necessario. Un'altra sutura può essere posizionata attraverso un foro di sanguinamento a rischio di "back-walling" l'ago solo come ultima risorsa.
13. Quando entrambi gli anastomos sono confermati in modo soddisfacente, tagliare tutte le code di sutura di soggiorno lungo rimanenti per abbinare le altre.
14. Riposizionare il ratto nella posizione di decubito laterale sinistro, utilizzare l'elettrocautery liberale per raggiungere l'emostasi meticolosa di qualsiasi sanguinamento muscolare di reperfusione.
15. Rivolgere l'attenzione agli anastomosi nervosi una volta che l'emostasi muscolare è assicurata. Tagliare indietro tutte le estremità di taglio del nervo che appaiono cencioso.
16. Reapproximate i gruppi muscolari dorsali sotto nervo sciatico con semplici suture poliglactin interrotte 5-0.
17. Reapproximate il nervo sciatico. Otto a dieci 10-0 nylon neurale semplici suture interrotte di solito sarà sufficiente.
18. Riapprequiare i gruppi muscolari dorsali e quindi chiudere la pelle dorsale con 4-0 poliglactin sutura continua.
19. Riposizionare il ratto in posizione supina e riavvicinare il nervo femorale. Due o tre 10-0 nylon neurale semplici suture interrotte di solito sarà sufficiente.
20. Chiudere la pelle ventrale con 4-0 poliglactin sutura continua. Evitare la coda di sutura in eccesso, che può essere irritante per il ratto una volta sveglio.

4. Assistenza post-operatoria

1. Recuperare gli animali nelle loro gabbie con una pastiglie di riscaldamento sotto la gabbia e pronto l'accesso al cibo e all'acqua, monitorando le prime complicazioni ogni giorno per la prima settimana.
2. Fornire analgesia post-operatoria con iniezione giornaliera di meloxicam sottocutanea 1 mg/kg attraverso POD 2. Fornire la profilassi antibiotica post-operatoria diluire spray enrofloxacin. Fornire disincentivo per l'autotomia (automutilazione) con Bitter Safe Mist spruzzato due volte al giorno per l'innesto attraverso POD 7.
3. Mantenere i ratti trapiantati in gabbie con altri ratti, per stimolare il ritorno alle attività quotidiane e riabilitare l'arto trapiantato.

5. Test di sensazione post-operatoria

1. Applicare il test Hargreaves del protocollo di sensazione termica, descritto anche altrove^17,18.
2. Mettere il ratto nel contenitore di prova e permetterlo di acclimatarsi per 20 minuti. Il vetro dell'apparato è confermato pulito, e la fonte di calore ha confermato di lavorare con il dito dell'investigatore.
3. Prima del test, verificare che il ratto sia sveglio e che la zampa testata sia posizionata sopra il rilevatore di movimento infrarosso.
4. Trasmettere energia termica al livello di intensità 90. Viene registrato un ritardo di tempo nell'animale che sposta la zampa lontano dalla fonte di calore. Se non si verifica alcun movimento entro 20 secondi, il test viene interrotto per evitare lesioni.
5. Ottenere cinque prove per ogni arto testato, escludendo il valore più alto e più basso prima di calcolare il tempo medio di latenza di ritiro per ogni animale.

6. Test del motore post-operatorio

1. Utilizzando un tapis roulant per l'analisi dell'andatura e una piattaforma di analisi software integrata, selezionare i candidati per il test del tapis roulant a quattro o sei settimane dopo la chirurgia.
2. Tagliare tutte le unghie dei topi uno o due giorni prima del test.
3. Acclimatare gli animali nella sala prove per un'ora prima del test e consentire un minuto di pre-test petting per calmare l'ansia.
4. Posizionando il topo all'interno del tapis roulant, eseguire il tapis roulant a prova di velocità crescente, da 10 cm/ s, a 14 cm/s, fino all'obiettivo 18 cm/s. Se il ratto è reticente e non può essere persuo a camminare, interrompere il test quel giorno per evitare il condizionamento negativo. Consentire agli esecutori alti di camminare fino a 24 cm/s.
5. Sciacquare l'apparato del tapis roulant con il 70% di etanolo tra gli animali testati.
6. I parametri di andatura sono e-out dal software proprietario della piattaforma di analisi.

Risultati

La sopravvivenza e il recupero dipendono da una tecnica chirurgica meticolosa. L'attenzione agli anastomosi vascolari e agli anastomosi neurali, così come la coaptation ossea come descritto sopra è fondamentale massimizzare il successo di questo modello. Nella Figura 1 sono illustrati i risultati di progettazione operativa e di analisi rappresentativa.

La mortalità complessiva dipendeva dalla strategia di immunosoppressione, con la maggior parte degli animali i...

Discussione

Il trapianto di arti, nella categoria più ampia di allotrapianto di componenti vascolarizzati (VCA), ha una promessa terapeutica ampiamente applicabile non ancora mantenuta. I principali ostacoli si trovano in questioni immunologiche irrisolte uniche per VCA e tecniche di recupero neuromotorio attualmente utilizzate. Lo sviluppo di nuove tecniche dipenderà dalla modellazione animale flessibile, robusta e riproducibile.

Molti modelli animali sono stati stabiliti in VCA, ciascuno con vantaggi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Vet Equip	911103
0.5cc syringe	Exel	26018
18-gauge needle	BD	305196
1cc syringe	BD	309659
22-gauge needle	BD	305156
24-gauge angiocatheter	Sur-Vet	SROX2419V
25-gauge needle	Exel	26403
3 cc syringe	BD	309657
5cc syringe	Exel	26230
Alcohol	Fisher Scientific	HC-600-1GAL
Anesthesia induction chamber	Vet Equip	941443
Anesthetic gas scavenger system	Vet Equip	931401
Bipolar electrocautery	Aura	26-500
Bitter Spray Mist	Henry Schein	5553
Bone wax	CP Medical	CPB31A
Breathing circuit	Vet Equip	921413
Buprenophine	Reckitt Benckiser	12496075705
Castro-Viejos needle drivers	Roboz	RS-6416
Cordless rotary saw	Dremel	8050-N/18
Cotton swab stick	Fisher Scientific	23-400-101	For hemostasis
DigiGait Appparatus and Software	Mouse Specifics	MSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4)	Roboz	RS-4972
Dumont forceps (#5)	Roboz	RS-5035
Enrofloxacin	Norbrook	ANADA 200-495
FK-506	Astellas	301601
Gauze	Kendall	1903
Gauze	Covidien	8044
Gloves	Microflex	DGP-350-M
Hair clippers	Oster	078005-010-003
Handheld monopolar electrocautery	Bovie	AA00
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy	37370
Heating pad	Walgreens	126987
Heparin	Fresenius Kabi	42592K
Hot plate	Corning	PC-351	For warming resusscitation fluid
Isoflurane	Henry Schein	29405
Lactated ringers	Baxter	2B2074
Large petri dish	Fisher Scientific	FB0875713	For donor graft while in chilled saline
Meloxicam	Henry Schein	49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841
Microfibrillar collagen powder	BD	1010590	For hemostasis
Microvascular clips	Roboz	RS-5420
Normal saline	Baxter	2F7124
Opthalmic lube	Dechra	IS4398
Rapmycin	MedChem Express	HY-10219
Small petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	For warmed resusscitation fluid
Sterile drapes	ProAdvantage	N207100
Surgical gown	Cardinal Health	9511
Surgical mask	3M	1805
Surgical microscope, optic model OPMIMD	Zeiss	169756
Surgical microscope, Universal S3	Zeiss	243188
Suture 10-0 nylon	Covidien	N2512
Suture 5-0 vicryl	Ethicon	J213H
Suture 7-0 silk tie	Teleflex	103-S
Tape	3M	1530-1
Ultrasonic instrument cleaner	Roboz	RS-9911
Vessel dilation forceps	Roboz	RS-5047