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요약

이 프로토콜은 면역학 및 기능 적 회복의 동시 연구를 향해 기어드 혈관 복합 동종 이식 (VCA)의 견고하고 재현 가능한 모델을 제시한다. 손 바느질 혈관 아나토모와 신경 응착오른쪽 중간 허벅지 뒷다리 직교 이식에 세심한 기술에 투자 된 시간은 기능적 회복을 연구 할 수있는 능력을 산출한다.

초록

사지 이식은 특히 혈관화 복합 동종 이식 (VCA)은 일반적으로 면역 억제 및 기능성 신경 운동 회복의 현재 한계에 의해 좌절 된 광범위한 치료 약속을 가지고 있습니다. 많은 동물 모델은 VCA의 독특한 특징을 연구하기 위해 개발되었지만, 여기에서 우리는 현재 VCA 제한의 두 측면을 동시에 조사하기 위해 설계된 쥐에서 직교 뒷다리 이식의 강력한 재현 가능한 모델을 제시합니다: 면역 억제 전략 및 기능성 신경 운동 회복. 모델의 핵심은 손 바느질 혈관 해부학과 대퇴 신경과 상골 신경의 신경 응착과 같은 세심한, 시간 테스트 미세 수술 기술에 대한 헌신을 달려있다. 이 접근법은 재활, 일상 활동 재개 및 기능 적 테스트를 할 수있는 더 오래 살아있는 동물을 허용하는 튼튼한 사지 재건을 제공합니다. 종래의 면역억제제의 단기 치료로, 이식후 70일까지 생존한 동종동물은 수술 후 200일을 초과하는 장기간의 대조군을 제공한다. 신경 기능 회복의 증거는 수술 후 30 일 동안 존재합니다. 이 모델은 VCA 및 신경 재생에 고유한 면역 학적 질문을 심문하는 데 유용한 플랫폼을 제공 할뿐만 아니라 VCA에 맞게 특별히 조정 된 새로운 치료 전략의 생체 테스트를 허용합니다.

서문

혈관 복합 동종 이식 (VCA) 또는 복합 조직 동종 이식 (CTA)의 광범위한 범주에 따라 사지 이식은 아직 치료 약속을 이행하지 못했습니다. 1998년과 1999년 켄터키 주 리옹에서 처음으로 성공한 인간 손 이식 이후, 100개 이상의 상사 이식이 엄선된 환자1에서전 세계적으로 수행되었다. 실질적인 면역 억제와 제한된 기능성 신경 운동 회복에 의해 더 넓은 적용성이 좌절되었습니다. 현재 면역억제 전략은기회감염2의77%의 발생률에 직면하여 급성 거부의 85% 발생률을 초래한다. 한편, 손 이식 후 기능적 회복이 발생한다. 암 어깨와 손 (DASH) 점수의 장애는 71에서 43로 향상되지만, 그 기능 수준은 여전히 장애2로자격이 될 수 있습니다. 사지 이식의 비생명 절약 특성을 감안할 때, 현재 기술은 VCA에서 다음 단계를 취할 동물 모델에서 정제해야합니다.

1978년3년사지 이식의 첫 번째 쥐 모델 이후, 많은 혁신적인 동물 모델이 VCA4의분야를 발전시키기 위해 개발되었으며, 수술 시간을 최소화하기 위해 혈관 커프드,아나도모를 통합하여 수술 시간7,,,5,,6,이성토성 골분비쿠타네이스 이식을 통해 수령인 동물,7,8,9, 10, 11, 및 신규 면역학적 접근법 7,8,9,10,,11,및 신규 면역 접근법 14,121.14 여기에 제시된 직교 우측 뒷다리 중간 허벅지 이식의 쥐 모델은 현재 VCA 제한의 양측면을 동시에 조사하기 위해 강력하고 재현 가능한 모델 플랫폼에 대한 선행 투자로서 손 수놓은 혈관 아나스토모모 및 신경 응식과 같은 세심하고 시간 테스트된 미세 수술 기술을 강조합니다: 면역 억제 전략 및 기능성 신경 운동 회복.

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프로토콜

모든 실험은 국립 보건원 (NIH)의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 노스 웨스턴 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 특정 절차는 프로토콜 IS00001663에 따라 수행되었습니다.

참고 : 쥐의 두 변종을 사용되었다, 루이스 쥐와 8 월 코펜하겐 x 아일랜드어 (ACI) 쥐. 동물은 면역 억제 없이 동종 이식 (루이스에 ACI), 기존의 면역 억제 (루이스에 ACI), 동소 이식 (루이스 루이스 또는 ACI에 ACI)를 결합하는 세 가지 치료 그룹으로 나뉘었다. 루이스는 근친 근친 변형, ACI 쥐 는 아웃 사육 야생 형을 나타내는 동안, 따라서이 조합은 더 나쁜 경우 거부 응답을 모델링하도록 선택되었다. 종래의 면역억제는 수술 후 날(POD)에서 1~POD 28을 뺀 라파마이신 1 mg/kg또는 POD 0에서 POD 14까지 3 mg/kg으로 피하 투여한 후, 그 후 매주 한 번 투여하였다. 남성과 여성 쥐 모두 8 주에서 16 주 까지 자격을 갖춘 수령인이었다, 사이 무게 250 과 400 수술 의 시간에 그램.

1. 기증자 오른쪽 뒷다리 수확

  1. 적절한 청소 시스템을 가진 기화기를 통해 순수한 산소로 5% 이소플루란으로 전신 마취를 유도합니다.
  2. 발가락 핀치로 마취의 적절한 깊이를 확인한 다음 헤어 클리퍼를 사용하여 오른쪽 뒷다리와 오른쪽 사타구니 수술 부위의 털을 다듬습니다.
  3. 설치류 코 콘을 통해 이소플루란을 2-2.5%로 하향 돌이세요.
  4. 쥐 의 척추를 스프레드 팔다리가 아래 가열 패드가있는 작동 보드에 측면에 테이프로 놓습니다. 무모 피부를 70%로 소독하고 멸균 거즈로 수술장을 보호합니다.
  5. 적절한 미세 수술 현미경, 미세 수술 기구를 사용하여 양극성 및 단일 극성 전기 코터리에 쉽게 접근 할 수 있으며 해부를 시작합니다.
  6. 가위를 사용하여 오른쪽 뒷다리 주위에 할례 피부 / 피하 조직 절개를하십시오. 인구인인대와 거의 같은 수준에서 내측으로 인구주름에서 시작하여 둘레 절개를 완료하기 위해 뒤-측면으로 확장합니다.
  7. 절개 바로 아래에 근육 층을 노출한 후 근육층에서 근위가 있는 피부/피하 플랩으로 이어지는 피상적 상복부 혈관을 해부하고 소생시합니다.
  8. 근접 플랩을 인기구 인대와 말단 피부/피하 플랩에 겹침방식으로 무릎에 반영합니다.
  9. 와이어 리트랙터 또는 압연 거즈를 사용하여 필드를 노출하십시오.
  10. 쥐의 식증 해부학은 인간과 유사하다는 것을 관찰하십시오. 측면에서 내측으로 신경, 동맥 및 정맥이 놓여 있습니다.
  11. 대퇴 신경을 해부, 잉게인 인대에 급격하게 분할, 가능하면 양분에 근위. 분열된 신경을 열등하게 철회하고, 촉촉한 거즈 아래에 덮여 있어 안전하게 방해하지 않습니다.
  12. 대퇴동맥과 정맥에 주의를 돌리면 4cm 7-0 실크 넥타이를 사용하여 직접 처리하는 대신 혈관을 외상적으로 철회하십시오.
  13. 대퇴함의 모든 가지를 7-0 실크 넥타이로 장식합니다. 나뭇가지를 관계 간에 분할합니다. 매우 작은 가지의 경우 양극성 소우가 관계 대신 사용할 수 있습니다.
    참고: 분단이 필요한 동맥 및 정맥 가지에는 피상적인 일류와 근육 혈관이 포함됩니다. 피상적 인 circumflex 상색은 일반적으로 가장 크고 인간에서 profunda 대퇴와 마찬가지로 깊은 다이빙을 하는 것처럼 보이지만, profunda는 쥐15에없습니다. 가장 높은 비낭 및 사페누스 가지와 같은 대퇴 혈관의 더 많은 단지부는 일반적으로 분열을 필요로하지 않습니다.
  14. 체계적으로 남성 쥐 기증자의 음경 정맥을 통해 헤파린의 500 국제 단위를 주입. 기증자 쥐가 여성인 경우 피상상 위 정맥을 사용합니다.
  15. 헤파린이 다음 단계를 진행하기 전에 2 분 동안 체계적으로 순환하도록 허용하십시오.
  16. 대퇴동맥을 7-0 실크 타이로 가능한 한 인대와 근간으로 묶고 동점을 나눕니다.
  17. 동맥과 유사하게 대퇴 정맥을 리게이트하고 나눕니다.
  18. 동맥과 정맥을 열등하게 반영하고, 안전하게 길에서 벗어나, 습한 거즈 아래에 덮여 있으며, 이전에 덮은 대퇴신경과 함께 덮입니다. 복부 근육 그룹을 해부, 발생하는 모든 눈에 보이는 혈관을 소생주의 복용. 여기서 혈청에 주의하면 재관류 후 의자 혈액 손실을 최소화할 수 있습니다.
  19. 복부 근육 그룹에 깊은, 식별 하 고 날카롭게 그것의 가지에 상시 신경 근위를 분할. 세 가지는 일반적으로 볼 수 있습니다: 경정, 간형 및 sural. 세 가지 모두 기증자 사지에 보존되어야 합니다. 네 번째 분리 분기는 일반적으로 이 해부15,,16에서볼 수 없습니다.
  20. 세심한 hemostasis와 중간 허벅지 수준에서 나머지 복부와 등쪽 근육 그룹을 분할 완료. 근육을 나누는 것을 완료하기 위해 사지를 내측으로 철회할 필요가 있을 수 있습니다.
  21. 핸드 헬드 무선 회전 톱을 사용하여 중간 샤프트에서 대퇴골 뼈를 횡단합니다.
  22. 기증자에게서 사지 이식편을 제거한 후, 접목측 대퇴동맥과 정맥 그루터기에서 실크 묶인 끝을 잘라내어 혈관을 다시 열게 한다.
  23. 24게이지 협막이를 이식 동맥 그루터기에 삽입하고 얼음처럼 차가운 정상 식염수의 5mL에 희석된 250개의 국제 유닛으로 이식편을 플러시하여 열린 정맥을 통해 맑게 흘러나오는 것을 관찰합니다.
  24. 천천히, 약 3 분 동안 부드럽게 접목을 플러시. 과도한 강력한 플러싱은 내피를 손상시킬 수 있습니다.
  25. 이식이 이식될 때까지 얼음 양동이에 중첩된 차가운 식염수 접시에 접목을 놓습니다.
  26. 양자 투라코토미로 기증자 쥐를 안락사시.
  27. 모든 수술 기구를 적절히 청소하십시오.

2. 받는 사람 네이티브 오른쪽 뒷다리 절단

  1. 5%에서 이소플루란으로 마취를 유도하고, 깊이를 확인하고, 모피를 손질하고, 동물을 배치하고, 기증자 쥐에 대해 설명한 대로 알코올로 피부를 소독한다.
  2. 다운-titrate isoflurane 에 2-2.5% 부프레노르핀 1.2 mg/kg피하 전 수술 전 진통제를 주입 하 고, 내형 전 예방 에 로플로록사신 7.5 mg/kg.
  3. 기증자와 마찬가지로, 잉게인 주름에 할례 절개를하고, 피부 플랩을 반사하여 헤모도신경, 동맥 및 정맥을 해부하고, 위와 같은 가지 혈관을 계회합니다.
  4. 대퇴골 신경을 기증자보다 더 disismore하게 나누지만 가능하면 분기에 근접적으로 나눕니다.
  5. 대퇴동맥과 정맥을 독대 인대 의 수준에서 각각 별도로 고정하기에 충분한 공간을 해부하십시오. 미세 수술 불독 클램프와 정맥과 동맥을 고정합니다. 일단 고정되면 각 선박을 가위로 날카롭게 나눕니다.
  6. 허벅지의 복부와 등쪽 근육을 허벅지 중간 수준에서 세심한 헤모스티스로 나누고 필요에 따라 사지를 내측으로 후퇴시킵니다.
  7. 위와 같이 상반신 신경근위를 분기점으로 식별하고 나눕니다.
  8. 톱을 사용하여 중간 샤프트에서 대퇴골을 횡단합니다.
  9. 받는 사람 네이티브 오른쪽 뒷다리를 제거하고 적절하게 폐기하십시오.
  10. 코 콘을 통해 이소플루란을 1-1.5%로 하향 돌이세요.

3. 받는 사람 사지 이식에 기증자

  1. 핸드 헬드 파워 톱을 사용하여 기증자와 수령인 대퇴골 절단 끝에서 부정을 면도하십시오.
  2. 톱을 사용하여 18 게이지 바늘의 허브 끝을 잘라 내어 대퇴골 내막 막대가됩니다.
  3. 뼈를 조작하기 전에, 재막 과정에서 골수 출혈을 줄이기 위해 대퇴골 뼈의 끝을 잘라 받는 사람에 소량의 뼈 왁스를 적용합니다.
  4. 기증자와 수령인 대퇴 뼈를 18 게이지 바늘을 관문 막대로 사용하여 동거하십시오. 어떤 힘은 필요하지만, 피질을 골절까지 어느 뼈중 하나를 ream하지 않습니다.
  5. 필요에 따라 바늘을 제거하고 적절한 길이로 트리밍하여 두 뼈가 바늘 사이에 바늘이 보이지 않고 바늘 위에 부드럽게 맞도록 하십시오.
  6. 거즈 패드 나 작은 바위 또는 기증자 사지 아래에 점토모델링과 같은 작은 지지대를 배치하여 긴장을 피하십시오.
  7. 이식편이 대퇴골 바늘 주위를 회전하지 않도록 8 ~ 10 개의 간단한 중단 5-0 폴리 글락틴 봉합사를 가진 복부 근육 그룹을 다시 상종. 이것은 해부학에 대한 사지 안정성을 제공합니다.
  8. 더 나은 시각화를 위해 얼음 차가운 식염수로 이식 및 외과 분야를 주기적으로 관개하고 따뜻한 허혈성 재퍼퓨전 손상을 줄입니다.
  9. 기증자와 수령인 대퇴 동맥을 정렬하고 단순 중단 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 종단 에 종결방식으로 그들을 해부학, 긴장과 루프를 모두 피하십시오. 동맥은 평균 6 개의 봉합사가 필요합니다.
  10. 동맥과 유사하게 기증자와 수혜자 대퇴정맥을 끝까지 끝까지 해부학합니다. 정맥은 6 ~8 봉합사가 필요합니다.
    참고: 넉넉한 차가운 식염수 관개, 외상성 혈관 취급 기술 및 긴 꼬리를 방치하여 선박 회수를 위한 체류 봉합사 역할을 하는 것은 효과적인 미세 수술 해부학을 위한 중요한 도구입니다.
  11. 소량의 혈전성 셀룰로오스 분말을 마취제 주위에 놓고 정맥과 동맥에 근접 미세 수술 불독 클램프를 제거합니다.
  12. 좋은 육아와 흐름을 위해 양상모를 검사합니다. 면 봉면을 사용하여 정맥을 부드럽게 프로딩하고 두 해부학모두의 좋은 지혈을 보장하십시오. 출혈 부위에 압력을 가하고 필요한 경우 더 많은 혈전성 셀룰로오스 분말을 배치하십시오. 또 다른 봉합사는 마지막 수단으로만 바늘을 "백 월링"할 위험에 출혈 구멍을 통해 배치 될 수 있습니다.
  13. 두 해부학 모두 만족스러운 것으로 확인되면 나머지 장기 체류 봉합사 꼬리를 다른 것과 일치하도록 짧게 다듬습니다.
  14. 쥐를 왼쪽 측면 탈큐비투스 위치로 재배치하고, 자유로운 전기 카우테를 사용하여 모든 재관류 근육 출혈의 세심한 hemostasis를 달성하십시오.
  15. 근육 기혈이 보장되면 신경 해부학에주의를 돌립니다. 비정형으로 보이는 신경 절단 끝을 다시 트리밍합니다.
  16. 간단한 중단 5-0 폴리 글락틴 봉합사와 상시 신경 아래 등산 근육 그룹을 다시 상종.
  17. 상술 신경을 다시 상시합니다. 8 -10-0 나일론 신경 간단한 중단 봉합사 일반적으로 충분합니다.
  18. 상기 시키는 등쪽 근육 단을 다시 근사한 다음 4-0 폴리글락틴 연속 봉합사로 등쪽 피부를 닫습니다.
  19. 쥐를 다시 척추 위치로 재배치하고 대퇴 신경을 재평가합니다. 2 ~3 개의 10-0 나일론 신경 간단한 중단 봉합사도 일반적으로 충분합니다.
  20. 4-0 폴리글락틴 연속 봉합사로 복부 피부를 닫습니다. 일단 깨어 나면 쥐에 자극 될 수있는 여분의 봉합꼬리를 피하십시오.

4. 수술 후 치료

  1. 케이지 아래에 난방 패드가 있는 케이지에서 동물을 복구하고 음식과 물에 대한 준비를 통해 첫 주 동안 매일 조기 합병증을 모니터링합니다.
  2. POD 2를 통해 피하 멜록시캄 1 mg/kg 일일 주사를 통해 수술 후 항간증을 제공합니다. 수술 후 항생제 예방을 제공하여 엔로플로록사신 스프레이를 희석시합니다. POD 7을 통해 이식편에 매일 두 번 분사된 비터 세이프 미스트로 자동 절제술(자가 절단)에 불이익을 제공합니다.
  3. 다른 쥐와 함께 케이지에 이식 된 쥐를 유지, 매일 활동에 반환을 자극 하 고 이식 된 사지를 재활.

5. 수술 후 감각 테스트

  1. 열 감각 프로토콜의 Hargreaves 테스트를 적용, 또한 다른 곳에서 설명17,,18.
  2. 쥐를 테스트 컨테이너에 넣고 20 분 동안 적응할 수 있었습니다. 장치 유리는 깨끗하게 확인되고, 열원은 조사관의 손가락으로 작동하는 것으로 확인되었다.
  3. 테스트하기 전에 쥐가 깨어 있고 테스트된 발이 적외선 모션 검출기 위에 배치되어 있는지 확인합니다.
  4. 강도 수준 90에서 열 에너지를 전송합니다. 열원에서 발을 멀리 이동하는 동물의 시간 지연이 기록됩니다. 20초 이내에 움직임이 발생하지 않으면 부상을 방지하기 위해 시험이 중단됩니다.
  5. 각 동물에 대한 평균 인출 대기 시간을 계산하기 전에 가장 높고 낮은 값을 제외하고 테스트 된 사지 당 5 번의 시험을 얻습니다.

6. 수술 후 모터 테스트

  1. 걸음걸이 분석 러닝머신과 통합 소프트웨어 분석 플랫폼을 사용하여 수술 후 4~6주 동안 러닝머신 테스트 후보자를 선택합니다.
  2. 테스트 하기 전에 모든 쥐 발톱 1 ~ 이틀 을 손질.
  3. 테스트 하기 전에 1 시간 동안 테스트 룸에 동물을 적응 하 고 불안을 진정 하기 위해 사전 테스트 페팅의 1 분 동안 허용.
  4. 러닝머신 내부에 쥐를 배치하고, 10cm/s에서 14cm/s로 속도를 높이는 시험에서 러닝머신을 18cm/s로 실행합니다. 쥐가 망설이고 걷기 위해 동축 될 수없는 경우, 부정적인 컨디셔닝을 피하기 위해 그 날 테스트를 중단하십시오. 높은 공연자가 최대 24cm/s까지 걸을 수 있도록 합니다.
  5. 테스트 된 동물 사이에 70 % 에탄올로 러닝 머신 장치를 헹구십시오.
  6. 걸음걸이 매개 변수는 분석 플랫폼의 독점 소프트웨어에서 출력됩니다.

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결과

생존과 회복은 세심한 수술 기술에 달려 있습니다. 혈관 해부학과 신경 해부학뿐만 아니라 위에서 설명한 바와 같은 뼈 응고에 대한 관심은이 모델의 성공을 극대화하는 데 중요합니다. 수술 설계 및 대표적인 아나스토모틱 결과는 도 1에도시된다.

전반적인 사망률은 면역 억제 전략에 의존했으며, 이소 이식 된 동물의 대부분은 도 2에서 볼 수 있듯이 ?...

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토론

사지 이식, 혈관 구성 요소 동종 이식의 광범위한 범주에 따라 (VCA), 아직 성취되지 않은 널리 적용 가능한 치료 약속. 주요 장애물은 현재 사용되는 VCA 및 신경 운동 복구 기술에 고유한 해결되지 않은 면역 학적 문제에 있습니다. 새로운 기술의 개발은 유연하고 견고하며 재현 가능한 동물 모델링에 달려 있습니다.

많은 동물 모델은 VCA에 설립되었습니다, 특정 장점

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 프랑켈 재단과 노스 웨스턴 메모리얼 병원 맥코믹 그랜트 (운영 복원)에 의해 지원되었다. 이 간행물에서 보고된 연구는 상 번호 T32GM008152의 밑에 건강의 국가 학회의 일반 메디의 과학의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 노스 웨스턴 대학 미세 수술 코어와 행동 Phenotyping 코어에 의해 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia machineVet Equip911103
0.5cc syringeExel26018
18-gauge needleBD305196
1cc syringeBD309659
22-gauge needleBD305156
24-gauge angiocatheterSur-VetSROX2419V
25-gauge needleExel26403
3 cc syringeBD309657
5cc syringeExel26230
AlcoholFisher ScientificHC-600-1GAL
Anesthesia induction chamberVet Equip941443
Anesthetic gas scavenger systemVet Equip931401
Bipolar electrocauteryAura26-500
Bitter Spray MistHenry Schein5553
Bone waxCP MedicalCPB31A
Breathing circuitVet Equip921413
BuprenophineReckitt Benckiser12496075705
Castro-Viejos needle driversRobozRS-6416
Cordless rotary sawDremel8050-N/18
Cotton swab stickFisher Scientific23-400-101For hemostasis
DigiGait Appparatus and SoftwareMouse SpecificsMSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4)RobozRS-4972
Dumont forceps (#5)RobozRS-5035
EnrofloxacinNorbrookANADA 200-495
FK-506Astellas301601
GauzeKendall1903
GauzeCovidien8044
GlovesMicroflexDGP-350-M
Hair clippersOster078005-010-003
Handheld monopolar electrocauteryBovieAA00
Hargreaves ApparatusUgo Basile S.R.L. Gemonio, Italy37370
Heating padWalgreens126987
HeparinFresenius Kabi42592K
Hot plateCorningPC-351For warming resusscitation fluid
IsofluraneHenry Schein29405
Lactated ringersBaxter2B2074
Large petri dishFisher ScientificFB0875713For donor graft while in chilled saline
MeloxicamHenry Schein49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissorsRobozRS-5841
Microfibrillar collagen powderBD1010590For hemostasis
Microvascular clipsRobozRS-5420
Normal salineBaxter2F7124
Opthalmic lubeDechraIS4398
RapmycinMedChem ExpressHY-10219
Small petri dishFisher ScientificFB0875713AFor warmed resusscitation fluid
Sterile drapesProAdvantageN207100
Surgical gownCardinal Health9511
Surgical mask3M1805
Surgical microscope, optic model OPMIMDZeiss169756
Surgical microscope, Universal S3Zeiss243188
Suture 10-0 nylonCovidienN2512
Suture 5-0 vicrylEthiconJ213H
Suture 7-0 silk tieTeleflex103-S
Tape3M1530-1
Ultrasonic instrument cleanerRobozRS-9911
Vessel dilation forcepsRobozRS-5047

참고문헌

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