Dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata

Resumen

Este protocolo presenta un modelo robusto y reproducible de alotrasplante compuesto vascularizado (VCA) orientado al estudio simultáneo de la inmunología y la recuperación funcional. El tiempo invertido en la técnica meticulosa en un trasplante ortotópico de las extremidades traseras de la parte media derecha con anastomosas vasculares cosidas a mano y coaptación neuronal produce la capacidad de estudiar la recuperación funcional.

Resumen

El trasplante de extremidades en particular y el alotrasplante compuesto vascularizado (VCA) en general tienen amplias promesas terapéuticas que han sido obstaculizadas por las limitaciones actuales en inmunosupresión y recuperación neuromotor funcional. Muchos modelos animales han sido desarrollados para estudiar características únicas de VCA, pero aquí presentamos un modelo reproducible robusto de trasplante ortotópico de extremidades traseras en ratas diseñadas para investigar simultáneamente ambos aspectos de la limitación actual de VCA: estrategias de inmunosupresión y recuperación neuromotora funcional. En el núcleo del modelo descansa un compromiso con técnicas microquirúrgicas meticulosas y probadas en el tiempo, como las análisismosas vasculares cosidas a mano y la coaptación neuronal cosida a mano del nervio femoral y el nervio ciático. Este enfoque produce reconstrucciones duraderas de extremidades que permiten animales de mayor vida capaces de rehabilitación, reanudación de las actividades diarias y pruebas funcionales. Con el tratamiento a corto plazo de los agentes inmunosupresores convencionales, los animales alotraplanados sobrevivieron hasta 70 días después del trasplante, y los animales isotraplantados proporcionan controles de larga duración más allá de los 200 días posteriores a la operación. La evidencia de recuperación funcional neurológica está presente por 30 días después de la operación. Este modelo no sólo proporciona una plataforma útil para interrogar preguntas inmunológicas exclusivas de VCA y regeneración nerviosa, sino que también permite realizar pruebas in vivo de nuevas estrategias terapéuticas específicamente adaptadas para VCA.

Introducción

El trasplante de extremidades en la categoría más amplia de alotraplante de compuesto vascularizado (VCA) o alotrasplante de tejido compuesto (CTA) aún no ha cumplido su promesa terapéutica. Desde los primeros trasplantes de mano humanos exitosos en Lyon, Francia y Louisville, Kentucky en 1998 y 1999, se han realizado más de 100 trasplantes de extremidades superiores en todo el mundo en pacientes cuidadosamente seleccionados^1. La aplicabilidad más amplia se ha visto obstaculizada por una inmunosupresión sustancial y una recuperación neuromotor funcional limitada. Las estrategias actuales de inmunosupresión dan como resultado una incidencia del 85% de rechazo agudo frente al 77% de incidencia de infección oportunista². Por otro lado, se produce la recuperación funcional después del trasplante de manos; Las puntuaciones medias de Discapacidad del Hombro y mano del brazo (DASH) mejoran de 71 a 43, pero ese nivel de función todavía puede calificar como una discapacidad². Dada la naturaleza que salva vidas al trasplante de extremidades, las técnicas actuales deben perfeccionarse en modelos animales para dar el siguiente paso en VCA.

Desde el primer modelo de rata de trasplante de extremidades en 1978³, se han desarrollado muchos modelos animales innovadores para avanzar en el campo de VCA^4,incorporando anastomosas con manguito vascular para minimizar el tiempo de funcionamiento^5,,6,heterotópico trasplantes osteomiocutáneos para minimizar el insulto fisiológico al animal receptor^7,8,9,10,11, y nuevos enfoques inmunológicos^7,12,13,14. El modelo de rata del trasplante ortotópico de las extremidades traseras traseras derechas presentado aquí enfatiza técnicas microquirúrgicas meticulosas y probadas en el tiempo, como las anastomosas vasculares cosidas a mano y la coaptación neuronal como una inversión inicial en una plataforma modelo robusta y reproducible para investigar simultáneamente ambos aspectos de la limitación actual de VCA: estrategias de inmunosupresión y recuperación neuromotora funcional.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los procedimientos específicos se realizaron bajo el protocolo IS00001663.

NOTA: Se utilizaron dos cepas de ratas, ratas Lewis y ratas August Copenhagen x Irish (ACI). Los animales se dividieron en tres grupos de tratamiento: atransplante sin supresión inmune (ACI a Lewis), atransplano con supresión inmune convencional (ACI a Lewis), e isotransplano (Lewis a Lewis o ACI a ACI). Lewis es una cepa endogácida, mientras que las ratas ACI representan un tipo salvaje de razas paralelas, por lo tanto esta combinación fue elegida para modelar la respuesta de rechazo en peor caso. La inmunosupresión convencional se administró por vía subcutánea, ya sea como rapamicina 1 mg/kg desde el día postoperatorio (POD) menos 1 a POD 28 o como FK506 3 mg/kg de POD 0 a POD 14, y luego una vez por semana a partir de entonces. Tanto las ratas macho como las hembras eran receptoras elegibles de 8 a 16 semanas de edad, con un peso de entre 250 y 400 gramos en el momento de la cirugía.

1. Cosecha de las extremidades traseras derecha del donante

1. Inducir anestesia general con 5% de isoflurano en oxígeno puro a través de un vaporizador con un sistema de barrido adecuado.
2. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia con pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del de la mano, y luego use cortapelos para recortar el pelaje de la extremidad posterior derecha y el sitio quirúrgico de la ingle derecha
3. Valorar hacia abajo el isoflurano a través de un cono nasal de roedor a 2-2,5%.
4. Coloque la rata supina con las extremidades extendidas pegadas a los lados en una placa de operaciones con una almohadilla de calentamiento debajo. Desinfectar la piel sin pelo con 70% de alcohol de frotar y proteger el campo quirúrgico con gasa estéril.
5. Usando un microscopio microquirúrgico apropiado, instrumentos microquirúrgicos, y con fácil acceso a la electrocauterización bipolar y monopolar, comienzan la disección.
6. Usa tijeras para hacer una incisión de piel/tejido subcutáneo circunferencial alrededor de la extremidad posterior derecha. Comience en el pliegue inguinal medialmente aproximadamente al mismo nivel que el ligamento inguinal y extienda dorsal-lateralmente para completar la incisión circunferencial.
7. Después de haber expuesto la capa muscular directamente debajo de la incisión, diseccionar y cauterizar los vasos epigástricos superficiales que conducen desde la capa muscular a la piel proximal / colgajo subcutáneo acaba de crear.
8. Refleja el colgajo proximal casimedialmente al ligamento inguinal y la piel distal/colgajo subcutáneo inferolateralmente a la rodilla.
9. Utilice un retractor de alambre o una gasa enrollada para ayudar a exponer el campo.
10. Observe que la anatomía inguinal de la rata es similar a los humanos; de lateral a medial se encuentran el nervio, la arteria y la vena.
11. Diseccionar el nervio femoral, dividirlo bruscamente en el ligamento inguinal, proximal a la bifurcación si es posible. Retirar el nervio dividido inferiormente, manteniéndolo a salvo fuera del camino, cubierto bajo gasa húmeda.
12. Volviendo la atención a la arteria femoral y la vena, utilice lazos de seda de 4 cm 7-0 para retraer los vasos de forma atraumática en lugar de manipularlos directamente.
13. Ligar todas las ramas de los vasos femorales a medida que surgen con 7-0 lazos de seda; dividir las ramas entre los lazos. Para ramas muy pequeñas, se puede utilizar cautey bipolar en lugar de corbatas.
    NOTA: Las ramas arteriales y venosas que requieren división incluyen el circunflejo superficial ilíaco y los vasos musculares. El circunflejo iliac superficial es generalmente más grande y parece sumergirse profundamente como lo haría la femoral profunda en los seres humanos, pero la profundidad está ausente en la rata¹⁵. Las ramas más distales de los vasos femorales como la rama genicular más alta y la rama safenosa no suelen requerir división.
14. Inyectar sistémicamente 500 unidades internacionales de heparina a través de la vena del pene en un donante de ratas macho. Utilice la vena epigástrica superficial si la rata donante es hembra.
15. Permita que la heparina circule sistémicamente durante 2 minutos antes de continuar con los siguientes pasos.
16. Ligar la arteria femoral con lazos de seda 7-0 tan proximales al ligamento inguinal como sea posible y dividir entre los lazos.
17. Similar a la arteria, ligar y dividir la vena femoral.
18. Reflejar la arteria y la vena de manera inferior, segura fuera del camino, cubierto debajo de la gasa húmeda junto con el nervio femoral cubierto previamente. Diseccionar los grupos musculares ventrales, teniendo cuidado de cauterizar cualquier vaso visible que surja. La atención a la hemostasia aquí minimizará la pérdida de sangre del receptor después de la reperfusión.
19. Profundo a los grupos musculares ventrales, identificar y dividir bruscamente el nervio ciático proximal a sus ramas. Tres ramas ciáticas son generalmente visibles: tibial, peroneal y sural. Los tres deben conservarse en la extremidad del donante. Una cuarta rama cutánea no se ve típicamente en esta disección^15,16.
20. Termina de dividir los grupos musculares ventrales y dorsales restantes a nivel del muslo medio con una meticulosa hemostasia. Puede ser necesario retraer la extremidad mediamente para completar la división de los músculos.
21. Transect the fémur bone at midshaft using a hand-held cordless rotary saw.
22. Después de haber retirado el injerto de la extremidad del donante, corte los extremos atados de seda de la arteria femoral lateral del injerto y los tocones de las venas, abriendo así los vasos.
23. Inserte un angiocatéter de calibre 24 en el muñón de la arteria del injerto y enjuague el injerto con 250 unidades internacionales de heparina diluidas en 5 ml de solución salina normal helada, observándola fluir claramente a través de la vena abierta.
24. Lentamente, enjuague suavemente el injerto durante unos 3 minutos. El lavado excesivo de la fuerza puede dañar el endotelio.
25. Coloque el injerto en un plato salino frío anidado en un cubo de hielo hasta el trasplante.
26. Eutanasia la rata donante con toracotomía bilateral.
27. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos adecuadamente.

2. Amputación de la extremidad posterior nativa del receptor

1. Inducir la anestesia con isoflurano al 5%, confirmar la profundidad, recortar el pelaje, colocar el animal y desinfectar la piel con alcohol como se describe para la rata donante.
2. Isoflurano de valor descendente al 2-2,5% e inyectar analgesia preoperatoria subcutánea con buprenorfina 1,2 mg/kg, y profilaxis preoperatoria con enrofloxacina 7,5 mg/kg.
3. Igual que para el donante, hacer una incisión circunferencial en el pliegue inguinal, reflejar los colgajos de la piel asegurando hemostasia, y diseccionar el nervio femoral, arteria y vena, ligando los mismos vasos de rama que arriba.
4. Divida el nervio femoral más distalmente que para el donante, pero proximally a la bifurcación si es posible.
5. Diseccionar la arteria y la vena femorales con suficiente espacio para sujetar cada uno por separado a nivel del ligamento inguinal. Sujete la vena y la arteria con abrazaderas microquirúrgicas de bulldog. Una vez sujetado, divida cada recipiente bruscamente con tijeras.
6. Divide los músculos ventrales y dorsales del muslo a nivel medio del muslo con meticulosa hemostasia, retrayendo la extremidad mediamente según sea necesario.
7. Identifique y divida los nervios ciáticos proximales a sus puntos de rama como arriba.
8. Transecóte unas miras al fémur en el eje medio usando la sierra.
9. Retire la extremidad posterior derecha nativa del receptor y deseche adecuadamente.
10. Valorar hacia abajo el isoflurano a 1-1.5% a través del cono de la nariz.

3. Implantación de miembro de donante a receptor

1. Usando la sierra de potencia de mano, afeite cualquier irregularidad tanto de los extremos de corte de fémur del donante como del receptor.
2. Usando la sierra, corte el extremo del cubo de una aguja de calibre 18, que se convertirá en la varilla intramedular del fémur.
3. Antes de manipular el hueso, aplique una pequeña cantidad de cera ósea en el extremo cortado del hueso del fémur para reducir el sangrado de la médula durante el proceso de escariado.
4. Coapt los huesos femorales del donante y del receptor utilizando la aguja del calibre 18 como varilla intramedular. Es necesaria cierta fuerza, pero no resuena ninguno de los huesos en la medida en que se fracture la corteza.
5. Según sea necesario, retire la aguja y úsela a una longitud adecuada para que ambos huesos encajen suavemente sobre la aguja sin que se muestre una aguja entre el hueso.
6. Coloque un pequeño soporte como una almohadilla de gasa o una pequeña roca o arcilla de modelado debajo de la extremidad del donante para mantenerla fuera de la tensión.
7. Reapproxima los grupos musculares ventrales con ocho a diez simples suturas de poliglactitina interrumpidas de 5-0 para que el injerto no gire alrededor de la aguja del fémur. Esto le da a la extremidad estabilidad para las anastomosas.
8. Irrigar periódicamente el injerto y el campo quirúrgico con solución salina helada para una mejor visualización y reducir la lesión por reperfusión isquémica caliente.
9. Alinee las arterias femorales del donante y del receptor y anastomose de extremo a extremo usando una sutura de nylon interrumpida simple 10-0, evitando tanto la tensión como el bucle. La arteria requiere un promedio de seis suturas.
10. Al igual que la arteria, anastomose el donante y las venas femorales receptoras de extremo a extremo. La vena requiere de seis a ocho suturas.
    NOTA: El generoso riego salino frío, la técnica de manejo atraumático de los recipientes y dejar colas largas para servir como suturas de perduramiento para la retracción del recipiente son herramientas importantes para las análisismosas microquirúrgicas efectivas.
11. Coloque una pequeña cantidad de polvo de celulosa hemostática alrededor de ambas anstomosas, y luego retire las abrazaderas de bulldog microquirúrgicas proximales en la vena y la arteria.
12. Inspeccione ambas anastomosas para obtener una buena patencia y flujo. Use palitos de algodón para prodifiquen suavemente la vena y asegurar una buena hemostasia de ambas anastomosas. Mantenga la presión sobre los sitios de sangrado y coloque más polvo de celulosa hemostática si es necesario. Otra sutura se puede colocar a través de un agujero de sangrado a riesgo de "pared trasera" de la aguja sólo como último recurso.
13. Cuando ambas anastomosas se confirmen satisfactorias, recorte las colas de sutura de larga duración restantes cortas para que coincidan con las demás.
14. Reposiciona la rata a la posición de decúbito lateral izquierdo, utilice electrocauterización liberal para lograr una hemostasia meticulosa de cualquier sangrado muscular de reperfusión.
15. Preste atención a las anastomoses nerviosas una vez que la hemostasia muscular esté asegurada. Recorta los extremos de corte nervioso que parezcan desiguales.
16. Reapproxima los grupos musculares dorsales bajo nervio ciático con simples suturas de poliglactitina interrumpidas de 5-0.
17. Reapproxima el nervio ciático. Ocho a diez 10-0 nylon neural simples suturas interrumpidas por lo general será suficiente.
18. Reapproxima los grupos musculares dorsales que recuerdan y luego cierra la piel dorsal con 4-0 poliglactitina sutura continua.
19. Vuelva a colocar la rata en posición supina y reaproble el nervio femoral. Dos a tres 10-0 suturas de nylon neural simple interrumpidas generalmente serán suficientes.
20. Cierre la piel ventral con 4-0 de sutura continua de poliglactitina. Evite el exceso de cola de sutura, que puede ser irritante para la rata una vez despierto.

4. Atención postoperatoria

1. Recuperar animales en sus jaulas con una almohadilla de calefacción debajo de la jaula y el acceso listo a los alimentos y el agua, monitoreo de complicaciones tempranas diariamente durante la primera semana.
2. Proporcionar analgesia postoperatoria con meloxicam subcutáneo 1 mg/kg de inyección diaria a través de POD 2. Proporcionar antibiótico postoperatorio profilaxis diluyda enrofloxacino spray. Proporcione desincentivo para la autotomía (automutilación) con niebla amarga segura rociada dos veces al día al injerto a través de POD 7.
3. Mantener ratas trasplantadas en jaulas con otras ratas, para estimular el regreso a las actividades diarias y rehabilitar la extremidad trasplantada.

5. Pruebas de sensaciones postoperatorias

1. Aplicar la prueba Hargreaves del protocolo de sensación térmica, también descrito en otros lugares^17,18.
2. Coloque la rata en el recipiente de prueba y permita que se aclimate durante 20 minutos. El vidrio del aparato se confirma limpio, y la fuente de calor confirmó que está trabajando con el dedo del investigador.
3. Antes de realizar la prueba, confirme que la rata está despierta y que la pata probada se coloca sobre el detector de movimiento infrarrojo.
4. Transmitir energía térmica a nivel de intensidad 90. Se registra el retardo de tiempo en el que el animal aleja su pata de la fuente de calor. Si no se produce ningún movimiento en 20 segundos, la prueba se aborta para evitar lesiones.
5. Obtenga cinco ensayos por extremidad probada, excluyendo el valor más alto y más bajo antes de calcular el tiempo medio de latencia de retirada para cada animal.

6. Pruebas motoras postoperatorias

1. Usando una cinta de correr de análisis de marcha y una plataforma de análisis de software integrada, seleccione candidatos para las pruebas de la cinta de correr a las cuatro a seis semanas después de la cirugía.
2. Recortar todas las uñas de los pies de rata uno o dos días antes de la prueba.
3. Acclimar a los animales a la sala de pruebas durante una hora antes de la prueba, y permitir un minuto de acariciar previamente para calmar la ansiedad.
4. Colocando la rata dentro de la cinta de correr, ejecutar la cinta de correr en pruebas de aumento de velocidad, de 10 cm / s, a 14 cm / s, a la meta 18 cm / s. Si la rata es reticente y no puede ser persuadida para caminar, aborte la prueba ese día para evitar el acondicionamiento negativo. Permita que los artistas altos caminen hasta 24 cm/s.
5. Enjuague el aparato de la cinta de correr con un 70% de etanol entre animales probados.
6. Los parámetros Gait se emiten desde el software propietario de la plataforma de análisis.

Resultados

La supervivencia y la recuperación dependen de una técnica quirúrgica meticulosa. La atención a las anastomosas vasculares y las anastomosas neurales, así como a la coaptación ósea como se ha descrito anteriormente es crucial para maximizar el éxito de este modelo. El diseño operativo y los resultados antóstomicos representativos se muestran en la Figura 1.

La mortalidad global dependía de la estrategia de inmunosupresión, ya que la mayoría de los ani...

Discusión

El trasplante de extremidades, bajo la categoría más amplia de atransplantación de componentes vascularizados (VCA), tiene una promesa terapéutica ampliamente aplicable aún no cumplida. Los principales obstáculos se encuentran en problemas inmunológicos sin resolver exclusivos de VCA y técnicas de recuperación neuromotor utilizadas actualmente. El desarrollo de nuevas técnicas dependerá del modelado animal que sea flexible, robusto y reproducible.

Se han establecido muchos modelos a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Vet Equip	911103
0.5cc syringe	Exel	26018
18-gauge needle	BD	305196
1cc syringe	BD	309659
22-gauge needle	BD	305156
24-gauge angiocatheter	Sur-Vet	SROX2419V
25-gauge needle	Exel	26403
3 cc syringe	BD	309657
5cc syringe	Exel	26230
Alcohol	Fisher Scientific	HC-600-1GAL
Anesthesia induction chamber	Vet Equip	941443
Anesthetic gas scavenger system	Vet Equip	931401
Bipolar electrocautery	Aura	26-500
Bitter Spray Mist	Henry Schein	5553
Bone wax	CP Medical	CPB31A
Breathing circuit	Vet Equip	921413
Buprenophine	Reckitt Benckiser	12496075705
Castro-Viejos needle drivers	Roboz	RS-6416
Cordless rotary saw	Dremel	8050-N/18
Cotton swab stick	Fisher Scientific	23-400-101	For hemostasis
DigiGait Appparatus and Software	Mouse Specifics	MSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4)	Roboz	RS-4972
Dumont forceps (#5)	Roboz	RS-5035
Enrofloxacin	Norbrook	ANADA 200-495
FK-506	Astellas	301601
Gauze	Kendall	1903
Gauze	Covidien	8044
Gloves	Microflex	DGP-350-M
Hair clippers	Oster	078005-010-003
Handheld monopolar electrocautery	Bovie	AA00
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy	37370
Heating pad	Walgreens	126987
Heparin	Fresenius Kabi	42592K
Hot plate	Corning	PC-351	For warming resusscitation fluid
Isoflurane	Henry Schein	29405
Lactated ringers	Baxter	2B2074
Large petri dish	Fisher Scientific	FB0875713	For donor graft while in chilled saline
Meloxicam	Henry Schein	49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841
Microfibrillar collagen powder	BD	1010590	For hemostasis
Microvascular clips	Roboz	RS-5420
Normal saline	Baxter	2F7124
Opthalmic lube	Dechra	IS4398
Rapmycin	MedChem Express	HY-10219
Small petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	For warmed resusscitation fluid
Sterile drapes	ProAdvantage	N207100
Surgical gown	Cardinal Health	9511
Surgical mask	3M	1805
Surgical microscope, optic model OPMIMD	Zeiss	169756
Surgical microscope, Universal S3	Zeiss	243188
Suture 10-0 nylon	Covidien	N2512
Suture 5-0 vicryl	Ethicon	J213H
Suture 7-0 silk tie	Teleflex	103-S
Tape	3M	1530-1
Ultrasonic instrument cleaner	Roboz	RS-9911
Vessel dilation forceps	Roboz	RS-5047