Принимая следующий шаг: Нейронная коаптация ортопедической модели трансплантации задних конечностей для максимального функционального восстановления в Крыса

Резюме

Этот протокол представляет собой надежную, воспроизводимую модель васкуляризированного композитного аллотрансплантататата (VCA), направленную на одновременное изучение иммунологии и функционального восстановления. Время, вложенное в дотошную технику в правой задней конечности задняя ортопедическая трансплантация с сшитыми сосудистой анастомозой и нервной коапптации дает возможность изучения функционального восстановления.

Аннотация

Пересадка конечностей, в частности, и васкуляризированные композитные аллотрансплантации (VCA) в целом имеют широкие терапевтические перспективы, которые были загнаны в тупик нынешних ограничений в иммуносупрессии и функционального нейромоторного восстановления. Многие модели животных были разработаны для изучения уникальных особенностей VCA, но здесь мы представляем надежную воспроизводимую модель ортопедической пересадки задних конечностей у крыс, предназначенных для одновременного исследования обоих аспектов текущего ограничения VCA: стратегии иммуносупрессии и функционального нейромоторного восстановления. В основе модели лежит приверженность тщательной, проверенной временем микрохирургических методов, таких как сшитые вручную сосудистые анастомозы и сшитые вручную нейронные коапптации бедренного нерва и седалищного нерва. Такой подход дает прочные реконструкции конечностей, которые позволяют дольше жить животных, способных реабилитации, возобновление повседневной деятельности, и функциональное тестирование. При кратковременном лечении обычных иммуносупрессивных средств, аллотрансплантированные животные выжили до 70 дней после трансплантации, и изотрансплантированные животные обеспечивают длительный контроль за 200 дней после оперативного. Доказательства неврологического функционального восстановления присутствуют через 30 дней после оперативного. Эта модель не только предоставляет полезную платформу для допроса иммунологических вопросов, уникальных для VCA и регенерации нервов, но и позволяет in vivo тестирования новых терапевтических стратегий, специально предназначенных для VCA.

Введение

Пересадка конечностей в более широкой категории васкуляризированного композитного аллотрансплантатата (VCA) или композитного аллотрансплантатата (CTA) до сих пор не выполнила свои терапевтические перспективы. С момента первой успешной пересадки рук человека в Лионе, Франция и Луисвилле, штат Кентукки в 1998 и 1999 годах, более 100 верхних конечностей трансплантации были выполнены во всем мире в тщательно отобранных пациентов¹. Более широкая применимость была загнана в тупик из-за существенного иммуносупрессии и ограниченного функционального нейромотора восстановления. Текущие стратегии иммуносупрессии приводят к 85% заболеваемости острым отторжением в лице 77% заболеваемости оппортунистической инфекцией^2. С другой стороны, происходит функциональное восстановление после пересадки руки; средний инвалидность руки плеча и руки (DASH) оценки улучшить от 71 до 43, но этот уровень функции все еще может квалифицироваться как инвалидность². Учитывая нежизне сохранение природы пересадки конечностей, современные методы должны быть уточнены в животных моделях, чтобы сделать следующий шаг в VCA.

С первой крысиной модели пересадки конечностей в 1978³, многие инновационные модели животных были разработаны для продвижения области VCA⁴, включая сосудистые наручники анастомозы, чтобы свести к минимуму оперативное время^5,6, гетеро утопические остеомиоккутанные трансплантации, чтобы свести к минимуму физиологическое оскорбление реципиента животных^7,8,9,10,11, и новые иммунологические подходы^7,12,13,14. Крыса модель ортотопных правой задней конечности середине бедра трансплантации представлены здесь подчеркивает тщательно, проверенные временем микрохирургические методы, такие как руки сшиты сосудистые анастомозы и нервной коапптации в качестве авансового инвестирования в надежной, воспроизводимой модели платформы одновременно исследовать оба аспекта текущего ограничения VCA: стратегии иммунодепрессиции и функционального нейромоторного восстановления.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (NIH) и были одобрены Северо-Западным университетом по уходу и использованию животных. Конкретные процедуры выполнялись в соответствии с протоколом IS00001663.

ПРИМЕЧАНИЕ: Два штамма крыс были использованы, Льюис крыс и август Копенгаген х ирландский (ACI) крыс. Звери были разделены на три группы лечения: аллотрансплант без подавления иммунитета (ACI Льюис), аллотрансплант с обычным подавлением иммунной системы (ACI к Льюису), и изотрансплант (Льюис Льюис или ACI к ACI). Льюис является инбредным штаммом, в то время как крысы ACI представляют собой выведенный дикий тип, поэтому эта комбинация была выбрана для моделирования хуже случае отказ ответ. Обычный иммуносупрессионный вводили подкожно либо как рапамицин 1 мг/кг от послеоперационного дня (POD) минус 1 до POD 28 или как FK506 3 мг/кг от POD 0 до POD 14, а затем один раз в неделю после этого. Как мужчины, так и самки крыс имели право получателей от 8 до 16 недель, весом от 250 до 400 граммов на момент операции.

1. Донор правой задней конечности урожая

1. Индуцировать общую анестезию с 5% изофлуран в чистом кислороде через испаритель с соответствующей системой очистки.
2. Подтвердите адекватную глубину анестезии с ног щепотку, а затем использовать ножницы для волос, чтобы обрезать мех от правой задней конечности и правой пах хирургического сайта
3. Вниз-титра изофлурана через конус носа грызунов до 2-2,5%.
4. Позиция крысы на спине с распространением конечностей лентой в стороны на операционной доске с грелкой под ним. Дезинфицировать лысую кожу 70% спиртом и защитить хирургическое поле стерильной марлей.
5. Используя соответствующий микрохирургический микроскоп, микрохирургические инструменты, и с легким доступом к биполярной и монополярной электрокаутерии, начать вскрытие.
6. Используйте ножницы, чтобы сделать окружной кожи / подкожной ткани разрез вокруг правой задней. Начните с паховой складки medially примерно на том же уровне, как паховая связка и продлить спинной-поздней для завершения окружного разреза.
7. Вскрыв мышечного слоя непосредственно под разрезом, вскрыть и прижигать поверхностные эпигастральные сосуды, которые ведут от мышечного слоя к проксимальной кожи / подкожный лоскут только что созданный.
8. Отражение проксимального лоскута сверхсолодово к паховой связки и дистальной кожи / подкожный лоскут inferolaterally к колену.
9. Используйте провод втягиватель или проката марли, чтобы помочь разоблачить поле.
10. Обратите внимание, что паховая анатомия крысы похожа на человека; от боковой до медиальной лежат нерв, артерии и вены.
11. Вскрыть бедренный нерв, резко разделить его на паховой связки, проксимальной к бифуркации, если это возможно. Втягивайе разделенный нерв неполноценно, сохраняя его безопасно в сторону, покрытые под влажной марлей.
12. Обращая внимание на бедренную артерию и вену, используйте 4 см 7-0 шелковых связей, чтобы атрауматически втягивать сосуды вместо того, чтобы обращаться с ними напрямую.
13. Ligate все ветви бедренных сосудов, как они возникают с 7-0 шелковых связей; разделить ветви между узами. Для очень небольших ветвей, биполярное прижигания могут быть использованы вместо связей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Артериальные и венозные ветви, которые требуют деления включают поверхностные кругосветные подвздошные и мышечные сосуды. Поверхностный окружной подвздошный, как правило, самый большой и, кажется, нырять глубоко, как бы промунда бедренной жизни у людей, но промунда отсутствует в крысы¹⁵. Более дистальные ветви бедренных сосудов, такие как высший геникулярный и saphenous ветви, как правило, не требуют разделения.
14. Системно впрыскивают 500 международных единиц гепарина через вену полового члена у мужского донора крысы. Используйте поверхностные эпигастрические вены, если донорская крыса самка.
15. Разрешить гепарин циркулировать системно в течение 2 минут, прежде чем приступить к следующим шагам.
16. Ligate бедренной артерии с 7-0 шелковых связей, как проксимальные к паховой связки, как это возможно и разделить между связями.
17. Как и в артерии, ligate и разделить бедренную вену.
18. Отражение как артерии и вены неполноценно, безопасно в сторону, покрытые под влажной марлей вместе с бедренным нервом покрыты ранее. Рассекайте группы мышц брюшной мышцы, заботясь о прижигать любой видимый сосуд, который возникает. Внимание к гемостазу здесь сведет к минимуму потерю крови реципиента после реперфузии.
19. Глубоко к вентральной групп мышцы, определить и резко разделить седалищный нерв проксимальный его ветвей. Обычно видны три седалищные ветви: тибиальные, перонеальные и суровые. Все три должны быть сохранены в конечности донора. Четвертая кожная ветвь обычно не видна в этом вскрытии^15,16.
20. Закончить деление оставшихся вентраальных и спинных групп мышц на уровне среднего бедра с дотошным гемостазом. Это может быть необходимо втягивать конечности medially для полного деления мышц.
21. Переток бедренной кости в середине валы с помощью ручной беспроводной вращающейся пилы.
22. Сняв прививку конечностей у донора, срежьте шелковые связанные концы с прививочной стороны бедренной артерии и пней вены, тем самым вновь открыв сосуды.
23. Вставьте 24-калиберный ангиокэтетер в пень трансплантата и промойте трансплантат с 250 международными единицами гепарина, разбавленного в 5 мл ледяного нормального солевого раствора, наблюдая, как он вытекает ясно через открытую вену.
24. Медленно, осторожно промыть трансплантата в течение примерно 3 минут. Избыток силового промывки может повредить эндотелий.
25. Поместите трансплантат в охлажденное солевое блюдо, вложенное в ведро со льдом до трансплантации.
26. Euthanize крысы-донора с двусторонней торакотомии.
27. Очистите все хирургические инструменты надлежащим образом.

2. Получатель родной правой ампутации задней конечности

1. Индуцировать анестезию с изофлуран на 5%, подтвердить глубину, обрезать мех, положение животного, и дезинфицировать кожу с алкоголем, как описано для донорской крысы.
2. Изофлуран до 2-2,5% и введение подкожной предоперационной анальгезии с бупренорфином 1,2 мг/кг, а также предоперационной профилактикой с энрофлоксацином 7,5 мг/кг.
3. То же самое, что и для донора, сделать окружной разрез в паховой складке, отражают кожные лоскуты, обеспечивающие гемостаз, и вскрыть бедренный нерв, артерию и вену, перевязыв те же ветви сосудов, что и выше.
4. Разделите бедренный нерв более distally чем для дарителя, но proximally к бифуркации if возможные.
5. Вскрыть бедренной артерии и вены с достаточным пространством, чтобы зажать каждый отдельно на уровне паховой связки. Зажмите вену и артерию микрохирургическими зажимами бульдога. После зажима, разделить каждый сосуд резко ножницами.
6. Разделите брюшной и спинной мышцы бедра в середине бедра уровне с тщательного гемостаза, втягивая конечности medially по мере необходимости.
7. Определить и разделить седалищные нервы проксимальные их точки ветви, как указано выше.
8. Перетектору бедренной кости в середине валы с помощью пилы.
9. Удалите получателя родной правой задней конечности и распоряжаться соответствующим образом.
10. Вниз-титра изофлурана до 1-1,5% через нос конуса.

3. Донор имплантации конечностей-реципиентов

1. Используя ручную пилу питания, сбрить любые нарушения как от донора и реципиента бедренной кости вырезать концы.
2. Используя пилу, отрежьте конец концентратора 18-калиберной иглы, которая станет бедренной костью интрамедуллярного стержня.
3. Перед манипулированием кости, применять небольшое количество костного воска для получателя сократить конце бедренной кости, чтобы уменьшить кровотечение костного мозга во время процесса повторного ния.
4. Coapt донора и реципиента бедренных костей с помощью 18-калиберной иглы в качестве интрамедуллярного стержня. Некоторая сила необходима, но не ream ни кости до тех пор, чтобы перелом коры.
5. По мере необходимости, удалить иглу и обрезать его до соответствующей длины, так что обе кости плавно вписываются над иглой без иглы, показывая между костью.
6. Поместите небольшую поддержку, такую как подушечка марли или небольшой камень или моделирование глины под донорской конечности, чтобы держать его от напряжения.
7. Reapproximate группы мышц вентральной мышцы с 8 до 10 простых прерванных 5-0 полиглактиновых швов, так что трансплантат не вращается вокруг иглы бедренной кости. Это придает конечности стабильность анастомозы.
8. Периодически орошать трансплантат и хирургическое поле с ледяной солевой раствор для лучшей визуализации и уменьшить теплую ишемическую травму реперфузии.
9. Выровнять донора и реципиента бедренных артерий и anastomose их в конце до конца моды с помощью простых прерванных 10-0 нейлоновых швов, избегая как напряжения и петли. Артерия требует в среднем шесть швов.
10. Как и в артерии, anastomose донора и реципиента бедренных вен в конце до конца моды. Вену требуется от шести до восьми швов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Великое холодное соленое орошение, атрауматический метод обработки судов, и оставляя длинные хвосты, чтобы служить в качестве шов пребывания для втягивания судна являются важными инструментами для эффективного микрохирургических анастомоз.
11. Поместите небольшое количество гемостатического порошка целлюлозы вокруг обоих анастомозов, а затем удалить проксимальные микрохирургические зажимы бульдога на вену и артерию.
12. Осмотрите как анастомозы для хорошей проходимости и потока. Используйте ватные тампоны палочки, чтобы мягко подтолкнуть вены и обеспечить хороший гемостоз обоих анастомозов. Держите давление над кровотечением сайтов и место более гемостатической целлюлозы порошок, если это необходимо. Другой шов может быть помещен через отверстие кровотечения на риск "обратно стены" иглы только в крайнем случае.
13. Когда оба анастомозы подтверждены удовлетворительным, обрезать любые оставшиеся длинные хвосты пребывания шов короткий, чтобы соответствовать другим.
14. Перепоместите крысу в левое боковое положение декубита, используйте либеральную электрокаутерию для достижения тщательного гемостаза любого реперфузиого мышечного кровотечения.
15. Обратить внимание на нерв анастомозы, как только мышечный гемостаз гарантировано. Обрезать обратно любые нервные концы, которые появляются оборванные.
16. Reapproximate спинной группы мышц под седалищный нерв с простым прерван 5-0 полиглактин швы.
17. Проницать седалищный нерв. Восемь до десяти 10-0 нейлоновых нейронных простых прерванных швов, как правило, достаточно.
18. Проницайте напоминающие спинные группы мышц, а затем закройте спинную кожу 4-0 полиглактином непрерывным швом.
19. Перепоместить крысу обратно в положение на спине и повторное повреждение бедренного нерва. Два-три 10-0 нейлоновых нейронных простых прерванных швов, как правило, достаточно.
20. Закройте желудочковую кожу 4-0 полиглактином непрерывным швом. Избегайте избыточного хвоста шва, который может раздражать крысу после пробуждения.

4. Послеоперационный уход

1. Восстановить животных в клетках с грелкой под клеткой и готовый доступ к пище и воде, мониторинг ранних осложнений ежедневно в течение первой недели.
2. Обеспечить послеоперационную анальгезию с подкожным мелоксикам 1 мг/кг ежедневной инъекции через POD 2. Обеспечить послеоперационную антибиотикопрофилактицию разбавленного энрофлоксацина спрей. Обеспечить сдерживающий стимул для аутотомии (самоувечья) с Горьким Безопасный Туман распыляется два раза в день, чтобы трансплантат через POD 7.
3. Поддерживайте пересаженных крыс в клетках с другими крысами, чтобы стимулировать возвращение к повседневной деятельности и реабилитировать пересаженных конечностей.

5. Послеоперационное тестирование сенсаций

1. Применить Hargreaves тестирования тепловой протокол ощущения, также описано в другом месте^17,18.
2. Поместите крысу в испытательный контейнер и дать ей акклиматизироваться в течение 20 минут. Стекло аппарата подтверждено чистым, а источник тепла подтвердил, что работает с пальцем следователя.
3. Перед тестированием подтвердите, что крыса не спит и проверенная лапа расположена над инфракрасным детектором движения.
4. Передача тепловой энергии на уровне интенсивности 90. Зафиксирована задержка времени в том, чтобы животное отодвигает лапу от источника тепла. Если движение не происходит в течение 20 секунд, тест прерывается, чтобы предотвратить травму.
5. Получить пять испытаний на испытания конечности, за исключением самого высокого и самого низкого значения, прежде чем вычислить среднее время задержки вывода для каждого животного.

6. Послеоперационное моторное тестирование

1. Используя беговую дорожку для анализа походки и интегрированную платформу анализа программного обеспечения, выберите кандидатов для тестирования беговой дорожки в течение четырех-шести недель после операции.
2. Обрезать все крысы ногти один или два дня до тестирования.
3. Акклиматизировать животных в испытательный зал в течение одного часа перед тестированием, и позволяют в течение одной минуты предварительного испытания ласки, чтобы успокоить беспокойство.
4. Размещая крысу внутри беговой дорожки, бегите на беговой дорожке при испытаниях увеличения скорости, от 10 см/с, до 14 см/с, к цели 18 см/с. Если крыса сдержана и не может быть уговорен ходить, прервать тестирование в тот день, чтобы избежать негативных кондиционирования. Разрешить высоким исполнителям ходить до 24 см / с.
5. Промыть аппарат беговой дорожки с 70% этанола между проверенными животными.
6. Параметры Gait — это выход из несвободных программ платформы анализа.

Результаты

Выживание и восстановление зависят от тщательной хирургической техники. Внимание к сосудистым анастомозы и нервных анастомозов, а также костной коапптации, как описано выше, имеет решающее значение для максимизации успеха этой модели. Оперативный дизайн и репрезентативные анастомот?...

Обсуждение

Трансплантация конечностей, под более широкой категорией сосудистого компонента аллотрансплантации (VCA), широко применяется терапевтические перспективы до сих пор невыполненными. Основные препятствия лежат в нерешенных иммунологических вопросов, уникальных для VCA и нейромоторных ме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Vet Equip	911103
0.5cc syringe	Exel	26018
18-gauge needle	BD	305196
1cc syringe	BD	309659
22-gauge needle	BD	305156
24-gauge angiocatheter	Sur-Vet	SROX2419V
25-gauge needle	Exel	26403
3 cc syringe	BD	309657
5cc syringe	Exel	26230
Alcohol	Fisher Scientific	HC-600-1GAL
Anesthesia induction chamber	Vet Equip	941443
Anesthetic gas scavenger system	Vet Equip	931401
Bipolar electrocautery	Aura	26-500
Bitter Spray Mist	Henry Schein	5553
Bone wax	CP Medical	CPB31A
Breathing circuit	Vet Equip	921413
Buprenophine	Reckitt Benckiser	12496075705
Castro-Viejos needle drivers	Roboz	RS-6416
Cordless rotary saw	Dremel	8050-N/18
Cotton swab stick	Fisher Scientific	23-400-101	For hemostasis
DigiGait Appparatus and Software	Mouse Specifics	MSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4)	Roboz	RS-4972
Dumont forceps (#5)	Roboz	RS-5035
Enrofloxacin	Norbrook	ANADA 200-495
FK-506	Astellas	301601
Gauze	Kendall	1903
Gauze	Covidien	8044
Gloves	Microflex	DGP-350-M
Hair clippers	Oster	078005-010-003
Handheld monopolar electrocautery	Bovie	AA00
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy	37370
Heating pad	Walgreens	126987
Heparin	Fresenius Kabi	42592K
Hot plate	Corning	PC-351	For warming resusscitation fluid
Isoflurane	Henry Schein	29405
Lactated ringers	Baxter	2B2074
Large petri dish	Fisher Scientific	FB0875713	For donor graft while in chilled saline
Meloxicam	Henry Schein	49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841
Microfibrillar collagen powder	BD	1010590	For hemostasis
Microvascular clips	Roboz	RS-5420
Normal saline	Baxter	2F7124
Opthalmic lube	Dechra	IS4398
Rapmycin	MedChem Express	HY-10219
Small petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	For warmed resusscitation fluid
Sterile drapes	ProAdvantage	N207100
Surgical gown	Cardinal Health	9511
Surgical mask	3M	1805
Surgical microscope, optic model OPMIMD	Zeiss	169756
Surgical microscope, Universal S3	Zeiss	243188
Suture 10-0 nylon	Covidien	N2512
Suture 5-0 vicryl	Ethicon	J213H
Suture 7-0 silk tie	Teleflex	103-S
Tape	3M	1530-1
Ultrasonic instrument cleaner	Roboz	RS-9911
Vessel dilation forceps	Roboz	RS-5047