Passer à l’étape suivante : un modèle de transplantation orthotopique orthotopique des membres de l’utérus pour maximiser la récupération fonctionnelle chez les rats

Résumé

Ce protocole présente un modèle robuste et reproductible d’allotransplantation composite vascularisée (VCA) orienté vers l’étude simultanée de l’immunologie et de la récupération fonctionnelle. Le temps investi dans la technique méticuleuse dans une greffe orthotopique droite de membre postérieur de mi-cuisse avec des anastomoses vasculaires cousues à la main et la coaptation neuronale donne la capacité d’étudier la récupération fonctionnelle.

Résumé

La greffe de membre en particulier et l’allotransplantation composite vascularisée (VCA) en général ont la promesse thérapeutique large qui ont été bloquées par les limitations actuelles dans l’immunosuppression et la récupération neuromotrice fonctionnelle. De nombreux modèles animaux ont été développés pour étudier les caractéristiques uniques de VCA, mais ici nous présentons un modèle reproductible robuste de greffe orthotopique de membre postérieur chez les rats conçus pour étudier simultanément les deux aspects de la limitation actuelle de VCA : stratégies d’immunosuppression et rétablissement neuromoteur fonctionnel. Au cœur du modèle repose un engagement à des techniques microchirurgicales méticuleuses et éprouvées comme les anastomoses vasculaires cousues à la main et la coaptation neuronale cousue à la main du nerf fémoral et du nerf sciatique. Cette approche permet de générer des reconstructions durables des membres qui permettent aux animaux plus vivants capables de se réadapter, de reprendre les activités quotidiennes et d’effectuer des tests fonctionnels. Avec le traitement à court terme des agents immunosuppresseurs conventionnels, les animaux allotransplantés ont survécu jusqu’à 70 jours après la transplantation, et les animaux isotransplantés fournissent des contrôles de longue durée au-delà de 200 jours postopératoirement. Les preuves de la récupération fonctionnelle neurologique sont présentes par 30 jours après opératoirement. Ce modèle fournit non seulement une plate-forme utile pour interroger des questions immunologiques propres à la VCA et la régénération nerveuse, mais permet également de tester in vivo de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiquement adaptées à vca.

Introduction

La greffe de membre dans la catégorie plus large de l’allotransplantation vascularisée-composite (VCA) ou de l’allotransplantation composite de tissu (CTA) n’a pas encore rempli sa promesse thérapeutique. Depuis les premières greffes de mains humaines réussies à Lyon, france et Louisville, Kentucky en 1998 et 1999, plus de 100 greffes d’extrémité supérieure ont été effectuées dans le monde entier chez des patients soigneusement sélectionnés¹. L’applicabilité plus large a été bloquée par l’immunosuppression substantielle et la récupération neuromotrice fonctionnelle limitée. Les stratégies actuelles d’immunosuppression entraînent une incidence de 85 % du rejet aigu face à l’incidence de 77 % de l’infection opportuniste². D’autre part, la récupération fonctionnelle après la greffe de main se produit ; les scores moyens de l’incapacité de l’épaule et de la main (DASH) passent de 71 à 43, mais ce niveau de fonction peut tout de même être considéré comme un handicap². Compte tenu de la nature non salvatrice de la greffe des membres, les techniques actuelles doivent être affinées dans les modèles animaux pour passer à l’étape suivante de l’ACV.

Depuis le premier modèle de rat de greffe de membre en 1978³, de nombreux modèles animaux innovants ont été développés pour faire progresser le domaine de VCA⁴, incorporant anastomoses vasculaires menottées pour minimiser le temps opératoire^5,6, hétéro greffes ostéomyocutanées topic pour minimiser l’insulte physiologique à l’animal receveur^7,8,9,10,11, et nouvelles approches immunologiques^7,12,13,14. Le modèle de rat de la greffe orthotopique du membre arrière droit mi-cuisse présentée ici met l’accent sur les techniques microchirurgicales méticuleuses et éprouvées comme les anastomoses vasculaires cousues à la main et la coaptation neuronale comme investissement initial dans une plate-forme modèle robuste et reproductible pour étudier simultanément les deux aspects de la limitation actuelle de vca : stratégies d’immunosuppression et récupération neuromotrice fonctionnelle.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par le Northwestern University Animal Care and Use Committee. Les procédures spécifiques ont été effectuées dans le cadre du protocole IS00001663.

NOTE: Deux souches de rats ont été utilisés, les rats Lewis et Août Copenhague x Irlandais (ACI) rats. Les animaux ont été divisés en trois groupes de traitement : allotransplant sans suppression immunitaire (ACI à Lewis), allotransplant avec suppression immunitaire conventionnelle (ACI à Lewis), et isotransplant (Lewis à Lewis ou ACI à ACI). Lewis est une souche consanguine, tandis que les rats ACI représentent un type sauvage sur-élevé, donc cette combinaison a été choisie pour modéliser la réponse de rejet pire-cas. L’immunosuppression conventionnelle a été administrée sous-cutanéement soit sous forme de rapamycine 1 mg/kg du jour postopératoire (POD) moins 1 à POD 28 ou sous forme de FK506 3 mg/kg de POD 0 à POD 14, puis une fois par semaine par la suite. Les rats mâles et femelles étaient des receveurs admissibles âgés de 8 à 16 semaines, pesant entre 250 et 400 grammes au moment de la chirurgie.

1. Récolte des membres postérieurs droits du donneur

1. Induire l’anesthésie générale avec 5% d’isoflurane dans l’oxygène pur par un vaporisateur avec un système de nettoyage approprié.
2. Confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie avec pincement aux orteils, puis utiliser des tondeuses à cheveux pour couper la fourrure hors du membre arrière droit et le site chirurgical de l’aine droite
3. Baisser l’isoflurane à travers un cône de nez de rongeur à 2-2,5%.
4. Placez la supine de rat avec des membres écartés collés sur les côtés sur une planche d’opération avec un coussin chauffant en dessous. Désinfecter la peau sans poils avec 70% d’alcool à friction et protéger le champ chirurgical avec de la gaze stérile.
5. À l’aide d’un microscope microchirurgical approprié, des instruments microchirurgicaux, et avec un accès facile à l’électrocautésie bipolaire et monopolaire, commencer la dissection.
6. Utilisez des ciseaux pour faire une incision circonférentielle de peau/tissu sous-cutané autour du derrière droit. Commencez dans le pli inguinal medially au même niveau que le ligament inguinal et prolongez dorsale-laterally pour compléter l’incision circumférentielle.
7. Après avoir exposé la couche musculaire directement sous l’incision, disséquer et cautériser les vaisseaux épigastriques superficiels qui mènent de la couche musculaire à la peau proximale / rabat sous-cutané vient de créer.
8. Refléter le rabat proximal superomedially au ligament inguinal et la peau distale / rabat sous-cutané infernal au genou.
9. Utilisez un rétractateur de fil ou une gaze roulée pour aider à exposer le champ.
10. Observez que l’anatomie inguinale du rat est similaire à celle des humains; du côté au médial se trouvent le nerf, l’artère et la veine.
11. Disséquer le nerf fémoral, le diviser brusquement au ligament inguinal, proximal à la bifurcation si possible. Rétractez le nerf divisé de façon inférieure, en le gardant en toute sécurité hors de la voie, couvert sous la gaze humide.
12. En ce qui concerne l’artère fémorale et la veine, utilisez des attaches de soie de 4 cm 7-0 pour rétracter les vaisseaux au lieu de les manipuler directement.
13. Lier toutes les branches des vaisseaux fémoraux comme ils se posent avec 7-0 cravates de soie; diviser les branches entre les liens. Pour les très petites branches, la cautérisation bipolaire peut être utilisée au lieu des liens.
    REMARQUE : Les branches artérielles et veineuses qui nécessitent une division comprennent l’iliaque circonflexe superficielle et les vaisseaux musculaires. L’iliaque circonflexe superficielle est généralement plus grand et semble plonger profondément comme le serait le fémoral profunda chez l’homme, mais le profunda est absent dans le rat¹⁵. Les branches plus distales des vaisseaux fémoraux, comme la branche géniculaire la plus élevée et la branche saphéneuse, ne nécessitent généralement pas de division.
14. Injecter systématiquement 500 unités internationales d’héparine par la veine du pénis dans un donneur de rat mâle. Utilisez la veine épigastrique superficielle si le rat donneur est femelle.
15. Laisser l’héparine circuler systématiquement pendant 2 min avant de passer aux prochaines étapes.
16. Lier l’artère fémorale avec des liens de soie 7-0 aussi proximal au ligament inguinal que possible et diviser entre les liens.
17. Semblable à l’artère, lier et diviser la veine fémorale.
18. Refléter à la fois l’artère et la veine de façon inférieure, en toute sécurité hors de la voie, couvert sous la gaze humide avec le nerf fémoral couvert précédemment. Disséquer les groupes musculaires ventraux, en prenant soin de cautériser tout vaisseau visible qui se pose. Attention à l’hémostase ici permettra de minimiser la perte de sang receveur après reperfusion.
19. Profondément aux groupes de muscle ventral, identifier et diviser fortement le nerf sciatique proximal à ses branches. Trois branches sciatiques sont généralement visibles : tibial, péronéal et sural. Tous les trois doivent être conservés dans le membre donneur. Une quatrième branche cutanée n’est généralement pas observée dans cette dissection^15,16.
20. Terminer à diviser les groupes de muscle ventral et dorsal restants au niveau mi-cuisse avec l’hémostase méticuleuse. Il peut être nécessaire de rétracter le membre medially pour compléter la division des muscles.
21. Transect l’os du fémur à l’étage intermédiaire à l’aide d’une scie rotative sans fil tenue à la main.
22. Après avoir enlevé la greffe de membre du donneur, couper les extrémités liées de soie de l’artère fémorale côté greffe et les souches veineuses, ré-ouvrant ainsi les vaisseaux.
23. Insérez un angiocatheter de calibre 24 dans la souche de l’artère de greffe et rincez la greffe avec 250 unités internationales d’héparine diluées dans 5 mL de solution saline normale glacée, en la regardant s’écouler à travers la veine ouverte.
24. Lentement, rincer doucement la greffe pendant environ 3 min. Un rinçage puissant excessif peut endommager l’endothélium.
25. Placer la greffe dans un plat saline réfrigéré imbriqué dans un seau à glace jusqu’à la transplantation.
26. Euthanasier le rat donneur avec la thoracotomie bilatérale.
27. Nettoyez tous les instruments chirurgicaux de manière appropriée.

2. Amputation du membre arrière droit natif du receveur

1. Induire l’anesthésie avec l’isoflurane à 5%, confirmer la profondeur, couper la fourrure, positionner l’animal, et désinfecter la peau avec de l’alcool comme décrit pour le rat donneur.
2. Isoflurane à 2-2,5% et injection d’analgésie préopératoire sous-cutanée avec buprénorphine 1,2 mg/kg, et prophylaxie préopératoire avec enrofloxacine 7,5 mg/kg.
3. Même pour le donneur, faire une incision circonférentielle dans le pli inguinal, refléter les volets de la peau assurant l’hémostase, et disséquer le nerf fémoral, l’artère et la veine, ligatant les mêmes vaisseaux de branche que ci-dessus.
4. Divisez le nerf fémoral plus distally que pour le donneur, mais proximalement à la bifurcation si possible.
5. Disséquer l’artère fémorale et la veine avec assez d’espace pour serrer chacun séparément au niveau du ligament inguinal. Pincez la veine et l’artère avec des pinces de bouledogue microchirurgicale. Une fois serré, diviser fortement chaque récipient à l’une des ciseaux.
6. Divisez les muscles ventraux et dorsaux de la cuisse au niveau mi-cuisse avec une hémostase méticuleuse, rétractant le membre medially si nécessaire.
7. Identifier et diviser les nerfs sciatiques proximal à leurs points de branche comme ci-dessus.
8. Transect le fémur à mi-arbre à l’aide de la scie.
9. Retirez le membre postérieur droit natif du receveur et disposez-les de façon appropriée.
10. Baisser l’isoflurane à 1-1,5% à travers le cône de nez.

3. Implantation du donneur au receveur des membres

1. À l’aide de la scie à puissance à main, raser toutes les irrégularités du donneur et des extrémités de coupe du fémur receveur.
2. À l’aide de la scie, couper l’extrémité du moyeu d’une aiguille de calibre 18, qui deviendra la tige intramédullaire du fémur.
3. Avant de manipuler l’os, appliquer une petite quantité de cire osseuse sur l’extrémité coupée du femur pour réduire le saignement de moelle pendant le processus de ramage.
4. Coapt le donneur et les os fémoraux receveurs à l’aide de l’aiguille de calibre 18 comme tige intramédullaire. Une certaine force est nécessaire, mais ne rame pas l’os dans la mesure où fracturer le cortex.
5. Au besoin, retirez l’aiguille et coupez-la à une longueur appropriée de sorte que les deux os s’adaptent en douceur sur l’aiguille sans qu’aucune aiguille ne se manifeste entre l’os.
6. Placez un petit support comme un tampon de gaze ou une petite roche ou de l’argile de modélisation sous le membre donneur pour le garder hors tension.
7. Reapproximate les groupes de muscle ventral avec huit à dix sutures simples interrompues 5-0 polyglactine de sorte que la greffe ne tourne pas autour de l’aiguille du fémur. Cela donne la stabilité des membres pour les anastomoses.
8. Irriguer périodiquement la greffe et le champ chirurgical avec de la solution saline glacée pour une meilleure visualisation et pour réduire les lésions de reperfusion ischémiques chaudes.
9. Alignez les artères fémorales du donneur et du receveur et anastomosez-les de façon de bout en bout à l’aide d’une simple suture en nylon interrompue 10-0, évitant à la fois la tension et la boucle. L’artère nécessite en moyenne six sutures.
10. Semblable à l’artère, anastomose le donneur et les veines fémorales de fin à fin. La veine nécessite six à huit sutures.
    REMARQUE : L’irrigation saline froide généreuse, la technique de manutention des navires atraumatiques et le fait de laisser de longues queues servir de sutures de séjour pour la rétraction des navires sont des outils importants pour des anastomoses microchirurgicales efficaces.
11. Placez une petite quantité de poudre de cellulose hémostique autour des deux anastomoses, puis retirez les pinces microchirurgicales proximales de bouledogue sur la veine et l’artère.
12. Inspecter les deux anastomoses pour une bonne patence et le débit. Utilisez des bâtonnets de coton-tige pour pousser doucement la veine et assurer une bonne hémostase des deux anastomoses. Maintenez la pression sur les sites de saignement et placez plus de poudre de cellulose hémostatique si nécessaire. Une autre suture peut être placée à travers un trou de saignement au risque de « back-walling » l’aiguille seulement en dernier recours.
13. Lorsque les deux anastomoses sont confirmées satisfaisantes, couper les queues de suture longue séjour restant court pour correspondre aux autres.
14. Repositionnez le rat à la position latérale gauche de decubitus, utilisez l’électrocautéuté libéral pour atteindre l’hémostase méticuleuse de n’importe quel saignement de muscle de reperfusion.
15. Tournez l’attention vers les anastomoses nerveuses une fois que l’hémostase musculaire est assurée. Coupez en arrière toutes les extrémités de coupe de nerf qui semblent en lambeaux.
16. Reapproximate les groupes de muscle dorsal sous le nerf sciatique avec des sutures simples interrompues de polyglactine 5-0.
17. Reapproximate le nerf sciatique. Huit à dix 10-0 neural simple sutures interrompues de nylon suffira habituellement.
18. Reapproximate les groupes de muscles dorsaux rappelant, puis fermer la peau dorsale avec 4-0 polyglactine suture continue.
19. Repositionnez le rat en position de supination et reapproximate le nerf fémoral. Deux à trois 10-0 nealnal en nylon simple sutures interrompues suffiront habituellement.
20. Fermez la peau ventrale avec la suture continue de 4-0 polyglactine. Évitez l’excès de suture, ce qui peut irriter le rat une fois réveillé.

4. Soins postopératoires

1. Récupérer les animaux dans leurs cages avec un coussin chauffant sous la cage et un accès facile à la nourriture et à l’eau, en surveillant les complications précoces tous les jours pendant la première semaine.
2. Fournir une analgésique postopératoire avec une injection sous-cutanée de meloxicam 1 mg/kg par injection quotidienne par l’intermédiaire du POD 2. Fournir une prophylaxie antibiotique postopératoire dilue enrofloxacine. Fournir un facteur dissuasif pour l’autotomie (automutilation) avec Bitter Safe Mist pulvérisé deux fois par jour à la greffe par pod 7.
3. Maintenir les rats transplantés dans des cages avec d’autres rats, pour stimuler le retour aux activités quotidiennes et réhabiliter le membre transplanté.

5. Test de sensation postopératoire

1. Appliquer l’essai Hargreaves du protocole de sensation thermique, également décrit ailleurs^17,18.
2. Placez le rat dans le récipient d’essai et lui permettez de s’acclimater pendant 20 minutes. Le verre de l’appareil est confirmé propre, et la source de chaleur a confirmé travailler avec le doigt de l’enquêteur.
3. Avant de tester, confirmez que le rat est éveillé et que la patte testée est positionnée au-dessus du détecteur de mouvement infrarouge.
4. Transmettre l’énergie thermique au niveau d’intensité 90. Le délai dans le déplacement de la patte de l’animal loin de la source de chaleur est enregistré. Si aucun mouvement ne se produit dans les 20 secondes, le test est interrompu pour prévenir les blessures.
5. Obtenir cinq essais par membre testé, à l’exclusion de la valeur la plus élevée et la plus basse avant de calculer le temps de latence moyen de retrait pour chaque animal.

6. Essais moteurs postopératoires

1. À l’aide d’un tapis roulant d’analyse de démarche et d’une plate-forme intégrée d’analyse logicielle, sélectionnez les candidats aux tests sur tapis roulant à quatre à six semaines après la chirurgie.
2. Couper tous les ongles d’orteil des rats un ou deux jours avant l’essai.
3. Acclimater les animaux à la salle d’essai pendant une heure avant les tests, et laisser une minute de caresses pré-test pour calmer l’anxiété.
4. Placer le rat à l’intérieur du tapis roulant, exécuter le tapis roulant à des essais de vitesse croissante, de 10 cm/s, à 14 cm/s, à l’objectif 18 cm/s. Si le rat est réticent et ne peut pas être incité à marcher, interrompre les tests ce jour-là pour éviter le conditionnement négatif. Permettre aux personnes performantes de marcher jusqu’à 24 cm/s.
5. Rincez l’appareil tapis roulant avec 70% d’éthanol entre les animaux testés.
6. Les paramètres de Gait sont issus du logiciel propriétaire de la plate-forme d’analyse.

Résultats

La survie et la récupération dépendent d’une technique chirurgicale méticuleuse. L’attention aux anastomoses vasculaires et aux anastomoses neuronales, ainsi qu’à la coaptation osseuse telle que décrite ci-dessus est cruciale pour maximiser le succès de ce modèle. La conception opérationnelle et les résultats anastomotiques représentatifs sont indiqués à la figure 1.

La mortalité globale dépendait de la stratégie d’immunosuppression, la maj...

Discussion

La greffe de membre, dans la catégorie plus large de l’allotransplantation vascularisée de composant (VCA), a la promesse thérapeutique largement applicable encore non remplie. Les principaux obstacles se trouvent dans les questions immunologiques non résolues propres à vca et les techniques de récupération neuromoteur utilisés actuellement. Le développement de nouvelles techniques dépendra de la modélisation animale qui est flexible, robuste et reproductible.

De nombreux modèles...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Vet Equip	911103
0.5cc syringe	Exel	26018
18-gauge needle	BD	305196
1cc syringe	BD	309659
22-gauge needle	BD	305156
24-gauge angiocatheter	Sur-Vet	SROX2419V
25-gauge needle	Exel	26403
3 cc syringe	BD	309657
5cc syringe	Exel	26230
Alcohol	Fisher Scientific	HC-600-1GAL
Anesthesia induction chamber	Vet Equip	941443
Anesthetic gas scavenger system	Vet Equip	931401
Bipolar electrocautery	Aura	26-500
Bitter Spray Mist	Henry Schein	5553
Bone wax	CP Medical	CPB31A
Breathing circuit	Vet Equip	921413
Buprenophine	Reckitt Benckiser	12496075705
Castro-Viejos needle drivers	Roboz	RS-6416
Cordless rotary saw	Dremel	8050-N/18
Cotton swab stick	Fisher Scientific	23-400-101	For hemostasis
DigiGait Appparatus and Software	Mouse Specifics	MSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4)	Roboz	RS-4972
Dumont forceps (#5)	Roboz	RS-5035
Enrofloxacin	Norbrook	ANADA 200-495
FK-506	Astellas	301601
Gauze	Kendall	1903
Gauze	Covidien	8044
Gloves	Microflex	DGP-350-M
Hair clippers	Oster	078005-010-003
Handheld monopolar electrocautery	Bovie	AA00
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy	37370
Heating pad	Walgreens	126987
Heparin	Fresenius Kabi	42592K
Hot plate	Corning	PC-351	For warming resusscitation fluid
Isoflurane	Henry Schein	29405
Lactated ringers	Baxter	2B2074
Large petri dish	Fisher Scientific	FB0875713	For donor graft while in chilled saline
Meloxicam	Henry Schein	49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841
Microfibrillar collagen powder	BD	1010590	For hemostasis
Microvascular clips	Roboz	RS-5420
Normal saline	Baxter	2F7124
Opthalmic lube	Dechra	IS4398
Rapmycin	MedChem Express	HY-10219
Small petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	For warmed resusscitation fluid
Sterile drapes	ProAdvantage	N207100
Surgical gown	Cardinal Health	9511
Surgical mask	3M	1805
Surgical microscope, optic model OPMIMD	Zeiss	169756
Surgical microscope, Universal S3	Zeiss	243188
Suture 10-0 nylon	Covidien	N2512
Suture 5-0 vicryl	Ethicon	J213H
Suture 7-0 silk tie	Teleflex	103-S
Tape	3M	1530-1
Ultrasonic instrument cleaner	Roboz	RS-9911
Vessel dilation forceps	Roboz	RS-5047