Dando o próximo passo: um modelo de transplante ortotópico ortotópico de coaptation ortotópico para maximizar a recuperação funcional em ratos

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo robusto e reprodutível de alotransplante composto vascularizado (VCA) voltado para o estudo simultâneo de imunologia e recuperação funcional. O tempo investido em técnica meticulosa em um transplante ortotópico do membro traseiro da coxa direita com anastomoses vasculares costurados à mão e coaptation neural produz a capacidade de estudar a recuperação funcional.

Resumo

O transplante de membros em particular e alotransplante composto vascularizado (VCA) em geral têm ampla promessa terapêutica que foram esticadas por limitações atuais na imunossupressão e recuperação neuromotora funcional. Muitos modelos animais foram desenvolvidos para estudar características únicas do VCA, mas aqui apresentamos um modelo robusto reprodutível de transplante de membros traseiros ortotópicos em ratos projetados para investigar simultaneamente ambos os aspectos da atual limitação do VCA: estratégias de imunossupressão e recuperação neuromotora funcional. No núcleo do modelo está um compromisso com técnicas microcirúrgicas meticulosas e testadas pelo tempo, como anastomoses vasculares costurados à mão e coaptação neural costurada à mão do nervo femoral e do nervo ciático. Essa abordagem produz reconstruções duradouras de membros que permitem animais mais vivos capazes de reabilitação, retomada das atividades diárias e testes funcionais. Com tratamento de curto prazo de agentes imunossupressores convencionais, animais aotransplantados sobreviveram até 70 dias após o transplante, e animais isotransplantados fornecem controles de longa duração além de 200 dias pós-operatórios. Evidências de recuperação neurológica funcional estão presentes por 30 dias após o funcionamento. Este modelo não só fornece uma plataforma útil para interrogar questões imunológicas exclusivas do VCA e da regeneração nervosa, mas também permite testes in vivo de novas estratégias terapêuticas especificamente adaptadas para VCA.

Introdução

O transplante de membros sob a categoria mais ampla de alotransplante vascularizada composta (VCA) ou alotransplante de tecido composto (CTA) ainda não cumpriu sua promessa terapêutica. Desde os primeiros transplantes de mão humana bem sucedidos em Lyon, França e Louisville, Kentucky, em 1998 e 1999, mais de 100 transplantes de extremidade superior foram realizados em todo o mundo em pacientes cuidadosamente selecionados¹. A aplicabilidade mais ampla tem sido esticada por imunossupressão substancial e recuperação neuromotora funcional limitada. As estratégias atuais de imunossupressão resultam em 85% de incidência de rejeição aguda diante de 77% de incidência de infecção oportunista². Por outro lado, ocorre recuperação funcional após transplante de mão; significa que as pontuações de Incapacidade de Ombro e Mão de Braço (DASH) melhoram de 71 para 43, mas esse nível de função ainda pode se qualificar como uma deficiência². Dada a natureza não-salvação da vida do transplante de membros, as técnicas atuais devem ser refinadas em modelos animais para dar o próximo passo no VCA.

Desde o primeiro modelo de transplante de membros de ratos em 1978³, muitos modelos animais inovadores foram desenvolvidos para avançar no campo do VCA⁴, incorporando anastomosas assarçadas vasculares para minimizar o tempo de operação^5,6, heterotópico transplantes osteomicossológicos para minimizar o insulto fisiológico ao animal receptor^{7,,8,,9,,10,11}, e novas abordagens imunológicas^7,,12,,13,14. O modelo de rato do transplante ortotópico do membro traseiro direito da coxa apresentada aqui enfatiza técnicas microcirúrgicas meticulosas e testadas pelo tempo, como anastomoses vasculares costurados à mão e coaptação neural como um investimento inicial em uma plataforma modelo robusta e reprodutível para investigar simultaneamente ambos os aspectos da atual limitação do VCA: estratégias de imunossupressão e recuperação neuromotora funcional.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade northwestern. Os procedimentos específicos foram realizados sob o protocolo IS00001663.

NOTA: Foram utilizados dois tipos de ratos, ratos de Lewis e ratos de August Copenhague x Irlandês (ACI). Os animais foram divididos em três grupos de tratamento: aotransplante sem supressão imunológica (ACI para Lewis), aotransplante com supressão imunológica convencional (ACI para Lewis), e isotransplante (Lewis para Lewis ou ACI para ACI). Lewis é uma cepa de raça, enquanto os ratos ACI representam um tipo selvagem de raça, portanto essa combinação foi escolhida para modelar a resposta de rejeição pior caso. A imunossupressão convencional foi administrada subcutâneamente como rapamicina 1 mg/kg do dia pós-operatório (POD) menos 1 para POD 28 ou como FK506 3 mg/kg de POD 0 a POD 14, e depois uma vez por semana. Tanto os ratos do sexo masculino quanto o feminino foram beneficiários elegíveis de 8 a 16 semanas de idade, pesando entre 250 e 400 gramas no momento da cirurgia.

1. Colher de membro traseiro direito do doador

1. Induzir anestesia geral com 5% de isoflurane em oxigênio puro através de um vaporizador com um sistema de limpeza apropriado.
2. Confirme a profundidade adequada da anestesia com a beliscão do dedo do pé e, em seguida, use cortadores de cabelo para cortar a pele do membro traseiro direito e local cirúrgico da virilha direita
3. Para baixo, o isoflurane através de um cone de nariz de roedores para 2-2,5%.
4. Posicione o supino do rato com membros espalhados colados nas laterais em uma placa de operação com uma almofada de aquecimento por baixo. Desinfete a pele sem pelos com 70% de álcool esfregando e proteja o campo cirúrgico com gaze estéril.
5. Usando um microscópio microcirúrgico adequado, instrumentos microcirúrgicos e com fácil acesso à eletrocauteria bipolar e monopolar, inicie a dissecção.
6. Use uma tesoura para fazer uma incisão de pele circunferencial/tecido subcutâneo ao redor da mola direita. Comece na linha inguinal mediadamente no mesmo nível do ligamento inguinal e estenda dormente lateralmente para completar a incisão circunferencial.
7. Tendo exposto a camada muscular diretamente abaixo da incisão, dissecotar e cauterizar os vasos epigástricos superficiais que levam da camada muscular à pele proximal/reta subcutânea apenas criada.
8. Reflita o retalho proximal superomedialmente ao ligamento inguinal e ao retalho distal/subcutâneo inferolateramente ao joelho.
9. Use um retrátil de arame ou gaze enrolada para ajudar a expor o campo.
10. Observe que a anatomia inguinal do rato é semelhante aos humanos; de lateral para medial reside o nervo, artéria e veia.
11. Disseque o nervo femoral, divida-o bruscamente no ligamento inguinal, proximal à bifurcação, se possível. Retraia o nervo dividido inferiormente, mantendo-o seguro fora do caminho, coberto sob gaze úmida.
12. Voltando a atenção para a artéria femoral e veia, use laços de seda de 4 cm 7-0 para retrair atraumaticamente os vasos em vez de manuseá-los diretamente.
13. Ligar todos os ramos dos vasos femorais à medida que surgem com laços de seda 7-0; dividir os ramos entre os laços. Para ramos muito pequenos, o cautery bipolar pode ser usado em vez de gravatas.
    NOTA: Os ramos arterial e venoso que requerem divisão incluem o ilílico circunflexo superficial e os vasos musculares. O ilíado circunflexo superficial é geralmente maior e parece mergulhar fundo como seria o fémoral profundo em humanos, mas o profundo está ausente no rato¹⁵. Mais ramos distais dos vasos femorais, como o mais alto genicular e o ramo safeno, geralmente não requerem divisão.
14. Injetar sistematicamente 500 unidades internacionais de heparina através da veia peniana em um doador de ratos masculino. Use a veia epigástrica superficial se o rato doador for do sexo feminino.
15. Deixe a heparina circular sistemicamente por 2 minutos antes de prosseguir com os próximos passos.
16. Liga a artéria femoral com laços de seda 7-0 tão proximal ao ligamento inguinal quanto possível e divida entre os laços.
17. Semelhante à artéria, liga e divida a veia femoral.
18. Reflita tanto a artéria quanto a veia inferiormente, com segurança para fora do caminho, cobertas sob gaze úmida junto com o nervo femoral coberto anteriormente. Disseca os grupos musculares ventrais, tomando o cuidado de cauterizar qualquer vaso visível que surgir. A atenção à hemostasia aqui minimizará a perda de sangue do receptor após a reperfusão.
19. Profundo aos grupos musculares ventrais, identifique e divida bruscamente o nervo ciático proximal aos seus ramos. Três ramos ciáticos são geralmente visíveis: tibial, peroneal e sural. Todos os três devem ser preservados no membro doador. Um quarto ramo cutâneo não é tipicamente visto nesta dissecação^15,16.
20. Finalize dividindo os restantes grupos musculares ventral e dorsal no nível médio da coxa com hemostasia meticulosa. Pode ser necessário retrair o membro medialmente para completar a divisão dos músculos.
21. Transecte o osso do fêmur no meio do poço usando uma serra rotativa sem fio portátil.
22. Tendo removido o enxerto de membro do doador, cortou as pontas amarradas de seda da artéria femoral do lado do enxerto e tocos de veia, reabrindo assim os vasos.
23. Insira um angiocateter de 24 bitolas no toco da artéria do enxerto e lave o enxerto com 250 unidades internacionais de heparina diluída em 5 mL de soro fisiológico normal, observando-o fluir pela veia aberta.
24. Lentamente, levemente lave o enxerto por cerca de 3 minutos. O excesso de descarga forte pode danificar o endotélio.
25. Coloque o enxerto em um prato salino refrigerado aninhado em um balde de gelo até o transplante.
26. Eutanize o rato doador com toracotomia bilateral.
27. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos adequadamente.

2. Amputação do membro traseiro direito nativo do receptor

1. Induzir anestesia com isoflurane a 5%, confirmar profundidade, aparar a pele, posicionar o animal e desinfetar a pele com álcool como descrito para o rato doador.
2. Isotipado de 1,2 mg/kg para baixo e injete analgesia pré-operatória subcutânea com buprenorfina 1,2 mg/kg, e profilaxia pré-operatória com enrofloxacina 7,5 mg/kg.
3. O mesmo que para o doador, faça uma incisão circunferencial no vinco inguinal, reflita os retalhos da pele assegurando hemostasia, e disseque o nervo femoral, artéria e veia, ligando os mesmos vasos de ramificação acima.
4. Divida o nervo femoral mais distally do que para o doador, mas proximalmente para a bifurcação, se possível.
5. Disseque a artéria femoral e a veia com espaço suficiente para fixar cada uma separadamente ao nível do ligamento inguinal. Fixar a veia e a artéria com grampos de buldogue microcirúrgico. Uma vez preso, divida cada vaso bruscamente com uma tesoura.
6. Divida os músculos ventral e dorsal da coxa no nível médio da coxa com hemostasia meticulosa, retraindo o membro mediadamente conforme necessário.
7. Identifique e divida os nervos ciáticos proximal aos seus pontos de ramificação como acima.
8. Transecte o fêmur no meio do poço usando a serra.
9. Remova o membro traseiro direito nativo do receptor e descarte adequadamente.
10. Para baixo, o isoflurane é de 1-1,5% através do cone do nariz.

3. Doador para implantação de membro receptor

1. Usando a serra elétrica portátil, raspe todas as irregularidades das extremidades de corte do doador e do fêmur receptor.
2. Usando a serra, corte a extremidade do cubo de uma agulha de calibre 18, que se tornará a haste intramedusária do fêmur.
3. Antes de manipular o osso, aplique uma pequena quantidade de cera óssea na extremidade cortada do osso do fêmur para reduzir o sangramento da medula durante o processo de reaming.
4. Coapt o doador e receptor ossos femorais usando a agulha de calibre 18 como uma haste intramedusária. Alguma força é necessária, mas não resma nenhum dos ossos até a fratura do córtex.
5. Conforme necessário, remova a agulha e corte-a em um comprimento apropriado para que ambos os ossos se encaixem suavemente sobre a agulha sem nenhuma agulha aparecendo entre o osso.
6. Coloque um pequeno suporte, como uma almofada de gaze ou uma pequena rocha ou argila modeladora sob o membro doador para mantê-lo fora da tensão.
7. Reaproximar os grupos musculares ventrais com oito a dez simples suturas de poliglactina interrompidas 5-0 para que o enxerto não gire ao redor da agulha do fêmur. Isso dá estabilidade ao membro para os anastomoses.
8. Irrigar periodicamente o enxerto e o campo cirúrgico com soro fisiológico gelado para melhor visualização e para reduzir a lesão isquêmica quente de reperfusão.
9. Alinhe as artérias femorais do doador e receptor e anastomose-as de ponta a ponta usando sutura de nylon 10-0 interrompida simples, evitando tanto tensão quanto looping. A artéria requer uma média de seis suturas.
10. Semelhante à artéria, anastomose as veias femorais do doador e receptor de ponta a ponta. A veia requer seis a oito suturas.
    NOTA: A generosa irrigação salina fria, a técnica de manuseio de vasos atrauáticos e deixar caudas longas para servir como suturas de permanência para retração de vasos são ferramentas importantes para anastomos microcirúrgicos eficazes.
11. Coloque uma pequena quantidade de pó de celulose hemostática ao redor de ambos os anastomoses e, em seguida, remova os grampos microcirúrgicos proximais na veia e na artéria.
12. Inspecione ambos os anastomoses para obter boa patência e fluxo. Use penurinhas para cutucar suavemente a veia e garantir uma boa hemostasia de ambas as anastomoses. Segure a pressão sobre os locais de sangramento e coloque mais pó de celulose hemostática, se necessário. Outra sutura pode ser colocada através de um buraco sangrento sob o risco de "parede traseira" da agulha apenas como último recurso.
13. Quando ambas as anastomoses forem confirmadas satisfatórias, corte todas as caudas de sutura de longa permanência restantes curtas para coincidir com as outras.
14. Reposicione o rato para a posição de decúbito lateral esquerdo, use eletrocauteria liberal para atingir hemostasia meticulosa de qualquer sangramento muscular de reperfusão.
15. Volte a atenção para os anastomoses nervosos uma vez que a hemostasia muscular é assegurada. Corte para trás quaisquer extremidades de corte nervoso que pareçam irregulares.
16. Reaproximar os grupos musculares dorsais sob nervo ciático com simples suturas de poliglactina interrompidas 5-0.
17. Reaproximar o nervo ciático. Oito a dez 10-0 suturas simples e interrompidas de nylon geralmente serão suficientes.
18. Reaproximar os grupos musculares dorsais que lembram e, em seguida, fechar a pele dorsal com 4-0 sutura contínua de poliglactina.
19. Reposicione o rato de volta à posição suposição e reaproximar o nervo femoral. Duas a três suturas simples e interrompidas neurais de nylon de 10 a 0 geralmente serão suficientes.
20. Feche a pele ventral com sutura contínua de poliglactina 4-0. Evite o excesso de sutura, o que pode ser irritante para o rato uma vez acordado.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Recuperar animais em suas gaiolas com uma almofada de aquecimento sob a gaiola e acesso pronto à comida e água, monitorando as complicações precoces diariamente durante a primeira semana.
2. Forneça analgesia pós-operatória com meloxicam subcutânea 1 mg/kg de injeção diária através do POD 2. Fornecer profilaxia antibiótica pós-operatória diluir spray enrofloxacina. Forneça desincentivo para autotomia (automutilação) com Bitter Safe Mist pulverizada duas vezes por dia para o enxerto através do POD 7.
3. Manter ratos transplantados em gaiolas com outros ratos, estimular o retorno às atividades diárias e reabilitar o membro transplantado.

5. Teste de sensação pós-operatória

1. Aplique o teste Hargreaves do protocolo de sensação térmica, também descrito em outros lugares^17,18.
2. Coloque o rato no recipiente de teste e permitiu que ele se aclimatasse por 20 minutos. O vidro do aparelho está confirmado limpo, e a fonte de calor confirmou estar trabalhando com o dedo do investigador.
3. Antes do teste, confirme que o rato está acordado e a pata testada está posicionada sobre o detector de movimento infravermelho.
4. Transmita energia térmica no nível de intensidade 90. O atraso de tempo no animal que afasta a pata da fonte de calor é registrado. Se não ocorrer movimento dentro de 20 segundos, o teste é abortado para evitar lesões.
5. Obtenha cinco ensaios por membro testado, excluindo o maior e menor valor antes de calcular o tempo médio de latência de retirada para cada animal.

6. Teste motor pós-operatório

1. Usando uma esteira de análise de marcha e plataforma integrada de análise de software, selecione candidatos para testes de esteira em quatro a seis semanas após a cirurgia.
2. Corte todas as unhas dos dentes de rato um ou dois dias antes do teste.
3. Aclimatize os animais para a sala de testes por uma hora antes do teste, e permita um minuto de pré-teste para acalmar a ansiedade.
4. Colocando o rato dentro da esteira, corra a esteira em testes de velocidade crescente, de 10 cm/s, para 14 cm/s, até a meta de 18 cm/s. Se o rato estiver reticente e não puder ser persuadido a andar, aborte os testes naquele dia para evitar condicionamento negativo. Permita que os artistas de alto desempenho caminhem até 24 cm/s.
5. Enxágüe o aparelho da esteira com 70% de etanol entre os animais testados.
6. Os parâmetros de marcha são a saída do software proprietário da plataforma de análise.

Resultados

Sobrevivência e recuperação dependem de técnica cirúrgica meticulosa. A atenção aos anastomoses vasculares e aos anastomoses neurais, bem como à coaptação óssea descrita acima, é crucial maximizar o sucesso deste modelo. O desenho operacional e os resultados anastomóticos representativos são mostrados na Figura 1.

A mortalidade geral dependia da estratégia de imunossupressão, com a maioria dos animais isotransplantados alcançando o ponto final do ...

Discussão

O transplante de membros, sob a categoria mais ampla de alotransplante de componentes vascularizados (VCA), tem uma promessa terapêutica amplamente aplicável ainda não cumprida. Os principais bloqueios estão em questões imunológicas não resolvidas exclusivas das técnicas de recuperação de VCA e neuromotores utilizadas atualmente. O desenvolvimento de novas técnicas dependerá da modelagem animal flexível, robusta e reprodutível.

Muitos modelos animais foram estabelecidos em VCA, c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	Vet Equip	911103
0.5cc syringe	Exel	26018
18-gauge needle	BD	305196
1cc syringe	BD	309659
22-gauge needle	BD	305156
24-gauge angiocatheter	Sur-Vet	SROX2419V
25-gauge needle	Exel	26403
3 cc syringe	BD	309657
5cc syringe	Exel	26230
Alcohol	Fisher Scientific	HC-600-1GAL
Anesthesia induction chamber	Vet Equip	941443
Anesthetic gas scavenger system	Vet Equip	931401
Bipolar electrocautery	Aura	26-500
Bitter Spray Mist	Henry Schein	5553
Bone wax	CP Medical	CPB31A
Breathing circuit	Vet Equip	921413
Buprenophine	Reckitt Benckiser	12496075705
Castro-Viejos needle drivers	Roboz	RS-6416
Cordless rotary saw	Dremel	8050-N/18
Cotton swab stick	Fisher Scientific	23-400-101	For hemostasis
DigiGait Appparatus and Software	Mouse Specifics	MSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4)	Roboz	RS-4972
Dumont forceps (#5)	Roboz	RS-5035
Enrofloxacin	Norbrook	ANADA 200-495
FK-506	Astellas	301601
Gauze	Kendall	1903
Gauze	Covidien	8044
Gloves	Microflex	DGP-350-M
Hair clippers	Oster	078005-010-003
Handheld monopolar electrocautery	Bovie	AA00
Hargreaves Apparatus	Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy	37370
Heating pad	Walgreens	126987
Heparin	Fresenius Kabi	42592K
Hot plate	Corning	PC-351	For warming resusscitation fluid
Isoflurane	Henry Schein	29405
Lactated ringers	Baxter	2B2074
Large petri dish	Fisher Scientific	FB0875713	For donor graft while in chilled saline
Meloxicam	Henry Schein	49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841
Microfibrillar collagen powder	BD	1010590	For hemostasis
Microvascular clips	Roboz	RS-5420
Normal saline	Baxter	2F7124
Opthalmic lube	Dechra	IS4398
Rapmycin	MedChem Express	HY-10219
Small petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	For warmed resusscitation fluid
Sterile drapes	ProAdvantage	N207100
Surgical gown	Cardinal Health	9511
Surgical mask	3M	1805
Surgical microscope, optic model OPMIMD	Zeiss	169756
Surgical microscope, Universal S3	Zeiss	243188
Suture 10-0 nylon	Covidien	N2512
Suture 5-0 vicryl	Ethicon	J213H
Suture 7-0 silk tie	Teleflex	103-S
Tape	3M	1530-1
Ultrasonic instrument cleaner	Roboz	RS-9911
Vessel dilation forceps	Roboz	RS-5047