JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için murin kahverengi adipositlerin izole edilmesinde yeni bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Kahverengi yağ dokusu (BAT) memelilerde titremeyen termojenezden sorumludur ve kahverengi adipositler (BA'lar) BAT'ın fonksiyonel birimleridir. BA'lar hem multiloküler lipid damlacıkları hem de bol miktarda mitokondri içerir ve ayrışma proteini 1'i (UCP1) eksprese ederler. BA'lar, kökenlerine göre iki alt tipe ayrılır: embriyo kaynaklı klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositlerden türetilmiş BA'lar. Nispeten düşük yoğunlukları nedeniyle, BA'lar geleneksel santrifüjleme yöntemiyle BAT'tan izole edilemez. Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları farelerden izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokolde, yetişkin farelerden interskapuler BAT, Kollajenaz ve Dispase çözeltisi ile sindirildi ve ayrışmış BA'lar% 6 iyodiksanol çözeltisi ile zenginleştirildi. İzole BA'lar daha sonra RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı izolasyonu için Trizol reaktifi ile lize edildi. RNA izolasyonundan sonra, lizatın organik fazı protein ekstraksiyonu için kullanıldı. Verilerimiz,% 6'lık iyotiksanol çözeltisinin, takip geni ve protein ekspresyon çalışmalarına müdahale etmeden BA'ları verimli bir şekilde zenginleştirdiğini göstermiştir. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörüdür. Kahverengi yağ dokusu ile karşılaştırıldığında, izole BA'lar Pdgfa'nın anlamlı derecede daha yüksek ekspresyonuna sahipti. Özetle, bu yeni yöntem, kahverengi adipositlerin biyolojisini tek bir hücre tipi seviyesinde incelemek için bir platform sağlar.

Giriş

Hem fareler hem de insanlar iki tür yağ dokusuna sahiptir: beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT)1. WAT enerjiyi beyaz adipositlerde trigliseritler şeklinde depolar ve BAT'ın kahverengi adipositleri (BA'lar) kimyasal enerjiyi ısı2 olarak dağıtır. Gelişimsel kökenlerine bağlı olarak, BA'lar embriyo gelişimi sırasında oluşan klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositler türevi BA'lar (stres koşulları altında beyaz adipositlerden dönüştürülen bej / brit hücreleri) olarak kategorize edilir3. BA'lar multilokülerdir ve termojenik protein ayrışma proteini 1'i (UCP1)4 eksprese eder. İnterskapüler BAT (iBAT) deposu, küçük memelilerde birincil cBA depolarından biridir5, bej hücreler ise WAT6 içinde dağılmıştır.

Enerjiyi dağıtma doğası gereği, BA'lar obeziteyi azaltmak için terapötik bir hedef olarak çok dikkat çekmiştir7. Obeziteyi tedavi etmek amacıyla BA'lardan yararlanmak için, BA'ların işlevini, hayatta kalmasını ve işe alımını kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir. BAT ve WAT gibi yağ dokuları heterojendir. Adipositler dışında, yağ dokuları endotel hücreleri, mezenkimal kök hücreler ve makrofajlar8 gibi birçok başka hücre tipi içerir. UCP1: Cre hat9 gibi farelerde aday genleri spesifik olarak tüketmek için genetik araçlar mevcut olsa da, BA'ları BAT veya WAT'tan arındırma teknikleri sınırlıdır ve bu da BA'ları tek hücreli tip düzeyinde incelemeyi zorlaştırmaktadır. Ek olarak, saf BA'lar elde edilmeden, BA'lar ve BA'lar olmayanlar arasındaki ilişki açıkça tanımlanmayacaktır. Örneğin, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa), farklılaşmamış mezenkimal hücreler için bir belirteç olarak kullanılmıştır ve BAT'nin endotel ve interstisyel hücrelerinde eksprese edilir. Soğuk stresli BAT'ta, PDGFRα pozitif progenitör hücreler yeni BA10'a yol açar. PDGFRa, mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörü olan ligand PDGF'si tarafından aktive edilir11; Bununla birlikte, BA'ların PDGF'yi salgılayarak PDGFRα pozitif progenitör hücrelerin davranışını etkileyip etkilemediği açık değildir.

Son zamanlarda, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamaya (FACS) dayanan bir BA izolasyon protokolü yayınlanmıştır12. Bu protokolde, BA'ları BA olmayanlardan ayırmak için% 3 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi kullanıldı ve zenginleştirilmiş BA'lar FACS tarafından daha da saflaştırıldı. Bu protokolün uygulanması, hem ekipmana hem de FACS operasyon deneyimlerine dayanan FACS sürecinin gerekliliği ile sınırlıdır. Bu çalışmada, BA'ları BAT'tan izole etmek için yeni bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokol tarafından izole edilen BA'lar doğrudan gen ve protein ekspresyon çalışmaları için kullanılabilir. Ayrıca, bu çalışmadan elde edilen veriler, BA'ların önemli bir PDGF kaynağı olduğunu göstermektedir.

Protokol

Tüm fareler patojensiz koşullarda tutuldu ve tüm prosedürler Masonik Tıbbi araştırma Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. UCP1::Cre9 ve Rosa 26tdDomates fareleri hatları13 daha önce bildirilmişti. Tüm fareler 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsü ile oda sıcaklığında tutuldu.

1. Solüsyonların ve kahverengi yağ dokusunun (BAT) hazırlanması

  1. 15 mL santrifüj tüplerinde sindirim çözeltisi ve ayırma çözeltisi hazırlayın.
  2. 10 mL BAT Sindirim çözeltisi: 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) için, BAT sindirim çözeltisi yapmak için 3.5 mg / mL Dispase II, 1 mg / mL Kollajenaz II ve 10 mM CaCl2 ekleyin.
  3. 10 mL% 12 iyodiksanol çözeltisi (ayırma çözeltisi): % 12 iyodiksanol elde etmek için 1 mL 10x PBS, 2 mL% 60 iyodiksanol, 0.01 mL 1 M MgCl 2, 0.025 mL 1 M KCl, 0.1 mL 0.2 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 6.865 mL ddH2O karıştırın.
  4. CO2 doz aşımı ile bir yetişkin fareyi ötenazileştirin. Kısaca, fare kafesini min/min% 10-30 kafes hacmi yer değiştirme oranında% 100 CO2 ile doldurun. 5 dakika sonra, gözle görülür nefes alıp almadığınızı kontrol ederek ölümü onaylayın.
  5. Hayvanı disseke edin ve interskapular BAT'yi toplayın. WAT ve kas katmanlarını stereo mikroskop altında çıkarın.
  6. Yeterli sindirime sahip olmak için, her BAT lobunu ~ 3mm3 parçalara bölün ve metal bir karıştırma çubuğu ve 5 mL sindirim çözeltisi ile temiz bir 50 mL şişeye yerleştirin. Sindirime başlamadan önce, BAT ve sindirim tamponu içeren şişenin 1 saat boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin.
    NOT: Aşağıdaki adımlarda, kahverengi adiposit izolasyonu için yaklaşık 80 mg BAT kullanılmıştır.

2. BA'ların izolasyon prosedürü

  1. Şişeyi bir inkübatörün içine yerleştirilmiş manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin. Karıştırma hızını sırasıyla 60 rpm'ye ve inkübatörün sıcaklığını 35 ° C'ye ayarlayın. Sindirim yaklaşık 30 dakika sürecektir. BAT dilimleri sindirim sırasında karıştırıcı çubuğun etrafında kümeler oluşturursa, toplanan dokuları bozmak için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanın.
  2. Temiz bir 50 mL santrifüj tüpünün üzerine 70 μm'lik bir süzgeç filtresi yerleştirin. Pipet, süzgeçten yaklaşık 4 mL hücre süspansiyonu sağlar. Süzgeci 4 mL% 12 iyodiksanol çözeltisi ile yıkayın. Hücreleri ve iyodiksanol çözeltisini karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre karışımını iki berrak 5 mL polistiren test tüpüne aktarın.
    NOT: Sindirimin sonunda, sindirim çözeltisi bulanık olmalı ve yeterli sindirimi göstermelidir. Her seferinde taze sindirim çözeltisi kullanın. Hazırlandıktan sonra, sindirim çözeltisi 2 saat içinde kullanılmalıdır.
  3. Sindirim yeterli değilse, adım 2.2 ve 2.3'ü bir kez daha tekrarlayın.
  4. Ayırma çözeltisini ve BA'ları içeren şeffaf polistiren tüpleri 1 saat boyunca buz üzerinde bırakın. BA'lar üstte bir katman oluşturacaktır.
  5. Mikroskop incelemesi için izole edilmiş BA'ların 20 μL'sini çıkarın.

3. BA'lardan RNA ve protein izolasyonu

  1. BA'ları RNA ve protein izolasyonu için iki adet 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. BA tabakasını bozmadan aşırı iyodiksanol çözeltisini dikkatlice çıkarın.
  2. RNA, DNA ve proteini hücre çözeltisine aynı anda izole etmek için 1 mL Trizol ekleyin. Hücreleri lize etmek için yeterince karıştırın.
  3. Fazları ayırmak için 200 μL Kloroform ekleyin.
  4. Tüpü 4 ° C'de 10 dakika boyunca 9.981 x g santrifüj edin.
  5. Santrifüjlemeden sonra, RNA izolasyonu için sulu fazı kullanın. Bu çalışmada ters transkripsiyon için total RNA kullanılmış ve Gerçek Zamanlı PCR ile kantitatif RT-PCR gerçekleştirilmiştir. Astar dizileri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
  6. Organik fazın 300 μL'sini 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. Organik faza, 10 s için 2.5 hacimli% 100 etanol ve vorteks ekleyin.
  8. 10 s için 200 μL 1-Bromo-3-kloropropan ve vorteks ekleyin.
  9. 600 μL çift damıtılmış su ve 10 sn için vorteks ekleyin.
  10. Karışık çözeltinin oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
  11. 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.981 x g'de santrifüj. Bu adımda, aşamalar ayrılacaktır. Protein fazı orta tabakada lokalizedir.
  12. Üst sulu çözeltiyi çıkarın. Kalan çözeltiye 1 mL% 100 etanol ekleyin.
  13. 10 dakika, 9.981 x g, 4 °C santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, protein peleti oluşacaktır. Süper natantı atın.
  14. Peleti 1 mL% 100 etanol ile yıkayın.
  15. 10 dakika, 9981 x g, 4 °C santrifüj. Peleti kurtarın ve süpernatanı atın.
  16. Peleti oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurulayın.
  17. Islak peletin ağırlığını ölçün. 20 μL/mg pelet oranında %1 SDS çözeltisi ekleyin.
  18. Tüpü ısıtılmış bir çalkalayıcıya koyarak peleti çözün. Sıcaklığı 55 ° C'ye ve hızı 11 x g'ye ayarlayın. Protein peletinin tamamen çözülmesi genellikle 5-10 dakika sürer.
    NOT: Çözünmüş proteinin konsantrasyonu BCA testi14 ile ölçülebilir.

Sonuçlar

Kahverengi adiposit izolasyonu için interakapuler BAT'ın hazırlanması
Kahverengi adipositler (BA'lar) izolasyon süreci Şekil 1A'da gösterilmiştir. BAT ve sindirim / ayırma çözeltilerinin hazırlanmasından izole edilmiş BA'ların elde edilmesine kadar tüm süreç yaklaşık 4 saat sürecektir.

Yetişkin farelerde, interskapuler bölgede bol miktarda BAT bulunur. Bu interskapuler BAT (iBAT) kas katmanları ve WAT ile kaplıdır (

Tartışmalar

Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.

Yayınlanmış bir BA izolasyon protokolünde, BA'ları zenginleştirmek için% 3 BSA çözeltisi kullanılmıştır12. Bununla birlikte, bu yayınlanmış protokol ile elde edilen zenginleştirilmiş BA'lar, protein ekspresyon analizi için doğrudan kullanılamamıştır. Bunun nedeni, BA çözeltisinde bulunan konsantre BSA'nın, takip eden protein...

Açıklamalar

Hiç kimse

Teşekkürler

Z. Lin, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL138454-01 ve Masonik Tıbbi Araştırma Enstitüsü fonları tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
AntigenCompanyCatalog
PPARγLSBioLs-C368478
PDGFRaSanta Cruzsc-398206
UCP1R&D systemIC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type IIThermo Fisher Scientific17101015
1-Bromo-3-chloropropaneSigma-AldrichB62404
Bovine Serum Albumin (BSA) GoldbioA-421-10
Calcium chlorideBio BasicCT1330
ChloroformIBI ScientificIB05040
Dispase II, proteaseSigma-AldrichD5693
EDTABio BasicEB0107
EthanolIBI ScientificIB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master MixLifeSctLS01131905Y
Magnesium Chloride HexahydrateBoston BioProductsP-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMixABMG454
OptiPrep (Iodixanol)Cosmo Bio USAAXS-1114542
PBS (10x)Caisson LabsPBL07
PBS (1x)Caisson LabsPBL06
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227
Potassium ChlorideBoston BioProductsP-1435
SimplyBlue safe StainInvitrogenLC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich75746
Trizol reagentLife technoologies15596018
Primers
Gene name (Species) ForwardReverse
Pdgfra (Mouse)CTCAGCTGTCTCCTCACAgGCAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)TGTGCCCATTCGCAGGAAGAGTTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)TGCTGAACATCTCCCCCTTCTCTCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1ACTGCCACACCTCCAGTCATTCTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
NameCompanyApplication
Keyence BZ-X700KeyenceImaging brown adipocytes
Magnetic stirrerVWRDissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemApplied BiosystemQuantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging systemLI-CORWestern blot immaging

Referanslar

  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır