Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt eine neue Methode zur Isolierung von murinen braunen Adipozyten für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse.

Zusammenfassung

Braunes Fettgewebe (BAT) ist für die nicht zitternde Thermogenese bei Säugetieren verantwortlich, und braune Adipozyten (BAs) sind die funktionellen Einheiten von BAT. BAs enthalten sowohl multilokuläre Lipidtröpfchen als auch reichlich Mitochondrien und exprimieren das Entkopplungsprotein 1 (UCP1). BAs werden basierend auf ihrer Herkunft in zwei Subtypen eingeteilt: embryonale klassische BAs (cBAs) und weiße Adipozyten abgeleitete BAs. Aufgrund ihrer relativ geringen Dichte können BAs mit herkömmlichen Zentrifugationsmethoden nicht aus BVT isoliert werden. In dieser Studie wurde eine neue Methode entwickelt, um BAs aus Mäusen für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse zu isolieren. In diesem Protokoll wurde interskapuläre BAT von erwachsenen Mäusen mit Kollagenase- und Dispase-Lösung verdaut, und die dissoziierten BAs wurden mit 6% iger Jodixanollösung angereichert. Isolierte BAs wurden dann mit Trizol-Reagenz zur gleichzeitigen Isolierung von RNA, DNA und Protein lysiert. Nach der RNA-Isolierung wurde die organische Phase des Lysats für die Proteinextraktion verwendet. Unsere Daten zeigten, dass 6% Jodixanollösung BAs effizient anreicherte, ohne Folgestudien zur Gen- und Proteinexpression zu stören. Platelet-derived growth factor (PDGF) ist ein Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert. Im Vergleich zum braunen Fettgewebe hatten isolierte BAs eine signifikant höhere Expression von Pdgfa. Zusammenfassend bietet diese neue Methode eine Plattform, um die Biologie brauner Adipozyten auf Einzelzelltypebene zu untersuchen.

Einleitung

Sowohl Mäuse als auch Menschen haben zwei Arten von Fettgewebe: weißes Fettgewebe (WAT) und braunes Fettgewebe (BAT)¹. WAT speichert Energie in Form von Triglyceriden in weißen Adipozyten, und die braunen Adipozyten (BAs) von BAT leiten chemische Energie als Wärme² ab. Basierend auf ihrem Entwicklungsursprung werden BAs weiter kategorisiert in klassische BAs (cBAs), die während der Embryonalentwicklung entstanden sind, und aus weißen Adipozyten gewonnene BAs (beige/brite Zellen, die unter Stressbedingungen aus weißen Adipozyten umgewandelt werden)³. BAs sind multilokulär und exprimieren das thermogene Proteinentkopplungsprotein 1 (UCP1)⁴. Das interskapuläre BAT-Depot (iBAT) ist eines der primären cBAs-Depots bei kleinen Säugetieren⁵, während beige Zellen innerhalb von WAT⁶ dispergiert sind.

Aufgrund ihrer Art der Energieableitung haben BAs als therapeutisches Ziel zur Verringerung von Fettleibigkeit viel Aufmerksamkeit erhalten⁷. Um BAs zur Behandlung von Fettleibigkeit zu nutzen, ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Funktion, das Überleben und die Rekrutierung von BAs steuern. Fettgewebe einschließlich BAT und WAT sind heterogen. Abgesehen von Adipozyten enthält Fettgewebe viele andere Zelltypen wie Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen und Makrophagen⁸. Obwohl genetische Werkzeuge zur spezifischen Depletion von Kandidatengenen in Mäuse-BAs verfügbar sind, wie UCP1::Cre Linie⁹, sind Techniken zur Reinigung von BAs von BAT oder WAT begrenzt, was es schwierig macht, BAs auf Einzelzellebene zu untersuchen. Darüber hinaus wird ohne reine BAs die Beziehung zwischen BAs und Nicht-BAs nicht klar abgegrenzt. Zum Beispiel wurde der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktorrezeptor alpha (PDGFRα) als Marker für undifferenzierte mesenchymale Zellen verwendet und wird in den endothelialen und interstitiellen Zellen von BAT exprimiert. In kalt gestressten BAT entstehen durch PDGFRα-positive Vorläuferzellen neue BAs¹⁰. PDGFRα wird durch seinen Liganden PDGF aktiviert, einen Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert¹¹; Es ist jedoch unklar, ob BAs das Verhalten von PDGFRα-positiven Vorläuferzellen beeinflussen, indem sie PDGF sezernieren.

Vor kurzem wurde ein BAs-Isolationsprotokoll veröffentlicht, das auf Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)¹² basiert. In diesem Protokoll wurde 3% ige Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung verwendet, um BAs von Nicht-BAs zu trennen, und die angereicherten BAs wurden durch FACS weiter gereinigt. Die Anwendung dieses Protokolls ist durch die Anforderung des FACS-Prozesses begrenzt, der sowohl auf Geräten als auch auf FACS-Betriebserfahrungen beruht. In dieser Studie wurde ein neues Protokoll zur Isolierung von BAs aus BAT entwickelt. Die durch dieses Protokoll isolierten BAs können direkt für Gen- und Proteinexpressionsstudien verwendet werden. Darüber hinaus deuten Daten aus dieser Studie darauf hin, dass BAs eine wichtige PDGF-Ressource sind.

Protokoll

Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten, und alle Verfahren wurden vom Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. UCP1::Cre⁹ und Rosa 26^{tdTomato-Mäuse} der Linien¹³ wurden zuvor berichtet. Alle Mäuse wurden bei Raumtemperatur mit einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten.

1. Herstellung der Lösungen und des braunen Fettgewebes (BVT)

1. Aufschlusslösung und Trennlösung in 15 ml Zentrifugenröhrchen vorbereiten.
2. 10 ml BAT-Aufschlusslösung: Zu 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) werden 3,5 mg/ml Dispase II, 1 mg/ml Kollagenase II und 10 mM CaCl₂ hinzugefügt, um eine BAT-Aufschlusslösung herzustellen.
3. 10 mL 12%ige Iodixanollösung (Trennlösung): Mischen Sie 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% Iodixanol, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml 0,2 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 6,865 ml_ddH2O, um₁₂% Iodixanol zu erhalten.
4. Euthanasieren Sie eine erwachsene Maus mit CO₂ -Überdosis. Füllen Sie den Mauskäfig kurz mit 100% CO₂ bei einer Verdrängungsrate von 10-30% Käfigvolumen pro min. 5 min später, bestätigen Sie den Tod, indem Sie auf das Fehlen einer sichtbaren Atmung prüfen.
5. Sezieren Sie das Tier und sammeln Sie interskapuläre BAT. Entfernen Sie WAT und Muskelschichten unter einem Stereomikroskop.
6. Für eine ausreichende Verdauung schneiden Sie jeden BAT-Lappen in ~ 3 mm³ Teile und legen Sie sie in einen sauberen 50-ml-Kolben mit einem Metallrührstab und 5 ml Aufschlusslösung. Lassen Sie den Kolben mit BAT und Aufschlusspuffer vor Beginn der Verdauung 1 h auf Eis ruhen.
   HINWEIS: In den folgenden Schritten wurden etwa 80 mg BAT zur Isolierung brauner Adipozyten verwendet.

2. Isolationsverfahren für BAs

1. Stellen Sie den Kolben auf einen Magnetrührer, der in einem Inkubator eingeschlossen ist. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 60 U/min bzw. die Temperatur des Inkubators auf 35 °C ein. Die Verdauung dauert ca. 30 min. Wenn die BAT-Scheiben während der Verdauung Klumpen um den Rührstab bilden, verwenden Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, um das aggregierte Gewebe zu stören.
2. Legen Sie einen 70-μm-Siebfilter auf ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie etwa 4 ml Zellsuspension durch das Sieb. Waschen Sie das Sieb mit 4 ml 12% iger Jodixanollösung. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen und die Jodixanollösung zu mischen. Die Zellmischung wird in zwei klare 5 mL Polystyrol-Reagenzgläser überführt.
   HINWEIS: Am Ende der Verdauung sollte die Verdauungslösung trüb sein, was auf eine ausreichende Verdauung hinweist. Verwenden Sie jedes Mal frische Verdauungslösung. Nach der Zubereitung sollte die Aufschlusslösung innerhalb von 2 h verwendet werden.
3. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3 noch einmal, wenn die Verdauung nicht ausreicht.
4. Lassen Sie die klaren Polystyrolröhrchen mit Trennlösung und BAs 1 h auf Eis. Die BAs bilden eine Schicht auf der Oberseite.
5. Nehmen Sie 20 μL der isolierten BAs zur mikroskopischen Untersuchung heraus.

3. RNA- und Proteinisolierung aus BAs

1. Pipettieren Sie die BAs-Schicht in zwei 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zur RNA- und Proteinisolierung. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Jodixanollösung, ohne die BAs-Schicht zu stören.
2. Fügen Sie 1 ml Trizol hinzu, um gleichzeitig RNA, DNA und Protein in die Zelllösung zu isolieren. Ausreichend mischen, um die Zellen zu lysieren.
3. Fügen Sie 200 μL Chloroform hinzu, um die Phasen zu trennen.
4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen für 9.981 x g für 10 min bei 4 °C.
5. Verwenden Sie nach der Zentrifugation die wässrige Phase zur RNA-Isolierung. In dieser Studie wurde die Gesamt-RNA für die reverse Transkription verwendet, und die quantitative RT-PCR wurde mit Real-Time PCR durchgeführt. Primer-Sequenzen sind in der Materialtabelle aufgeführt.
6. 300 μL der organischen Phase in ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
7. Zur organischen Phase 2,5 Volumen 100% Ethanol und Wirbel für 10 s hinzufügen.
8. Fügen Sie 200 μL 1-Bromo-3-chlorpropan und Wirbel für 10 s hinzu.
9. Fügen Sie 600 μL doppelt destilliertes Wasser und Wirbel für 10 s hinzu.
10. Lassen Sie die Mischlösung 10 min bei Raumtemperatur stehen.
11. Zentrifugieren bei 9.981 x g für 10 min bei 4 °C. In diesem Schritt werden die Phasen getrennt. Die Proteinphase ist in der mittleren Schicht lokalisiert.
12. Entfernen Sie die obere wässrige Lösung. Geben Sie 1 ml 100% Ethanol in die restliche Lösung.
13. Zentrifuge für 10 min, 9.981 x g, 4 °C. Nach der Zentrifugation bildet sich das Proteinpellet. Verwerfen Sie den Überstand.
14. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 100% Ethanol.
15. Zentrifuge für 10 min, 9981 x g, 4 °C. Speichern Sie das Pellet und entsorgen Sie den Überstand.
16. Trocknen Sie das Pellet 10 min bei Raumtemperatur an der Luft.
17. Messen Sie das Gewicht des nassen Pellets. Fügen Sie 1% ige SDS-Lösung in einem Verhältnis von 20 μL / mg Pellet hinzu.
18. Lösen Sie das Pellet auf, indem Sie das Röhrchen in einen erhitzten Shaker geben. Stellen Sie die Temperatur auf 55 °C und die Geschwindigkeit auf 11 x g ein. Es dauert normalerweise 5-10 Minuten, um das Proteinpellet vollständig aufzulösen.
    HINWEIS: Die Konzentration des gelösten Proteins kann mit dem BCA-Assay¹⁴ gemessen werden.

Ergebnisse

Herstellung von interakapular BAT zur Isolierung brauner Adipozyten
Der Isolationsprozess für braune Adipozyten (BAs) ist in Abbildung 1A dargestellt. Der gesamte Prozess, von der Herstellung von BVT und Aufschluss-/Trennlösungen bis zur Gewinnung isolierter BAs, dauert etwa 4 Stunden.

Bei erwachsenen Mäusen gibt es reichlich BAT in der interskapulären Region. Diese interskapuläre BAT (iBAT) wird von Muskelschichten und WAT bedeckt (

Diskussion

In dieser Studie wurde eine neue Methode zur Isolierung von BAs für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse entwickelt.

In einem veröffentlichten BAs-Isolationsprotokoll wurde eine 3%ige BSA-Lösung zur Anreicherung von BAs¹² verwendet. Dennoch konnten die angereicherten BAs, die durch dieses veröffentlichte Protokoll erzielt wurden, nicht direkt für die Proteinexpressionsanalyse verwendet werden. Dies liegt daran, dass das in der BAs-Lösung vorhandene konzentrierte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging