Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Résumé

Cette étude décrit une nouvelle méthode d’isolement des adipocytes bruns murins pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines.

Résumé

Le tissu adipeux brun (MTD) est responsable de la thermogenèse non frissonnante chez les mammifères, et les adipocytes bruns (BA) sont les unités fonctionnelles des MTD. Les BA contiennent à la fois des gouttelettes lipidiques multiloculaires et des mitochondries abondantes, et ils expriment la protéine de découplage 1 (UCP1). Les BA sont classés en deux sous-types en fonction de leur origine : les BA classiques dérivés d’embryons (ABAc) et les BA dérivés d’adipocytes blancs. En raison de leur densité relativement faible, les BA ne peuvent pas être isolés des MTD avec la méthode de centrifugation traditionnelle. Dans cette étude, une nouvelle méthode a été développée pour isoler les BA de souris pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines. Dans ce protocole, les MTD interscapulaires de souris adultes ont été digérées avec une solution de collagénase et de dispase, et les BA dissociés ont été enrichis avec une solution d’iodixanol à 6%. Les BA isolés ont ensuite été lysés avec le réactif Trizol pour l’isolement simultané de l’ARN, de l’ADN et des protéines. Après isolement de l’ARN, la phase organique du lysat a été utilisée pour l’extraction des protéines. Nos données ont montré que la solution d’iodixanol à 6% enrichissait efficacement les BA sans interférer avec les études de suivi sur l’expression des gènes et des protéines. Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) est un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses. Par rapport au tissu adipeux brun, les BA isolés avaient une expression significativement plus élevée de Pdgfa. En résumé, cette nouvelle méthode fournit une plate-forme pour étudier la biologie des adipocytes bruns au niveau d’un seul type cellulaire.

Introduction

Les souris et les humains ont deux types de tissus adipeux : le tissu adipeux blanc (WAT) et le tissu adipeux brun (MTD)¹. WAT stocke l’énergie sous forme de triglycérides dans les adipocytes blancs, et les adipocytes bruns (BA) de BAT dissipent l’énergie chimique sous forme de chaleur². En fonction de leur origine développementale, les BA sont ensuite classés en BA classiques (cBA) qui se sont formés au cours du développement embryonnaire et en BA dérivés d’adipocytes blancs (cellules beiges / brite, converties à partir d’adipocytes blancs dans des conditions de stress)³. Les BA sont multiloculai....

Protocole

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la recherche médicale maçonnique. UCP1::Cre⁹ et Rosa 26^tdLes lignées de souris Tomato¹³ ont été signalées précédemment. Toutes les souris ont été maintenues à température ambiante avec un cycle lumière/obscurité de 12 h.

1. Préparation des solutions et du tissu adipeux brun (MTD)

1. Préparer la solution de digestion et la solution de séparation dans des tubes à centrifuger....

Résultats

Préparation de la MTD interacapulaire pour l’isolement des adipocytes bruns
Le processus d’isolement des adipocytes bruns (BA) est illustré à la figure 1A. L’ensemble du processus, de la préparation des MTD et des solutions de digestion/séparation à l’obtention de BA isolés, prendra environ 4 h.

Chez les souris adultes, la MTD abondante existe dans la région interscapulaire. Cette MTD interscapulaire (iBAT) est recouverte de cou.......

Discussion

Dans cette étude, une nouvelle méthode d’isolement des BA pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines a été développée.

Dans un protocole d’isolation BAs publié, une solution BSA à 3% a été utilisée pour enrichir les BA¹². Néanmoins, les BA enrichis obtenus par ce protocole publié n’ont pas pu être directement utilisés pour l’analyse de l’expression protéique. En effet, le BSA concentré existant dans la solution de BAs inte.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging