Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Résumé

Cette étude décrit une nouvelle méthode d’isolement des adipocytes bruns murins pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines.

Résumé

Le tissu adipeux brun (MTD) est responsable de la thermogenèse non frissonnante chez les mammifères, et les adipocytes bruns (BA) sont les unités fonctionnelles des MTD. Les BA contiennent à la fois des gouttelettes lipidiques multiloculaires et des mitochondries abondantes, et ils expriment la protéine de découplage 1 (UCP1). Les BA sont classés en deux sous-types en fonction de leur origine : les BA classiques dérivés d’embryons (ABAc) et les BA dérivés d’adipocytes blancs. En raison de leur densité relativement faible, les BA ne peuvent pas être isolés des MTD avec la méthode de centrifugation traditionnelle. Dans cette étude, une nouvelle méthode a été développée pour isoler les BA de souris pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines. Dans ce protocole, les MTD interscapulaires de souris adultes ont été digérées avec une solution de collagénase et de dispase, et les BA dissociés ont été enrichis avec une solution d’iodixanol à 6%. Les BA isolés ont ensuite été lysés avec le réactif Trizol pour l’isolement simultané de l’ARN, de l’ADN et des protéines. Après isolement de l’ARN, la phase organique du lysat a été utilisée pour l’extraction des protéines. Nos données ont montré que la solution d’iodixanol à 6% enrichissait efficacement les BA sans interférer avec les études de suivi sur l’expression des gènes et des protéines. Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) est un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses. Par rapport au tissu adipeux brun, les BA isolés avaient une expression significativement plus élevée de Pdgfa. En résumé, cette nouvelle méthode fournit une plate-forme pour étudier la biologie des adipocytes bruns au niveau d’un seul type cellulaire.

Introduction

Les souris et les humains ont deux types de tissus adipeux : le tissu adipeux blanc (WAT) et le tissu adipeux brun (MTD)¹. WAT stocke l’énergie sous forme de triglycérides dans les adipocytes blancs, et les adipocytes bruns (BA) de BAT dissipent l’énergie chimique sous forme de chaleur². En fonction de leur origine développementale, les BA sont ensuite classés en BA classiques (cBA) qui se sont formés au cours du développement embryonnaire et en BA dérivés d’adipocytes blancs (cellules beiges / brite, converties à partir d’adipocytes blancs dans des conditions de stress)³. Les BA sont multiloculaires et expriment la protéine thermogénique de découplage 1 (UCP1)⁴. Le dépôt de MTD interscapulaire (iBAT) est l’un des principaux dépôts de cBA chez les petits mammifères⁵, tandis que les cellules beiges sont dispersées dans WAT⁶.

En raison de leur nature de dissipation de l’énergie, les BA ont reçu beaucoup d’attention en tant que cible thérapeutique pour réduire l’obésité⁷. Pour exploiter les BA dans le but de traiter l’obésité, il est essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la fonction, la survie et le recrutement des BA. Les tissus adipeux, y compris la MTD et la WAT, sont hétérogènes. À l’exception des adipocytes, les tissus adipeux contiennent de nombreux autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses et les macrophages⁸. Bien qu’il existe des outils génétiques pour épuiser spécifiquement les gènes candidats chez les souris BA, tels que UCP1::Cre line⁹, les techniques de purification des BAT ou WAT sont limitées, ce qui rend difficile l’étude des BA au niveau d’un type unicellulaire. De plus, sans obtenir des BA purs, la relation entre les BA et les non-BA ne sera pas clairement définie. Par exemple, le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) a été utilisé comme marqueur pour les cellules mésenchymateuses indifférenciées, et il est exprimé dans les cellules endothéliales et interstitielles de la MTD. Dans les MTD soumises à un stress froid, les cellules progénitrices PDGFRα positives donnent naissance à de nouveaux BAs¹⁰. PDGFRα est activé par son ligand PDGF, un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses¹¹; cependant, il n’est pas clair si les BA influencent le comportement des cellules progénitrices PDGFRα positives en sécrétant PDGF.

Récemment, un protocole d’isolement des BA a été publié, basé sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)¹². Dans ce protocole, une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % a été utilisée pour séparer les BA des non-BA, et les BA enrichies ont été purifiées par FACS. L’application de ce protocole est limitée par l’exigence du processus FACS, qui repose à la fois sur l’équipement et sur l’expérience d’exploitation du FACS. Dans cette étude, un nouveau protocole pour isoler les BA des MTD a été développé. Les BA isolés par ce protocole peuvent être directement utilisés pour des études d’expression génique et protéique. De plus, les données de cette étude suggèrent que les AB sont une ressource importante du FGPD.

Protocole

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la recherche médicale maçonnique. UCP1::Cre⁹ et Rosa 26^tdLes lignées de souris Tomato¹³ ont été signalées précédemment. Toutes les souris ont été maintenues à température ambiante avec un cycle lumière/obscurité de 12 h.

1. Préparation des solutions et du tissu adipeux brun (MTD)

1. Préparer la solution de digestion et la solution de séparation dans des tubes à centrifuger de 15 mL.
2. 10 mL de solution de digestion BAT : À 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, ajouter 3,5 mg/mL de Dispase II, 1 mg/mL de collagénase II et 10 mM de CaCl₂ pour obtenir une solution de digestion BAT.
3. 10 mL de solution d’iodixanol à 12 % (solution de séparation) : Mélanger 1 mL de PBS 10x, 2 mL d’iodixanol à 60 %, 0,01 mL de 1 M MgCl2, 0,025 mL de 1 M KCl, 0,1 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,2 M et 6,865 mL de ddH2O pour obtenir₁₂% d’iodixanol.
4. Euthanasier une souris adulte avec une surdose de CO₂ . Brièvement, remplissez la cage de la souris avec 100% de CO₂ à un taux de déplacement de 10-30% du volume de la cage par min. 5 min plus tard, confirmez la mort en vérifiant l’absence de respiration visible.
5. Disséquez l’animal et collectez les MTD interscapulaires. Retirez WAT et les couches musculaires au microscope stéréoscopique.
6. Pour avoir une digestion suffisante, couper chaque lobe de la MTD en ~ 3 mm³ parties et les placer dans une fiole propre de 50 ml avec une barre d’agitation métallique et une solution de digestion de 5 ml. Avant de commencer la digestion, laisser reposer la fiole contenant la MTD et le tampon de digestion sur la glace pendant 1 h.
   REMARQUE: Dans les étapes suivantes, environ 80 mg de BAT ont été utilisés pour l’isolement des adipocytes bruns.

2. Procédure d’isolement des BA

1. Placer la fiole sur un agitateur magnétique enfermé dans un incubateur. Réglez la vitesse d’agitation à 60 tr/min et la température de l’incubateur à 35 °C, respectivement. La digestion durera environ 30 min. Si les tranches de MTD forment des amas autour de la barre d’agitation pendant la digestion, utilisez un embout de pipette de 1 mL pour perturber les tissus agrégés.
2. Placez un filtre à crépine de 70 μm sur un tube à centrifuger propre de 50 mL. Pipeter environ 4 ml de suspension cellulaire à travers la passoire. Laver la crépine avec 4 mL de solution d’iodixanol à 12%. Pipeter de haut en bas pour mélanger les cellules et la solution d’iodixanol. Transférer le mélange de cellules dans deux tubes à essai en polystyrène transparent de 5 mL.
   REMARQUE: À la fin de la digestion, la solution de digestion doit être trouble, indiquant une digestion suffisante. Utilisez une solution de digestion fraîche à chaque fois. Une fois préparée, la solution de digestion doit être utilisée dans les 2 heures.
3. Répétez les étapes 2.2 et 2.3 une fois de plus si la digestion n’est pas suffisante.
4. Laisser les tubes en polystyrène transparent contenant la solution de séparation et les BA sur la glace pendant 1 h. Les BA formeront une couche sur le dessus.
5. Retirer 20 μL des BA isolés pour l’examen au microscope.

3. Isolement de l’ARN et des protéines des BA

1. Pipeter la couche BA dans deux tubes microcentrifugés de 1,7 mL pour l’isolement de l’ARN et des protéines. Retirez soigneusement la solution excessive d’iodixanol sans perturber la couche BAs.
2. Ajouter 1 mL de Trizol pour isoler simultanément l’ARN, l’ADN et la protéine dans la solution cellulaire. Mélanger suffisamment pour lyser les cellules.
3. Ajouter 200 μL de chloroforme pour séparer les phases.
4. Centrifuger le tube pendant 9 981 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Après centrifugation, utiliser la phase aqueuse pour l’isolement de l’ARN. Dans cette étude, l’ARN total a été utilisé pour la transcription inverse, et la RT-PCR quantitative a été réalisée avec la PCR en temps réel. Les séquences d’amorces sont énumérées dans le tableau des matériaux.
6. Transférer 300 μL de la phase organique dans un tube microcentrifuge de 2 mL.
7. A la phase organique, ajouter 2,5 volume 100% éthanol et vortex pendant 10 s.
8. Ajouter 200 μL de 1-Bromo-3-chloropropane et vortex pendant 10 s.
9. Ajouter 600 μL d’eau bidistillée et vortex pendant 10 s.
10. Laisser reposer la solution mélangée pendant 10 min à température ambiante.
11. Centrifuger à 9 981 x g pendant 10 min à 4 °C. À cette étape, les phases seront séparées. La phase protéique est localisée dans la couche intermédiaire.
12. Retirer la solution aqueuse supérieure. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % dans la solution restante.
13. Centrifuger pendant 10 min, 9 981 x g, 4 °C. Après centrifugation, la pastille de protéine se forme. Jetez le surnageant.
14. Lavez la pastille avec 1 ml d’éthanol 100 %.
15. Centrifuger pendant 10 min, 9981 x g, 4 °C. Conservez la pastille et jetez le surnageant.
16. Sécher le granulé à l’air pendant 10 min à température ambiante.
17. Mesurer le poids de la pastille humide. Ajouter une solution de SDS à 1 % dans un rapport de 20 μL/mg de granulés.
18. Dissoudre la pastille en mettant le tube dans un shaker chauffé. Réglez la température à 55 °C et la vitesse à 11 x g. Il faut généralement 5 à 10 minutes pour dissoudre complètement la pastille de protéine.
    NOTE: La concentration de la protéine dissoute peut être mesurée par le dosage^{BCA 14}.

Résultats

Préparation de la MTD interacapulaire pour l’isolement des adipocytes bruns
Le processus d’isolement des adipocytes bruns (BA) est illustré à la figure 1A. L’ensemble du processus, de la préparation des MTD et des solutions de digestion/séparation à l’obtention de BA isolés, prendra environ 4 h.

Chez les souris adultes, la MTD abondante existe dans la région interscapulaire. Cette MTD interscapulaire (iBAT) est recouverte de cou...

Discussion

Dans cette étude, une nouvelle méthode d’isolement des BA pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines a été développée.

Dans un protocole d’isolation BAs publié, une solution BSA à 3% a été utilisée pour enrichir les BA¹². Néanmoins, les BA enrichis obtenus par ce protocole publié n’ont pas pu être directement utilisés pour l’analyse de l’expression protéique. En effet, le BSA concentré existant dans la solution de BAs inte...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging