유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 견갑골 갈색 지방 조직에서 갈색 지방 세포 분리

요약

이 연구는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 갈색 지방 세포를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다.

초록

갈색 지방 조직 (BAT)은 포유류에서 떨리지 않는 열 발생을 담당하며 갈색 지방 세포 (BA)는 BAT의 기능 단위입니다. BA는 다안 지질 방울과 풍부한 미토콘드리아를 모두 포함하며 결합 해제 단백질 1 (UCP1)을 발현합니다. BA는 기원에 따라 배아 유래 고전 BA(cBA)와 백색 지방 세포 유래 BA의 두 가지 하위 유형으로 분류됩니다. 상대적으로 밀도가 낮기 때문에 BA는 전통적인 원심분리 방법으로 BAT에서 분리할 수 없습니다. 이 연구에서는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 마우스에서 BA를 분리하는 새로운 방법이 개발되었습니다. 이 프로토콜에서, 성인 마우스로부터의 interscapular BAT를 Collagenase 및 Dispase 용액으로 분해하고, 해리 된 BA를 6 % 요오 딕산 올 용액으로 풍부하게했다. 그런 다음 분리된 BA를 트리졸 시약으로 용해시켜 RNA, DNA 및 단백질을 동시에 분리했습니다. RNA 분리 후, 용해물의 유기상을 단백질 추출에 사용하였다. 우리의 데이터는 6% 요오드 딕산올 용액이 후속 유전자 및 단백질 발현 연구를 방해하지 않으면서 BA를 효율적으로 농축한다는 것을 보여주었습니다. 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)는 중간 엽 세포의 성장과 증식을 조절하는 성장 인자입니다. 갈색 지방 조직과 비교하여 분리 된 BA는 Pdgfa의 발현이 상당히 높았습니다. 요약하면,이 새로운 방법은 단일 세포 유형 수준에서 갈색 지방 세포의 생물학을 연구하기위한 플랫폼을 제공합니다.

서문

생쥐와 인간 모두 백색 지방 조직(WAT)과 갈색 지방 조직(BAT)의 두 가지 유형의 지방 조직을 가지고 있습니다.¹. WAT는 백색 지방 세포에 트리글리세리드 형태로 에너지를 저장하고 BAT의 갈색 지방 세포 (BA)는 화학 에너지를 열²로 발산합니다. 발달 기원에 따라 BA는 배아 발달 중에 형성된 고전 BA(cBA)와 백색 지방세포 유래 BA(베이지/브라이트 세포, 스트레스 조건에서 백색 지방세포에서 전환)^{3로 더} 분류됩니다. BA는 다안선이며 열 발생 단백질 결합 해제 단백질 1 (UCP1)⁴을 발현합니다. 견갑간 BAT (iBAT) 저장소는 작은 포유류⁵의 1 차 cBA 저장소 중 하나 인 반면, 베이지 색 세포는 WAT⁶ 내에 분산되어 있습니다.

BA는 에너지를 발산하는 특성으로 인해 비만을 줄이기 위한 치료 표적으로 많은 주목을 받고 있습니다⁷. 비만 치료 목적으로 BA를 이용하려면 BA 기능, 생존 및 모집을 제어하는 분자 메커니....

프로토콜

모든 마우스는 병원체가없는 상태로 유지되었으며 모든 절차는 프리메이슨 의학 연구 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. UCP1::Cre⁹ 및 Rosa 26^td토마토 마우스 라인¹³ 이 이전에 보고되었다. 모든 마우스는 12 시간의 명암 주기로 실온에서 유지되었다.

1. 용액 및 갈색 지방 조직 (BAT) 준비

1. 15mL 원심분리 튜브에 분해 용액과 분리 용액을 준비합니다.
2. 10mL의 BAT 분해 용액: 10mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 3.5mg/mL 디스파아제 II, 1mg/mL 콜라게나제 II 및 10mM_CaCl2 을 추가하여 BAT 분해 용액을 만듭니다.
3. 10 mL의 12 % 요오드 딕산 올 용액 (분리 용액) : 10x PBS 1mL, 60 % 요오드 사놀 2mL, 1M MgCl2 0.01mL, 1M KCl 0.025mL, 0.2M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 0.1mL 및 ddH_2O6.865mL를 혼합하여₁₂ % 요오드 사놀을 얻습니다.
4. 성인 마우스....

결과

갈색 지방세포 분리를 위한 개간골 BAT의 제조
갈색 지방세포(BA) 분리 과정은 도 1A에 도시되어 있다. BAT 및 분해/분리 용액 준비에서 분리 BA 획득에 이르기까지 전체 프로세스는 약 4시간이 소요됩니다.

성인 마우스에서는 견갑골 간 영역에 풍부한 BAT가 존재합니다. 이 견갑간 BAT(iBAT)는 근육층과 WAT로 덮여 있습니다(그림 1B<.......

토론

이 연구에서는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 BA를 분리하는 새로운 방법이 개발되었습니다.

공개된 BA 격리 프로토콜에서, 3% BSA 용액은 BAs¹²를 풍부하게 하기 위해 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 이 공개된 프로토콜에 의해 달성된 농축 BA는 단백질 발현 분석에 직접 사용될 수 없었다. 이는 BAs 용액에 존재하는 농축된 BSA가 후속 단백질 추출을 방해하?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging