遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)

要約

この研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウス褐色脂肪細胞を単離する新しい方法について説明します。

要約

褐色脂肪組織(BAT)は哺乳類の非震え熱発生に関与しており、褐色脂肪細胞(BA)はBATの機能単位です。BAは多房性脂肪滴と豊富なミトコンドリアの両方を含み、脱共役タンパク質1(UCP1)を発現します。BAは、その起源に基づいて、胚由来の古典的BA(cBA)と白色脂肪細胞由来のBAの2つのサブタイプに分類されます。BAは密度が比較的低いため、従来の遠心分離法ではBATから分離できません。本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウスからBAを単離する新しい方法を開発しました。このプロトコルでは、成体マウスの肩甲骨間BATをコラゲナーゼおよびディスパーゼ溶液で消化し、解離したBAを6%ヨージキサノール溶液で濃縮した。次に、単離したBAをTrizol試薬で溶解し、RNA、DNA、およびタンパク質を同時に単離しました。RNA単離後、ライセートの有機相をタンパク質抽出に使用した。私たちのデータは、6%ヨージキサノール溶液がフォローアップ遺伝子およびタンパク質発現研究を妨げることなくBAを効率的に濃縮することを示しました。血小板由来成長因子(PDGF)は、間葉系細胞の増殖および増殖を調節する成長因子である。褐色脂肪組織と比較して、単離されたBAは Pdgfaの発現が有意に高かった。要約すると、この新しい方法は、褐色脂肪細胞の生物学を単一の細胞型レベルで研究するためのプラットフォームを提供します。

概要

マウスとヒトの両方に、白色脂肪組織(WAT)と褐色脂肪組織(BAT)の2種類の脂肪組織があります¹。WATは白色脂肪細胞に中性脂肪の形でエネルギーを蓄え、BATの褐色脂肪細胞(BA)は化学エネルギーを熱²として放散します。BAは、その発生起源に基づいて、胚発生中に形成される古典的なBA(cBA)と、ストレス条件下で白色脂肪細胞から変換された白色脂肪細胞由来のBA(ベージュ/ブライト細胞)にさらに分類されます³。BAは多房性であり、熱発生タンパク質脱共役タンパク質1(UCP1)⁴を発現します。肩甲骨間BAT(iBAT)デポーは、小型哺乳類の主要なcBAデポの1つです⁵が、ベージュ色の細胞は^WAT6内に分散しています。

エネルギーを散逸させる性質上、BAは肥満を減らすための治療標的として多くの注目を集めています⁷。肥満の治療を目的としてBAを利用するためには、BAの機能、生存、および動員を制御する分子メカニズムを理解することが不可欠です。BATおよびWATを含む脂肪組織は不均一である。脂肪細胞を除いて、脂肪組織には内皮細胞、間葉系幹細胞、マクロファージなど、他の多くの細胞タイプが含まれています⁸。UCP1::Creライン⁹など、マウスBAの候補遺伝子を特異的に枯渇させる遺伝的ツールが利用可能であるが、BATまたはWATからBAを精製する技術は限られており、単一細胞レベルでBAを研究することは困難である。さらに、純粋なBAを取得しないと、BAと非BAの関係が明確に描写されません。例えば、血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)は、未分化間葉系細胞のマーカーとして使用されており、BATの内皮細胞や間質細胞で発現しています。低温ストレスBATでは、PDGFRα陽性前駆細胞が新しい^BA10を生じさせる。PDGFRαは、間葉系細胞の成長および増殖を調節する成長因子であるリガンドPDGFによって活性化される¹¹;しかし、BAがPDGFを分泌することによってPDGFRα陽性前駆細胞の挙動に影響を与えるかどうかは不明である。

最近、蛍光活性化セルソーティング(FACS)¹²に基づくBAs分離プロトコルが公開されました。このプロトコルでは、3%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を使用してBAを非BAから分離し、濃縮BAをFACSでさらに精製しました。このプロトコルの適用は、機器とFACSの両方の操作経験に依存するFACSプロセスの要件によって制限されます。本研究では、BATからBAを分離するための新しいプロトコルが開発されました。このプロトコルによって単離されたBAは、遺伝子およびタンパク質発現研究に直接使用できます。さらに、この研究のデータは、BAが主要なPDGFリソースであることを示唆しています。

プロトコル

すべてのマウスは病原体のない状態で維持され、すべての手順はフリーメーソン医学研究施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。UCP1::Cre⁹ およびRosa 26^tdTomatoes マウス系統¹³ が以前に報告された。すべてのマウスを12時間の明暗サイクルで室温に保ちました。

1.溶液と褐色脂肪組織(BAT)の準備

1. 消化液と分離液を15 mL遠沈管で調製します。
2. 10 mLのBAT消化溶液:10 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に、3.5 mg / mLのディスパーゼII、1 mg / mLのコラゲナーゼII、および10 mM CaCl₂ を加えてBAT消化溶液を作ります。
3. 10 mLの12%ヨージキサノール溶液(分離溶液):1 mLの10x PBS、2 mLの60%ヨージキサノール、0.01 mLの1 M MgCl 2、0.025 mLの1 M KCl、0.1 mLの0.2 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)および6.865 mLのddH₂ Oを混合して、12%のヨージキサノールを得る。
4. 1匹の成体マウスをCO₂ 過剰摂取で安楽死させる。簡単に説明すると、マウスケージを1分当たり10〜30%ケージ容積の変位率で100%_CO2 で満たす。 5分後、目に見えて呼吸がないことを確認して死亡を確認する。
5. 動物を解剖し、肩甲骨間BATを収集します。実体顕微鏡でWATと筋肉層を取り除きます。
6. 十分な消化を行うには、各BATローブを~3 mm³ の部分にカットし、金属攪拌子と5 mL消化溶液を入れた清潔な50 mLフラスコに入れます。消化を開始する前に、BATと消化バッファーを含むフラスコを氷上に1時間置きます。
   注:次の手順では、褐色脂肪細胞の分離に約80 mg BATを使用しました。

2. BAの分離手順

1. インキュベーターに封入されたマグネチックスターラーにフラスコを置きます。攪拌速度をそれぞれ60rpmに、インキュベーターの温度を35°Cに設定する。消化は約30分間続きます。消化中にBATスライスがスターラーバーの周りに塊を形成する場合は、1 mLピペットチップを使用して凝集組織を破壊します。
2. 清潔な50 mL遠心チューブの上に70 μmのストレーナーフィルターを置きます。約4 mLの細胞懸濁液をストレーナーに通してピペットで入れます。4 mLの12%ヨージキサノール溶液でストレーナーを洗浄します。ピペットを上下に動かして、細胞とヨージキサノール溶液を混合します。細胞混合物を2本の透明な5 mLポリスチレン試験管に移します。
   注:消化の終わりには、消化溶液は濁っているはずで、十分な消化を示しています。毎回新鮮な消化液を使用してください。調製したら、消化溶液は2時間以内に使用する必要があります。
3. 消化が十分でない場合は、手順2.2と2.3をもう一度繰り返します。
4. 分離溶液とBAが入った透明なポリスチレンチューブを氷上に1時間放置します。BAは上部にレイヤーを形成します。
5. 顕微鏡検査のために20 μLの単離されたBAを取り出します。

3. BAからのRNAおよびタンパク質の単離

1. BA層を2本の1.7 mLマイクロ遠心チューブにピペットで入れ、RNAとタンパク質を分離します。BAs層を乱すことなく、過剰なヨージキサノール溶液を慎重に除去します。
2. 1 mLのトリゾールを加えて、RNA、DNA、タンパク質を同時に細胞溶液に分離します。細胞を溶解するのに十分に混合する。
3. 200 μLのクロロホルムを加えて相を分離します。
4. チューブを9,981 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
5. 遠心分離後、RNA単離には水相を使用します。本研究では、逆転写には全RNAを用い、リアルタイムPCRを用いて定量RT-PCRを実施した。プライマー配列は 材料表に記載されています。
6. 300 μLの有機相を2 mLの微量遠心チューブに移します。
7. 有機相に、2.5容量の100%エタノールとボルテックスを10秒間加えます。
8. 200 μLの1-ブロモ-3-クロロプロパンを加え、10秒間ボルテックスします。
9. 600μLの二重蒸留水とボルテックスを10秒間加えます。
10. 混合溶液を室温で10分間放置する。
11. 9,981 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 このステップで、フェーズが分離されます。タンパク質相は中間層に局在する。
12. 一番上の水溶液を取り除きます。残りの溶液に1 mLの100%エタノールを加えます。
13. 10分間遠心分離、9,981 x g、4°C。 遠心分離後、タンパク質ペレットが形成されます。上澄み液を捨てる。
14. ペレットを1mLの100%エタノールで洗浄する。
15. 10分間遠心分離、9981 x g、4°C。 ペレットを保存し、上清を廃棄する。
16. ペレットを室温で10分間風乾します。
17. ウェットペレットの重量を測定します。20 μL/mgペレットの比率で1%SDS溶液を追加します。
18. チューブを加熱シェーカーに入れてペレットを溶解します。温度を55°C、速度を11 x gに設定します。タンパク質ペレットを完全に溶解するのに通常5〜10分かかります。
    注:溶解タンパク質の濃度は、BCAアッセイ¹⁴によって測定することができる。

結果

褐色脂肪細胞単離のための肩甲間BATの調製
褐色脂肪細胞(BA)の単離プロセスを 図1Aに示します。BATおよび消化/分離溶液の調製から単離されたBAの取得までのプロセス全体には、約4時間かかります。

成体マウスでは、肩甲骨間領域に豊富なBATが存在する。この肩甲骨間BAT(iBAT)は、筋肉層とWATで覆われています(図1B...

ディスカッション

本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためのBAを単離する新しい方法を開発しました。

公開されているBA分離プロトコルでは、3%BSA溶液を使用して^BA12を濃縮しました。それにもかかわらず、この公開されたプロトコルによって達成された濃縮BAは、タンパク質発現分析に直接使用することはできませんでした。これは、BAs溶液に存在する濃縮BS...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging