Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

Resumen

Este estudio describe un nuevo método para aislar adipocitos marrones murinos para el análisis de expresión génica y proteica.

Resumen

El tejido adiposo marrón (BAT) es responsable de la termogénesis sin temblores en los mamíferos, y los adipocitos marrones (BA) son las unidades funcionales de BAT. Las BA contienen gotitas lipídicas multiloculares y abundantes mitocondrias, y expresan la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1). Los BA se clasifican en dos subtipos según su origen: BA clásicos derivados de embriones (cBA) y BA derivados de adipocitos blancos. Debido a su densidad relativamente baja, los BA no pueden aislarse de las MTD con el método de centrifugación tradicional. En este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar BA de ratones para el análisis de expresión génica y proteica. En este protocolo, el BAT interescapular de ratones adultos se digirió con solución de colagenasa y dispase, y los BA disociados se enriquecieron con solución de iodixanol al 6%. Los BA aislados se lisaron con el reactivo Trizol para el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteína. Después del aislamiento del ARN, la fase orgánica del lisado se utilizó para la extracción de proteínas. Nuestros datos mostraron que la solución de iodixanol al 6% enriqueció eficientemente los BA sin interferir con los estudios de seguimiento de expresión génica y proteica. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales. En comparación con el tejido adiposo marrón, los BA aislados tenían una expresión significativamente mayor de Pdgfa. En resumen, este nuevo método proporciona una plataforma para estudiar la biología de los adipocitos marrones a nivel de tipo celular único.

Introducción

Tanto los ratones como los humanos tienen dos tipos de tejidos adiposos: tejido adiposo blanco (WAT) y tejido adiposo marrón (BAT)¹. WAT almacena energía en forma de triglicéridos en los adipocitos blancos, y los adipocitos marrones (BA) de BAT disipan la energía química en forma de calor². Según su origen en el desarrollo, los BA se clasifican en BA clásicos (cBA) que se formaron durante el desarrollo embrionario y BA derivados de adipocitos blancos (células beige / brite, convertidas de adipocitos blancos en condiciones de estrés)³. Los BA son multiloculares y expresan la proteína termogénica de desacoplamiento 1 (UCP1)⁴. El depósito interescapular de BAT (iBAT) es uno de los principales depósitos de cBA en pequeños mamíferos⁵, mientras que las células beige se dispersan dentro de WAT⁶.

Debido a su naturaleza de disipación de energía, los BA han recibido mucha atención como una diana terapéutica para reducir la obesidad⁷. Para explotar los BA con el propósito de tratar la obesidad, es esencial comprender los mecanismos moleculares que controlan la función, la supervivencia y el reclutamiento de los BA. Los tejidos adiposos, incluidos BAT y WAT, son heterogéneos. A excepción de los adipocitos, los tejidos adiposos contienen muchos otros tipos de células, como las células endoteliales, las células madre mesenquimales y los macrófagos⁸. Aunque existen herramientas genéticas para agotar específicamente los genes candidatos en ratones BA, como UCP1::Cre línea⁹, las técnicas para purificar BAT o WAT son limitadas, lo que dificulta el estudio de BA a nivel de tipo unicelular. Además, sin obtener BA puros, la relación entre BA y no BA no estará claramente delineada. Por ejemplo, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) se ha utilizado como marcador para células mesenquimales indiferenciadas, y se expresa en las células endoteliales e intersticiales de BAT. En las MTD estresadas por frío, las células progenitoras PDGFRα positivas dan lugar a nuevas BAs¹⁰. PDGFRα es activado por su ligando PDGF, un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales¹¹; sin embargo, no está claro si las BA influyen en el comportamiento de las células progenitoras PDGFRα positivas mediante la secreción de PDGF.

Recientemente, se ha publicado un protocolo de aislamiento de BAs, que se basa en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)¹². En este protocolo, se utilizó una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% para separar los BA de los no BA, y los BA enriquecidos se purificaron aún más mediante FACS. La aplicación de este protocolo está limitada por el requisito del proceso FACS, que se basa tanto en el equipo como en las experiencias de operación del FACS. En este estudio, se desarrolló un nuevo protocolo para aislar los BAT de las MTD. Los BA aislados por este protocolo se pueden utilizar directamente para estudios de expresión génica y proteica. Además, los datos de este estudio sugieren que los BA son un recurso importante de PDGF.

Protocolo

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Investigación Médica Masónica (IACUC). UCP1::Cre⁹ y Rosa 26^tdTomato ratones líneas¹³ fueron reportados previamente. Todos los ratones se mantuvieron a temperatura ambiente con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.

1. Preparación de las soluciones y el tejido adiposo marrón (MTD)

1. Prepare la solución de digestión y la solución de separación en tubos centrífugos de 15 ml.
2. 10 ml de solución de digestión BAT: Para 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS), agregue 3,5 mg/ml de dispasa II, 1 mg/ml de colagenasa II y 10 mM de CaCl₂ para hacer una solución de digestión BAT.
3. 10 ml de solución de iodixanol al 12% (solución de separación): Mezclar 1 mL de 10x PBS, 2 mL de iodixanol al 60%, 0.01 mL de 1 M MgCl 2, 0.025 mL de 1 M KCl, 0.1 mL de ácido etilendiaminotetraacético_0.2 M (EDTA) y 6.865 mL de ddH2O para obtener₁₂% de iodixanol.
4. Eutanasia a un ratón adulto con sobredosis de_CO2 . Brevemente, llene la jaula del ratón con 100% de_CO2 a una tasa de desplazamiento del 10-30% de volumen de la jaula por minuto. 5 minutos más tarde, confirme la muerte verificando la ausencia de respiración visible.
5. Diseccionar al animal y recoger las MTD interescapulares. Retire WAT y las capas musculares bajo un microscopio estéreo.
6. Para tener suficiente digestión, cortar cada lóbulo BAT en ~ 3 mm³ partes y colocarlos en un matraz limpio de 50 ml con una barra de agitación de metal y una solución de digestión de 5 ml. Antes de comenzar la digestión, deje reposar sobre hielo el matraz que contiene MTD y tampón de digestión.
   NOTA: En los siguientes pasos, se utilizaron alrededor de 80 mg de BAT para el aislamiento de adipocitos marrones.

2. Procedimiento de aislamiento de BA

1. Coloque el matraz en un agitador magnético que esté encerrado en una incubadora. Ajuste la velocidad de agitación a 60 rpm y la temperatura de la incubadora a 35 °C, respectivamente. La digestión durará alrededor de 30 minutos. Si las rodajas BAT forman grupos alrededor de la barra de agitación durante la digestión, use una punta de pipeta de 1 ml para interrumpir los tejidos agregados.
2. Coloque un filtro filtrador de 70 μm encima de un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Pipetear alrededor de 4 ml de suspensión celular a través del filtro. Lave el colador con 4 ml de solución de iodixanol al 12%. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células y la solución de iodixanol. Transfiera la mezcla celular a dos tubos de ensayo de poliestireno transparente de 5 ml.
   NOTA: Al final de la digestión, la solución de digestión debe estar turbia, lo que indica suficiente digestión. Use una solución de digestión fresca cada vez. Una vez preparada, la solución de digestión debe usarse dentro de las 2 h.
3. Repita los pasos 2.2 y 2.3 una vez más si la digestión no es suficiente.
4. Dejar los tubos de poliestireno transparente que contienen la solución de separación y los BA en hielo durante 1 h. Los BA formarán una capa en la parte superior.
5. Saque 20 μL de los BA aislados para examinarlos con microscopio.

3. Aislamiento de ARN y proteínas de BA

1. Pipetear la capa de BA en dos tubos de microcentrífuga de 1,7 ml para el aislamiento de ARN y proteínas. Retire con cuidado la solución excesiva de iodixanol sin interrumpir la capa de BAs.
2. Agregue 1 ml de Trizol para aislar simultáneamente el ARN, el ADN y la proteína en la solución celular. Mezclar lo suficiente para lisar las células.
3. Añadir 200 μL de cloroformo para separar las fases.
4. Centrifugar el tubo durante 9.981 x g durante 10 min a 4 °C.
5. Después de la centrifugación, use la fase acuosa para el aislamiento de ARN. En este estudio, se utilizó ARN total para la transcripción inversa y se realizó RT-PCR cuantitativa con PCR en tiempo real. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla de materiales.
6. Transfiera 300 μL de la fase orgánica a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
7. A la fase orgánica, agregue 2.5 volumen 100% etanol y vórtice durante 10 s.
8. Añadir 200 μL de 1-Bromo-3-cloropropano y vórtice durante 10 s.
9. Añadir 600 μL de agua destilada doble y vórtice durante 10 s.
10. Deje reposar la solución mezclada durante 10 minutos a temperatura ambiente.
11. Centrifugar a 9.981 x g durante 10 min a 4 °C. En este paso, las fases se separarán. La fase proteica se localiza en la capa media.
12. Retire la solución acuosa superior. Agregue 1 ml de etanol 100% en la solución restante.
13. Centrífuga durante 10 min, 9,981 x g, 4 °C. Después de la centrifugación, se formará el pellet de proteína. Deseche el sobrenadante.
14. Lave el pellet con 1 mL 100% etanol.
15. Centrífuga durante 10 min, 9981 x g, 4 °C. Guarde el pellet y deseche el sobrenadante.
16. Secar al aire el pellet durante 10 min a temperatura ambiente.
17. Mida el peso del pellet húmedo. Añadir una solución de SDS al 1% en una proporción de 20 μL/mg de pellet.
18. Disuelva el pellet colocando el tubo en una coctelera caliente. Ajuste la temperatura a 55 °C y la velocidad a 11 x g. Por lo general, se tarda de 5 a 10 minutos en disolver completamente el pellet de proteína.
    NOTA: La concentración de la proteína disuelta puede medirse mediante el ensayo BCA¹⁴.

Resultados

Preparación de MTD interacapular para el aislamiento de adipocitos marrones
El proceso de aislamiento de los adipocitos marrones (BA) se muestra en la Figura 1A. Todo el proceso, desde la preparación de las MTD y las soluciones de digestión/separación hasta la obtención de BA aislados, tomará alrededor de 4 h.

En ratones adultos, existe abundante BAT en la región interescapular. Este BAT interescapular (iBAT) está cubierto por capas mus...

Discusión

En este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar BA para el análisis de expresión génica y proteica.

En un protocolo de aislamiento de BA publicado, se utilizó una solución BSA al 3% para enriquecer los BA¹². Sin embargo, los BA enriquecidos logrados por este protocolo publicado no pudieron usarse directamente para el análisis de expresión de proteínas. Esto se debe a que la BSA concentrada existente en la solución de BA interfiere con la extracció...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging