Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica

Resumo

Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.

Resumo

O tecido adiposo marrom (BAT) é responsável pela termogênese não trêmula em mamíferos, e os adipócitos marrons (BAs) são as unidades funcionais dos BAT. Os BAs contêm gotículas lipídicas multiloculares e mitocôndrias abundantes, e expressam a proteína de desacoplamento 1 (UCP1). Os BAs são categorizados em dois subtipos com base em sua origem: BAs clássicos derivados de embriões (cBAs) e BAs derivados de adipócitos brancos. Devido à sua densidade relativamente baixa, os BAs não podem ser isolados do MTD com o método tradicional de centrifugação. Neste estudo, um novo método foi desenvolvido para isolar BAs de camundongos para análise de expressão gênica e proteica. Neste protocolo, a MTD interescapular de camundongos adultos foi digerida com solução de colagenase e dispase, e os BAs dissociados foram enriquecidos com solução de iodixanol a 6%. BAs isolados foram então lisados com reagente Trizol para isolamento simultâneo de RNA, DNA e proteína. Após o isolamento do RNA, a fase orgânica do lisado foi utilizada para a extração proteica. Nossos dados mostraram que a solução de iodixanol a 6% enriqueceu eficientemente os BAs sem interferir nos estudos de acompanhamento de expressão gênica e proteica. O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) é um fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais. Em comparação com o tecido adiposo marrom, os BAs isolados apresentaram expressão significativamente maior de Pdgfa. Em resumo, este novo método fornece uma plataforma para estudar a biologia dos adipócitos marrons em um único nível de tipo celular.

Introdução

Tanto camundongos quanto humanos possuem dois tipos de tecido adiposo: tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT)¹. WAT armazena energia na forma de triglicerídeos em adipócitos brancos, e os adipócitos marrons (BAs) de MTD dissipam energia química como calor². Com base em sua origem desenvolvimentista, os BAs são categorizados em BAs clássicos (cBAs) que se formaram durante o desenvolvimento embrionário e os BAs derivados de adipócitos brancos (células bege/brite, convertidas de adipócitos brancos sob condições de estresse)³. Os BAs são multiloculares e expressam a proteína termogênica de desacoplamento da proteína 1 (UCP1)⁴. O depósito de MTD interescapular (iBAT) é um dos principais depósitos de cBAs em pequenos mamíferos⁵, enquanto as células beges estão dispersas no WAT⁶.

Devido à sua natureza de dissipação de energia, os BAs têm recebido muita atenção como alvo terapêutico para a redução da obesidade⁷. Para explorar os BAs com a finalidade de tratar a obesidade, é essencial entender os mecanismos moleculares que controlam a função, a sobrevivência e o recrutamento dos BAs. Os tecidos adiposos, incluindo MTD e MTD, são heterogêneos. Com exceção dos adipócitos, os tecidos adiposos contêm muitos outros tipos de células, como células endoteliais, células-tronco mesenquimais e macrófagos⁸. Embora ferramentas genéticas para esgotar especificamente genes candidatos em BAs de camundongos estejam disponíveis, como UCP1::Cre linha⁹, as técnicas para purificar BAs de BAT ou WAT são limitadas, dificultando o estudo de BAs em um nível de tipo de célula única. Além disso, sem a obtenção de BAs puros, a relação entre BAs e não-BAs não será claramente delineada. Por exemplo, o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) tem sido usado como um marcador para células mesenquimais indiferenciadas, e é expresso nas células endoteliais e intersticiais de BAT. Em MTD estressadas a frio, as células progenitoras positivas para PDGFRα dão origem a novas BAs¹⁰. O PDGFRα é ativado por seu ligante PDGF, fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais¹¹; no entanto, não está claro se os BAs influenciam o comportamento das células progenitoras positivas para PDGFRα secretando PDGF.

Recentemente, foi publicado um protocolo de isolamento de BAs, que se baseia na classificação celular ativada por fluorescência (FACS)¹². Neste protocolo, a solução de albumina sérica bovina (BSA) a 3% foi usada para separar BAs de não-BAs, e os BAs enriquecidos foram purificados por FACS. A aplicação deste protocolo é limitada pela exigência do processo FACS, que depende de equipamentos e experiências de operação FACS. Neste estudo, um novo protocolo para o isolamento de BAs de MTD foi desenvolvido. Os BAs isolados por este protocolo podem ser usados diretamente para estudos de expressão gênica e proteica. Além disso, os dados deste estudo sugerem que os BAs são um importante recurso do PDGF.

Protocolo

Todos os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da pesquisa médica maçônica. UCP1::Cre⁹ e Rosa 26^tdLinhagens de camundongos tomateiro¹³ foram relatadas anteriormente. Todos os camundongos foram mantidos à temperatura ambiente com um ciclo claro/escuro de 12 h.

1. Preparação das Soluções e do tecido adiposo castanho (MTD)

1. Preparar a solução de digestão e a solução de separação em tubos de centrífuga de 15 ml.
2. 10 mL de solução de digestão MTD: Para 10 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), adicionar 3,5 mg/mL Dispase II, 1 mg/mL de colagenase II e 10 mM CaCl₂ para fazer solução de digestão MTD.
3. 10 mL de solução de iodixanol a 12% (solução de separação): Misture 1 mL de PBS 10x, 2 mL de iodixanol a 60%, 0,01 mL de 1 M MgCl 2, 0,025 mL de 1 M KCl, 0,1 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,2 M e 6,865 mL de ddH₂O para obter iodixanol a 12%.
4. Eutanasiar um rato adulto com sobredosagem de CO₂ . Resumidamente, encha a gaiola do rato com 100% de CO₂ a uma taxa de deslocamento de 10-30% do volume da gaiola por minuto. 5 min depois, confirme a morte verificando a ausência de respiração visível.
5. Dissecar o animal e recolher os MTD interescapulares. Remova as camadas WAT e muscular sob um microscópio estéreo.
6. Para uma digestão suficiente, corte cada lóbulo MTD em ~ 3 mm³ partes e coloque-as num balão limpo de 50 ml com uma barra de agitação metálica e uma solução de digestão de 5 ml. Antes de iniciar a digestão, deixar o balão contendo MTD e o tampão de digestão assentar no gelo durante 1 h.
   NOTA: Nas etapas a seguir, cerca de 80 mg de MTD foram utilizados para o isolamento de adipócitos marrons.

2. Procedimento de isolamento das BAs

1. Colocar o balão num agitador magnético fechado numa incubadora. Regule a velocidade de agitação a 60 rpm e a temperatura da incubadora a 35 °C, respectivamente. A digestão durará cerca de 30 minutos. Se as fatias MTD formarem aglomerados ao redor da barra do agitador durante a digestão, use uma ponta de pipeta de 1 mL para interromper os tecidos agregados.
2. Coloque um filtro de filtro de 70 μm em cima de um tubo de centrífuga limpo de 50 mL. Pipeta em torno de 4 mL de suspensão celular através do filtro. Lave o coador com 4 mL de solução de iodixanol a 12%. Pipetar para cima e para baixo para misturar as células e a solução de iodixanol. Transfira a mistura celular para dois tubos de ensaio de poliestireno transparentes de 5 mL.
   NOTA: No final da digestão, a solução de digestão deve estar turva, indicando digestão suficiente. Use solução de digestão fresca todas as vezes. Uma vez preparada, a solução de digestão deve ser usada dentro de 2 h.
3. Repetir os passos 2.2 e 2.3 mais uma vez se a digestão não for suficiente.
4. Deixar os tubos de poliestireno transparentes que contêm a solução de separação e os BAs no gelo durante 1 h. Os BAs formarão uma camada no topo.
5. Retirar 20 μL dos BAs isolados para exame microscópico.

3. RNA e isolamento proteico de BAs

1. Pipetar a camada de BAs em dois tubos de microcentrífuga de 1,7 mL para isolamento de RNA e proteína. Remova cuidadosamente a solução excessiva de iodixanol sem interromper a camada de BAs.
2. Adicione 1 mL de Trizol para isolar simultaneamente RNA, DNA e proteína na solução celular. Misture o suficiente para lisar as células.
3. Adicionar 200 μL de clorofórmio para separar as fases.
4. Centrifugar o tubo por 9,981 x g durante 10 min a 4 °C.
5. Após a centrifugação, use a fase aquosa para isolamento de RNA. Neste estudo, o RNA total foi utilizado para transcrição reversa, e a RT-PCR quantitativa foi realizada com PCR em Tempo Real. As sequências de primer estão listadas na Tabela de Materiais.
6. Transferir 300 μL da fase orgânica para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
7. Para a fase orgânica, adicione 2,5 volumes 100% etanol e vórtice por 10 s.
8. Adicionar 200 μL de 1-Bromo-3-cloropropano e vórtice por 10 s.
9. Adicione 600 μL de água destilada dupla e vórtice por 10 s.
10. Deixar repousar a solução misturada durante 10 minutos à temperatura ambiente.
11. Centrífuga a 9,981 x g durante 10 min a 4 °C. Nesta etapa, as fases serão separadas. A fase proteica está localizada na camada intermediária.
12. Remova a solução aquosa superior. Adicionar 1 ml de etanol a 100% à solução restante.
13. Centrífuga por 10 min, 9.981 x g, 4 °C. Após a centrifugação, o pellet de proteína se formará. Descarte o sobrenadante.
14. Lave o pellet com 1 mL de etanol a 100%.
15. Centrífuga por 10 min, 9981 x g, 4 °C. Salve o pellet e descarte o sobrenadante.
16. Seque o pellet ao ar por 10 minutos à temperatura ambiente.
17. Meça o peso do pellet molhado. Adicionar uma solução de SDS a 1% na proporção de 20 μL/mg de pellet.
18. Dissolva o pellet colocando o tubo em um agitador aquecido. Defina a temperatura em 55 °C e a velocidade em 11 x g. Geralmente leva 5-10 minutos para dissolver completamente o pellet de proteína.
    NOTA: A concentração da proteína dissolvida pode ser medida pelo ensaio de BCA¹⁴.

Resultados

Preparação de MTD interacapular para isolamento de adipócitos marrons
O processo de isolamento dos adipócitos marrons (BAs) está representado na Figura 1A. Todo o processo, desde a preparação das MTD e das soluções de digestão/separação até à obtenção de AG isoladas, demorará cerca de 4 h.

Em camundongos adultos, existe MTD abundante na região interescapular. Esta MTD interescapular (BATi) é recoberta por camadas musculares e...

Discussão

Neste estudo, um novo método de isolamento de BAs para análise de expressão gênica e proteica foi desenvolvido.

Em um protocolo de isolamento de BAs publicado, uma solução de BSA a 3% foi utilizada para enriquecer os BAs¹². No entanto, os BAs enriquecidos alcançados por este protocolo publicado não puderam ser usados diretamente para a análise da expressão proteica. Isso ocorre porque a BSA concentrada existente na solução de BAs interfere no acompanhamento ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging