Hücre Kiralitesini Ölçmek için Bir Mikrodesenleme Testi

Özet

Mikrodesenleme tekniğini kullanarak in vitro çok hücreli kiraliteyi belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, çeşitli hücre tiplerinin sol-sağ önyargılarının otomatik olarak ölçülmesine izin verir ve tarama amacıyla kullanılabilir.

Özet

Kiralite, asimetriyi hücrenin sol-sağ ekseni boyunca polarizasyon açısından gösteren içsel bir hücresel özelliktir. Bu eşsiz özellik, hem gelişim hem de hastalıktaki önemli rolleri nedeniyle artan bir dikkat çektiğinden, hücre kiralitesini karakterize etmek için standartlaştırılmış bir niceleme yöntemi, araştırmayı ve potansiyel uygulamaları ilerletecektir. Bu protokolde, mikrodesenli hücre dizilerini kullanan çok hücreli bir kiralite karakterizasyon testini tanımlıyoruz. Hücresel mikro desenler, mikrokontakt baskı yoluyla titanyum / altın kaplı cam slaytlar üzerinde üretilir. Geometrik olarak tanımlanmış (örneğin, halka şeklinde), protein kaplı adalarda tohumlamadan sonra, hücreler yönlü olarak göç eder ve özel olarak yazılmış bir MATLAB programı tarafından otomatik olarak analiz edilebilen ve ölçülebilen saat yönünde veya saat yönünün tersine doğru önyargılı bir hizalama oluşturur. Burada mikro desenli substratların üretimini, hücre tohumlamasını, görüntü toplamayı ve veri analizini ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve NIH / 3T3 hücreleri kullanılarak elde edilen temsili sonuçları gösteriyoruz. Bu protokol daha önce yayınlanmış birçok çalışmada doğrulanmıştır ve in vitro hücre kiralitesini incelemek için etkili ve güvenilir bir araçtır.

Giriş

Hücrenin sol-sağ (LR) asimetrisi, hücresel elverişlilik veya kiralite olarak da bilinir, LR eksenindeki hücre polaritesini tanımlar ve temel, korunmuş, biyofiziksel bir özellik olarak kabul edilir ^1,2,3,4,5. Hücre kiralitesi hem in vivo hem de in vitro olarak çoklu ölçeklerde gözlenmiştir. Önceki bulgular, dairesel adalar ^6'ya ekilen tek hücrelerde aktin sitoiskeletinin kiral dönüşünü, 7,8,9,10,11 sınırlı sınırlar içindeki hücrelerin önyargılı göçünü ve hizalanmasını ve tavuk ısı tüpünün asimetrik döngüsünü ¹² ortaya koymuştur.

Çok hücreli düzeyde, hücre kiralitesi yönlü migrasyon veya hizalama, hücresel rotasyon, sitoiskelet dinamikleri ve hücre organeli konumlandırma 7,8,9,10,11,12,13 ile belirlenebilir. ^7,8,9,10 yapışkan hücrelerin kiral yanlılığını etkili bir şekilde karakterize etmek için mikrosendikleme tabanlı ¹⁴ tahlil oluşturduk. Halka şeklindeki mikro desenlerin geometrik olarak hücre kümelerini sınırlamasıyla, hücreler toplu olarak yönlü göç ve önyargılı hizalama sergiler. Halkanın faz-kontrast görüntülerindeki hücre hizalamasını otomatik olarak tespit etmek ve ölçmek için bir MATLAB programı geliştirilmiştir. Yerel hücre hizalamasının yönü, çevresel yönden sapmasına bağlı olarak önyargılı bir açı ile ölçülür. İstatistiksel analizi takiben, hücrelerin halka paterni saat yönünün tersine (CCW) önyargılar veya saat yönünde (CW) önyargılar olarak belirlenir.

Bu tahlil, çoklu hücre fenotiplerinin kiralitesini karakterize etmek için kullanılmıştır (Tablo 1) ve hücrelerin LR asimetrisinin fenotipe özgü ^7,11,15 olduğu bulunmuştur. Ayrıca, aktin dinamikleri ve morfolojisindeki bozulma, kiral önyargı ^7,8'in tersine dönmesine neden olabilir ve oksidatif stres hücre kiralitesini de değiştirebilir⁹. Prosedürün basitliği ve 7,8,9,10 yaklaşımının sağlamlığı nedeniyle, bu 2D kiralite testi^, in vitro çok hücreli kiraliteyi belirlemek ve incelemek için etkili ve güvenilir bir araç sağlar.

Bu protokolün amacı, hücre kiralitesini karakterize etmek için bu yöntemin kullanımını göstermektir. Bu protokol, mikrokontakt baskı tekniği ile desenli hücresel dizilerin nasıl üretileceğini ve MATLAB programını kullanarak otomatik bir şekilde kiralite analizinin nasıl yapılacağını açıklar.

Protokol

1. Polidimetilsiloksan (PDMS) pullarının imalatı¹⁶

1. CAD yazılımını kullanarak, iç çapı 250 μm ve dış çapı 450 μm olan bir dizi mikro ölçekli halka çizin. Bu protokolde kullanılan desen, halkalar arasında 850 μm mesafeye sahip 10 x 10 dizidir.
2. Bir mikrofabrikasyon şirketinin maske baskı hizmetini kullanarak desenin saydamlık maskesini istenen çözünürlükte yazdırın (bkz.
   NOT: Halkanın sağlanan boyutlarının birçok hücre tipi⁷ için çalıştığı kanıtlanmıştır.
3. Negatif fotodirenç kalıbı (SU-8 gibi)⁸ yapmak için istenen özellikleri içeren maskeyi kullanarak ultraviyole (UV) fotolitografi yapın.
   1. Fotodirenç ile kaplanmış silikon gofret eğirme makinesini, 1.1-1.2 adımlarında üretilen saydamlık maskesiyle örtün.
   2. Bir UV temas hizalayıcısında, fotodirenci maskenin şeffaf bölgeleri altında UV ışığı ile polimerize edin.
      NOT: Daha fazla yıkama ve geliştirmeden sonra, istenen özelliklere sahip ana kalıp imal edilir⁸. Çalışma ayrıntıları, kullanılan özel ekipmana bağlıdır.
4. PDMS elastomerik prepolimerlerini, kürleme maddesi ile 10: 1 oranında karıştırarak hazırlayın ve ardından karışımı bir Petri kabında kalıba dökün.
5. PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için kabı 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin ve en az 2 saat boyunca 60 ° C'de bir fırında pişirin.
6. PDMS'nin tamamen kürlenmesinden sonra, desen dizilerini damgalar halinde kesin.
   NOT: Mikrokontakt baskının sonraki aşamalarında kullanım kolaylığı nedeniyle daha kalın pullar (yaklaşık 1 cm) tercih edilebilir.

2. Cam slaytların kaplanması

1. Cam slaytları temizleyin. Slaytları% 100 etanol banyosuna batırın, 5 dakika boyunca sonikatın ve ardından suyla durulayın.
2. Bu adımı önce asetonla, sonra izopropanolle, ardından azot akışında kurutarak tekrarlayın.
3. Cam slaytlar üzerindeki titanyum ve altın katmanları kaplamak için bir elektron ışını (E-ışın) buharlaştırma ekipmanı kullanın.
   NOT: Titanyum tabakası için istenen kalınlık 15 Å'dır (1 ş= ^10-10 m). Altın tabaka için istenen kalınlık 150 Å'dir. Titanyum tabakası altın ve cam slayt arasında bir yapıştırıcı görevi gördüğünden, önce titanyumu ve sonra altını kaplayın.
4. Temizlenmiş kızakları buharlaştırma odasına yerleştirin ve panjurların altına altın ve titanyum potalar yerleştirin.
5. Metalleri eritmeden önce ^10-5 Pa'dan daha düşük bir vakum oluşturmak için odayı aşağı pompalayın. Elektron ışınını metale odaklayın ve gücü, biriktirme hızının biriktirme kalınlığını kontrol etmek için uygun olacak şekilde ayarlayın.
6. Metal biriktirmeyi başlatmak için deklanşörü açın. İstenilen kalınlığa ulaşıldığında deklanşörü kapatın.
7. Potaları iki metalin sıralı buharlaşması arasında değiştirin.
8. Potaların ekipmanın gerektirdiği şekilde soğumasını bekleyin, odayı boşaltın ve altın kaplı cam kızakları dışarı çıkarın.
9. Ekipman bakımı için odayı tekrar aşağı pompalayın.
   NOT: Çalışma detayları belirli bir E-ışınlı evaporatöre bağlı olabilir. İyi kontrol edilmiş, düşük titanyum biriktirme oranına sahip olmak önemlidir. Kalın bir titanyum tabakası, özellikle hücrelerin floresan görüntülemesi için genellikle zayıf görünürlüğe yol açar. Titanyum/altın kaplı cam slaytlar kaplamadan sonra oda sıcaklığında kuru vakum odasında en az 1 ay saklanabilir.

3. Mikrokontakt baskı

1. İsterseniz titanyum/altın kaplı sürgüyü daha küçük parçalara ayırın. Tipik bir uygulama için 12 mm x 12 mm'lik kare bir şekil önerilir (Şekil 1B).
2. Ezilmiş bir iz bırakmak için yüzey boyunca kaymak için bir cam kesici kullanın, ardından cam sürgüyü her iki tarafta tutun ve küçük mahallelere ayrılmak için göçükte bükün. Altın kaplı yüzeye dokunmaktan kaçının.
   NOT: Yanlışlıkla devrilme durumunda camın hangi tarafının kaplanmış yüzey olduğunu görsel olarak belirlemek için, ışığın her iki taraftaki yansımasını karşılaştırın. Altın kaplı yüzey daha parlak bir yansıma gösterirken, kaplanmamış taraf daha kısık bir yansımaya sahip olacaktır (camın diğer tarafındaki titanyum tabakasından). Alternatif bir yol, kızağın kenarlarını gözlemlemektir ve kaplama tarafı dikey kesme yüzeyinden belirlenebilir.
3. Slaytları, bir Petri kabında% 100 etanol içine batırarak, altın tarafı yörüngesel bir çalkalayıcıda en az 10 dakika boyunca yukarı bakacak şekilde temizleyin. Etanolün aspire edilmesi, ardından her slaytın bir azot akımı ile üflenerek kurutulması.
4. PDMS pullarını sabunlu su ve% 100 etanol ile temizleyin. Pulları azot gazı ile kurulayın.
5. 10 mL% 100 etanol içinde 5.74 mg C18 tozunu çözerek 2 mM oktadecanethiol (C18) çözeltisi hazırlayın.
   NOT: C18 solüsyonunu oda sıcaklığında kapatın ve saklayın. C18 ile baskı desenleri, fibronektin ve hücrelerin tercihen bağlanacağı yapışkan, kendinden montajlı bir tek katman oluşturur.
6. PDMS damgalarını, desenli yüzeyi 10 sn boyunca aşağı bakacak şekilde C18 çözeltisine batırın ve 60 sn boyunca azot gazı ile hafifçe kurulayın.
   NOT: Kurutulurken, çoğu sıvı buharlaşana kadar akışı önce damgadan uzağa (yaklaşık 1 m) yerleştirin ve ardından damgayı tamamen kurutmak için akışı yavaşça yaklaştırın. Bu, C18 çözeltisinin damga üzerinde kuruması yerine üflenmesini önlemek içindir.
7. Çıkarmadan önce damgayı 60 saniye boyunca altın slaytların üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
8. Doğru damgalamayı sağlamak için, desenleri düzgün bir şekilde aktarmak üzere cımbızları yavaşça pulların üzerine dokunun. Çok sert bastırmayın ve cımbızın ağırlığı tipik olarak yeterlidir.
   NOT: Kılavuz çekme sırasında damganın görsel olarak incelenmesi, damganın ve cam sürgünün düzgün bir şekilde temas etmesini sağlayacaktır.
9. Nem odaları hazırlayın.
   1. Pipet, ters çevrilmiş bir Petri kabı kapağına 1 mL% 70 etanol koyun ve yüzeyi örtmek için bir parça parafilm yerleştirin (yüzü yukarı bakacak şekilde örtülür).
   2. Kaldırmak için cımbız kullanın, hava kabarcığı olmadığından emin olmak için parafilm yerleştirin ve gerekirse fazla etanol çıkarın.
10. 2 mM HS-(CH₂)_{11-EG 3-OH} (EG3) çözeltisi hazırlayın: 5 mL% 100 etanol içinde 5 μL stok çözeltisini seyreltin.
    NOT: Seyreltilmiş EG3 çözeltisi 4 °C'de kapatılabilir ve saklanabilir ve seyreltilmemiş EG3 stoğu -20 °C'de saklanmalıdır. EG3 işlemi, C18 içermeyen cam bölgesini hücrelere yapışkan olmayan hale getirmek için kullanılır.
11. Her çeyrek cam için mikropipet 40 μL EG3 damlacıkları nem odasındaki parafilm üzerine kaydırılır ve damlacıklar arasında altın slaytların aralığını hesaba katmak için yeterli boşluk bırakır.
12. C18 baskılı altın slaytları damlacıkların üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirmek ve slaytların altında kabarcık olmadığından emin olmak için cımbız kullanın. Buharlaşmayı en aza indirmek için kızakları kaldırmadan yavaşça itin.
    NOT: Camın bir kenarının damlacığın yanına aşağı doğru kaymasını yerleştirin ve ardından camın diğer ucunu yavaşça aşağı doğru indirin. Bir kabarcık varsa, kabarcık artık mevcut olmayana kadar altın slaytı kaldırmadan itin.
13. Petri kabını parafilm ile sıkıca kapatın ve oda sıcaklığında en az 3 saat bekletin.
    NOT: Kapsamlı inkübasyon isteniyorsa, Petri kabını çift kapatın ve 24 saate kadar bekletin.
14. Bir biyogüvenlik dolabında, altın slaytları bir Petri kabına yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin, EG3'ü çıkarmak için% 70 etanolde 3 kez ıslatın ve durulayın, ardından sterilizasyon için 10 dakika boyunca etanolde bırakın.
15. Etanol aspire edin ve steril PBS ile değiştirin.
16. Adım 3.9'da açıklandığı gibi, etanol yerine PBS ile başka bir nem odası hazırlayın.
    NOT: Yüzey gerilimindeki fark nedeniyle, önce parafilm döşemek ve kabarcıkları çıkarmak için 4-5 mL PBS eklemek, ardından fazlalığı aspire etmek daha kolaydır.
17. 50 μg / mL fibronektin çözeltisini (istenirse diğer proteinler) steril PBS ve mikropipet içinde hazırlayın 50 μL fibronektin çözeltisi damlacıkları her çeyrek için parafilm üzerine kaydırın ve damlacıklar arasında biraz boşluk bırakın.
    NOT: Fibronektin kaplama, desenli yüzeylere hücre yapışmasını kolaylaştırır.
18. Slaytları damlacıkların üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirmek ve slaytların altında kabarcık olmadığından emin olmak için gofret cımbız kullanın. Slaytları kaldırmadan yavaşça itin.
    NOT: Slaytların işlenmesi için cam sürgü cımbız veya düz geniş uçlu gofret cımbız önerilir.
19. Petri kabını biyogüvenlik kabininde 30 dakika bekletin.
20. 30 dakika sonra, altın slaytları 3 kez duruladıktan sonra PBS'ye yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
    NOT: Fibronektin desenli slaytlar PBS'de 4 °C'de yaklaşık bir ay saklanabilir.

4. Hücreleri mikro desenli slaytlara tohumlama

1. Hücre kültürü ortamını ve tripsini 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
   NOT: Aşağıdaki alt kültür açıklaması NIH/3T3 hücreleri içindir. Kültür koşulları hücre tiplerine bağlı olarak değişebilir.
2. (İsteğe bağlı) Desenli slaytları kültür ortamında 12 delikli bir plakaya batırın, daha iyi hücre bağlantısı için hücrelerin tripsinizasyonundan önce bir inkübatörde 37 ° C'ye kadar ısıtın.
3. Hücreleri tripsinize edin, FBS içeren ortamlarla nötralize edin, 3 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın ve ardından taze ortamlarla iyice karıştırarak yeniden askıya alın.
   NOT: Hücrelerin birbirinden tamamen ayrıştığından emin olun.
4. Hücreleri sayın, 200.000 hücre / mL'ye seyreltin ve bir altın slayt içeren her bir kuyucuğa 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
5. Tek tip hücre tohumlaması için kuyu plakasını birkaç kez hafifçe çalkalayın ve hücre tutturmasına izin vermek için 15 dakika boyunca bir inkübatörde saklayın.
6. 15 dakika sonra, hücre bağlantısını mikroskop altında kontrol edin. Gerekirse ek süre tanıyın.
   NOT: Ekli hücreler görünür filopodyum veya düzleşme ile yüzeye yayılacak ve kuyu plakasına hafifçe dokunulduğunda veya hareket ettirildiğinde yüzeyden hareket etmeyecektir.
7. Her bir kuyucuktan bağlanmamış hücreler içeren ortamı aspire edin ve 1 mL kültür ortamı ekleyin. İlaç tedavisi için, bu adımda kültür ortamına ek reaktifler ekleyin.
8. İnkübatördeki hücreleri 24 saat boyunca kültürleyin ve kiralitenin oluşup oluşmadığını belirlemek için akıcılığı kontrol edin.
   NOT: Çoğu hücre tipi için% 75'in üzerinde akıcılık önerilir ve aşırı akıcılık kiralite karakterizasyonunu etkileyebilir.

5. Görüntü toplama

1. Hücreleri akıcılık üzerine sabitleyin.
   1. Kültür ortamını kuyu plakasından çıkarın ve PBS ile bir kez durulayın.
   2. % 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve ardından PBS ile 3 kez durulayın.
      NOT: Fiksasyon hücre morfolojisini önemli ölçüde değiştiriyorsa, fiksasyondan önce görüntüleme önerilir.
2. Kamera işlevselliğine sahip bir faz kontrastı mikroskobu kullanın, slaytlardaki her halkayı yüksek çözünürlükte görüntüleyin (analiz için 10x nesne lensi yeterlidir).

6. Hücre kiralite karakterizasyonu (Şekil 2)

1. Ek dosyalardan kiralite karakterizasyonu için MATLAB kod dosyalarını indirin (Ek Dosya 1).
   NOT: Kod, hem Windows hem de macOS sistemlerinde MATLAB_R2015b ve sonraki sürümlerle çalışacak şekilde test edilmiştir. Döngüsel istatistik araç kutusu, başvuru^17'de bulunan dosyaları çalıştırmak için de gereklidir.
2. Kod klasörünü ve alt klasörleri (içinde dairesel istatistik araç kutusu bulunan) MATLAB yoluna ekleyin ve "ROI_selection.m" dosyasını açın. 4. satırda, dizini istediğiniz veri klasörüne değiştirin (Windows kullanıcıları için, 4. ve 5. satırlarda "/" yerine "\" değiştirin).
3. 14. satırdaki görüntü boyutunu, ilk iki rakam halkanın iç daire boyutunu temsil ederken, diğer ikisi dışını temsil edecek şekilde değiştirin.
   NOT: Analiz edilecek bir klasördeki tüm görüntülerin boyutlarının aynı olduğundan emin olun.
4. Faz kontrastlı görüntülerdeki ilgi alanını (ROI) belirlemek üzere "ROI_selection.m" MATLAB kodunu yürütmek için Çalıştır düğmesine tıklayın.
5. Halkaya sığması için seçim karesini manuel olarak sürükleyin, ardından seçimi onaylamak için resme çift tıklayın.
6. Klasördeki her görüntü için bu adımı tekrarlayın (önceki bir görüntünün YG seçimini onayladıktan sonra bir sonraki görüntü otomatik olarak açılır); her görüntünün yatırım getirisi bilgilerini depolamak için bir ".mat" dosyası oluşturulur.
7. "Analysis_batch.m" dosyasını açın ve adım 6.2 ile aynı klasörün dizinini değiştirin. (Pencere kullanıcıları için, ilk kez kullanım için, 5, 6, 124 ve 130. satırlarda "/" yerine "\" değiştirin)
8. Birden fazla hücresel halka modelinin kiralitesini belirlemek üzere "Analysis_batch m" kodunu yürütmek için Çalıştır düğmesine tıklayın. Her halka için dairesel istatistiklerin yanı sıra saat yönünde, kiral olmayan ve saat yönünün tersine halkaların sayılarını içeren bir "datatoexcel.txt" dosyası oluşturulacaktır.

Sonuçlar

NIH / 3T3 hücrelerinin tohumlanmasından on beş dakika sonra, halka paternindeki hücre yapışması, faz kontrastlı görüntüleme ile görsel olarak doğrulandı. Daha sonra 24 saatlik kültürden sonra, desenler üzerindeki hücreler birleşti ve saat yönüne doğru önyargılı, açıkça asimetrik hizalamalarla uzadı (Şekil 2). Bağlı hücrelerin yönlü göçü hızlandırılmış görüntüleme ile kaydedilir, hücre hareketliliği ve morfogenezi videonun daha ileri analizleriy...

Tartışmalar

Burada açıklanan halka şeklindeki modelleme testi, çok hücreli kiralitenin kantitatif karakterizasyonu için kullanımı kolay, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilen bir araç sağlar. Aynı tanımlanmış mikro ortamların hızlı bir şekilde oluşturulması ve tarafsız analiz, büyük boyutlu numunelerin otomatik olarak yüksek verimli bir şekilde işlenmesini sağlar. Bu protokol, halka mikro desenlerinin üretimini, hücre desenini ve önyargılı hücre hizalamasının ve yönlü har...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Koptec	DSP-MD-43
BZX microscope system	Keyence	BZX-600
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Electron beam evaporator	Temscal	BJD-1800	Gold-titanum film coating
Fetal bovine serum	VWR	89510-186
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG
Glass microscope slides	VWR	10024-048
Glass tweezers	Exelta	390BSAPI
Gold evaporation pellets	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
OAI contact aligner	OAI	200	UV photolithography
Octadecanethiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Orbital shaker	VWR	89032-088
Phosphate buffered saline (PBS)	Research product international	P32080-100T
Polydimethylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon Wafer	University Wafer	ID#809
Sodium pyruvate	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Titanium evaporation pellets	International Advanced Materials	TI14
Transparency mask (with feature)	Outputicity.com	N/A	Mask printing service
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072