Un test de micromodélisme pour mesurer la chiralité cellulaire

Résumé

Nous présentons un protocole pour déterminer la chiralité multicellulaire in vitro, en utilisant la technique du micromodèlement. Ce test permet une quantification automatique des biais gauche-droite de divers types de cellules et peut être utilisé à des fins de dépistage.

Résumé

La chiralité est une propriété cellulaire intrinsèque, qui dépeint l’asymétrie en termes de polarisation le long de l’axe gauche-droite de la cellule. Comme cette propriété unique attire de plus en plus l’attention en raison de ses rôles importants dans le développement et la maladie, une méthode de quantification normalisée pour caractériser la chiralité cellulaire ferait progresser la recherche et les applications potentielles. Dans ce protocole, nous décrivons un test de caractérisation de chiralité multicellulaire qui utilise des réseaux de cellules micromotifs. Les micromotifs cellulaires sont fabriqués sur des lames de verre revêtues de titane / or via l’impression par microcontact. Après avoir ensemencé sur les îlots géométriquement définis (par exemple, en forme d’anneau) enrobés de protéines, les cellules migrent directionnellement et forment un alignement biaisé dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, qui peut être automatiquement analysé et quantifié par un programme MATLAB écrit sur mesure. Nous décrivons ici en détail la fabrication de substrats à micromotifs, l’ensemencement cellulaire, la collecte d’images et l’analyse de données et montrons des résultats représentatifs obtenus à l’aide des cellules NIH / 3T3. Ce protocole a déjà été validé dans de multiples études publiées et constitue un outil efficace et fiable pour étudier la chiralité cellulaire in vitro.

Introduction

L’asymétrie gauche-droite (LR) de la cellule, également connue sous le nom de maniabilité cellulaire ou chiralité, décrit la polarité cellulaire dans l’axe LR et est reconnue comme une propriété biophysique fondamentale et conservée 1,2,3,4,5. La chiralité cellulaire a été observée in vivo et in vitro à plusieurs échelles. Des résultats antérieurs ont révélé un tourbillon chiral du cytosquelette d’actine dans des cellules individuelles ensemencées sur des îlots circulaires⁶, une migration et un alignement biaisés des cellules dans des limites confinées 7,8,9,10,11 et une boucle asymétrique du tube chauffant de poulet ¹².

Au niveau multicellulaire, la chiralité cellulaire peut être déterminée à partir de la migration ou de l’alignement directionnel, de la rotation cellulaire, de la dynamique du cytosquelette et du positionnement des organites ^cellulaires 7,8,9,10,11,12,13. Nous avons établi un test¹⁴ basé sur le micromodèlement pour caractériser efficacement le biais chiral des cellules adhérentes 7,8,9,10. Avec les micromotifs en forme d’anneau confinant géométriquement les amas de cellules, les cellules présentent collectivement une migration directionnelle et un alignement biaisé. Un programme MATLAB a été développé pour détecter et mesurer automatiquement l’alignement des cellules dans les images à contraste de phase de l’anneau. La direction de l’alignement local des cellules est quantifiée avec un angle biaisé, en fonction de son écart par rapport à la direction circonférentielle. Après analyse statistique, le motif en anneau des cellules est désigné soit comme des biais dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW), soit comme des biais dans le sens des aiguilles d’une montre (CW).

Ce test a été utilisé pour caractériser la chiralité de phénotypes cellulaires multiples (tableau 1), et l’asymétrie LR des cellules s’est avérée être spécifique au phénotype ^7,11,15. De plus, la perturbation de la dynamique et de la morphologie de l’actine peut entraîner une inversion du biais chiral ^7,8, et le stress oxydatif peut également altérer la chiralité cellulaire⁹. En raison de la simplicité de la procédure et de la robustesse de ^{l’approche 7,8,9,10}, ce test de chiralité 2D fournit un outil efficace et fiable pour déterminer et étudier la chiralité multicellulaire in vitro.

Le but de ce protocole est de démontrer l’utilisation de cette méthode pour caractériser la chiralité cellulaire. Ce protocole décrit comment fabriquer des réseaux cellulaires à motifs via la technique d’impression par microcontact et effectuer une analyse de chiralité de manière automatisée à l’aide du programme MATLAB.

Protocole

1. Fabrication de timbres en polydiméthylsiloxane (PDMS)¹⁶

1. Dessinez un réseau d’anneaux à micro-échelle à l’aide d’un logiciel de CAO, d’un diamètre intérieur de 250 μm et d’un diamètre extérieur de 450 μm. Le modèle utilisé dans ce protocole est un réseau de 10 x 10 avec une distance de 850 μm entre les anneaux.
2. Imprimez un masque transparent du motif à la résolution souhaitée à l’aide du service d’impression de masques d’une société de microfabrication (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE: Les dimensions fournies de l’anneau ont été prouvées pour fonctionner pour de nombreux types de cellules⁷.
3. Effectuez une photolithographie ultraviolette (UV) à l’aide du masque contenant les caractéristiques souhaitées pour créer un moule photorésistant négatif (tel que SU-8)⁸.
   1. Recouvrir une plaquette de silicium recouverte de résine photosensible par le masque transparent fabriqué aux étapes 1.1-1.2.
   2. Sur un aligneur de contact UV, polymériser la résine photosensible sous des régions transparentes du masque par la lumière UV.
      REMARQUE: Après un lavage et un développement ultérieurs, le moule principal avec les caractéristiques souhaitées est fabriqué⁸. Les détails opérationnels dépendent de l’équipement spécifique utilisé.
4. Préparez les prépolymères élastomères PDMS en mélangeant avec son agent de durcissement à un rapport de 10: 1, puis jetez le mélange sur le moule dans une boîte de Pétri.
5. Placer le plat dans une chambre à vide pendant 30 min pour éliminer les bulles d’air dans le PDMS et cuire au four à 60 °C pendant au moins 2 h.
6. Une fois le durcissement complet de PDMS, découpez les tableaux de motifs en tampons.
   REMARQUE: Des tampons plus épais (environ 1 cm) peuvent être préférés en raison de la facilité de manipulation aux étapes ultérieures de l’impression par microcontact.

2. Revêtement des lames de verre

1. Nettoyez les lames de verre. Faire tremper les lames dans un bain à 100% éthanol, soniquer pendant 5 min, puis rincer à l’eau.
2. Répétez cette étape d’abord avec de l’acétone, puis avec de l’isopropanol, puis avec un séchage dans un flux d’azote.
3. Utilisez un équipement d’évaporation par faisceau d’électrons (faisceau E) pour recouvrir les couches de titane et d’or sur les lames de verre.
   REMARQUE: Pour la couche de titane, l’épaisseur souhaitée est de 15 Å (1 Å = ^10-10 m). Pour la couche d’or, l’épaisseur souhaitée est de 150 Å. Recouvrez d’abord le titane, puis l’or, car la couche de titane sert d’adhésif entre l’or et la lame de verre.
4. Placez les glissières nettoyées dans la chambre d’évaporation et insérez des creusets en or et en titane sous les volets.
5. Pompez la chambre pour créer un vide inférieur à ^10-5 Pa avant de faire fondre les métaux. Concentrez le faisceau d’électrons sur le métal et ajustez la puissance de sorte que le taux de dépôt soit approprié pour contrôler l’épaisseur du dépôt.
6. Ouvrez l’obturateur pour commencer le dépôt de métal. Fermez l’obturateur lorsque l’épaisseur souhaitée est atteinte.
7. Basculer les creusets entre l’évaporation séquentielle de deux métaux.
8. Attendez que les creusets refroidissent comme l’exige l’équipement, évacuez la chambre et retirez les glissières en verre revêtu d’or.
9. Pompez à nouveau la chambre pour l’entretien de l’équipement.
   REMARQUE: Les détails opérationnels peuvent dépendre d’un évaporateur à faisceau E spécifique. Il est important d’avoir un faible taux de dépôt de titane bien contrôlé. Une épaisse couche de titane entraîne souvent une mauvaise visibilité, en particulier pour l’imagerie par fluorescence des cellules. Après le revêtement, les lames de verre revêtues de titane / or peuvent être stockées dans une chambre à vide sèche à température ambiante pendant au moins 1 mois.

3. Impression par microcontact

1. Coupez la glissière revêtue de titane / or en plus petits morceaux, si vous le souhaitez. Une forme carrée de 12 mm x 12 mm est recommandée pour une application typique (Figure 1B).
2. Utilisez un coupe-verre pour glisser sur la surface afin de laisser une trace bosselée, puis maintenez la glissière de verre des deux côtés et pliez-la à la bosse pour se briser en petits quartiers. Évitez de toucher la surface recouverte d’or.
   REMARQUE: Pour déterminer visuellement quel côté du verre est la surface revêtue en cas de basculement accidentel, comparez la réflexion de la lumière des deux côtés. La surface recouverte d’or montrera une réflexion plus brillante, tandis que le côté non revêtu aura une réflexion plus faible (de la couche de titane de l’autre côté du verre). Une autre façon est d’observer les bords de la glissière, et le côté du revêtement peut être déterminé à partir de la surface de coupe verticale.
3. Nettoyez les lames en trempant dans de l’éthanol à 100% dans une boîte de Pétri avec le côté or vers le haut sur un agitateur orbital pendant au moins 10 min. Aspirer l’éthanol, puis sécher chaque lame en soufflant avec un flux d’azote.
4. Nettoyez les tampons PDMS avec de l’eau savonneuse puis 100% d’éthanol. Séchez les tampons avec de l’azote gazeux.
5. Préparer une solution d’octadécanéthiol (C18) de 2 mM en dissolvant 5,74 mg de poudre de C18 dans 10 mL d’éthanol à 100 %.
   REMARQUE: Scellez et conservez la solution de C18 à température ambiante. L’impression de motifs avec C18 crée une monocouche auto-assemblée adhésive pour laquelle la fibronectine et les cellules se fixeront préférentiellement.
6. Faire tremper les tampons PDMS dans une solution en C18 avec la surface à motifs orientée vers le bas pendant 10 s et sécher doucement avec de l’azote gazeux pendant 60 s.
   REMARQUE: Lors du séchage, placez d’abord le flux loin du tampon (environ 1 m) jusqu’à ce que la majeure partie du liquide soit évaporée, puis rapprochez lentement le flux pour sécher complètement le tampon. Il s’agit d’éviter que la solution de C18 ne soit soufflée au lieu de sécher sur le tampon.
7. Posez le tampon face cachée sur les glissières dorées pendant 60 s avant de le retirer.
8. Pour assurer un estampage correct, tapotez doucement la pince à épiler sur les tampons pour transférer correctement les motifs. Ne poussez pas trop fort et le poids de la pince à épiler est généralement suffisant.
   REMARQUE: L’inspection visuelle du tampon pendant le taraudage permettra de s’assurer que le tampon et la lame de verre sont entrés en contact uniformément.
9. Préparez des chambres d’humidité.
   1. Pipette 1 mL d’éthanol à 70 % dans un couvercle de boîte de Petri inversé et déposer un morceau de parafilm pour couvrir la surface (couvert face vers le haut).
   2. Utilisez une pince à épiler pour soulever, déposez un parafilm pour éviter les bulles d’air et éliminez l’excès d’éthanol si nécessaire.
10. Préparer 2 mM de solution HS-(CH₂)_{11-EG 3-OH} (EG3) : Diluer 5 μL de solution mère dans 5 mL d’éthanol à 100 %.
    REMARQUE: La solution diluée d’EG3 peut être scellée et stockée à 4 °C, et le bouillon d’EG3 non dilué doit être conservé à -20 °C. Le traitement EG3 est utilisé pour rendre la région du verre sans C18 non adhésive pour les cellules.
11. Micropipette de 40 μL de gouttelettes d’EG3 pour chaque quart de verre glissent sur le parafilm dans la chambre d’humidité, laissant suffisamment d’espace entre les gouttelettes pour tenir compte de l’espacement des lames d’or.
12. Utilisez une pince à épiler pour placer des lames dorées imprimées C18 face cachée sur les gouttelettes et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les diapositives. Poussez doucement les glissières ensemble sans les soulever pour minimiser l’évaporation.
    REMARQUE: Placez un bord des glissières de verre vers le bas près de la gouttelette, puis abaissez lentement l’autre extrémité de la glissière de verre vers le bas. Si une bulle est présente, poussez la glissière d’or sans la soulever jusqu’à ce que la bulle ne soit plus présente.
13. Scellez hermétiquement la boîte de Petri avec un parafilm et laissez-la à température ambiante pendant au moins 3 h.
    REMARQUE: Si une incubation intensive est souhaitée, scellez deux fois la boîte de Petri et laissez-la jusqu’à 24 h.
14. Dans une armoire de biosécurité, placez des lames d’or face vers le haut dans une boîte de Pétri, trempez et rincez 3 fois dans de l’éthanol à 70% pour éliminer l’EG3, puis laissez dans l’éthanol pendant 10 minutes pour la stérilisation.
15. Aspirez l’éthanol et remplacez-le par du PBS stérile.
16. Préparer une autre chambre d’humidité comme décrit à l’étape 3.9, avec du PBS au lieu de l’éthanol.
    REMARQUE: En raison de la différence de tension superficielle, il est plus facile d’ajouter d’abord 4-5 mL de PBS pour déposer le parafilm et éliminer les bulles, puis d’aspirer l’excès.
17. Préparer la solution de fibronectine de 50 μg/mL (autres protéines, si désiré) dans du PBS stérile et micropipette de gouttelettes de 50 μL de solution de fibronectine pour chaque quart glissent sur le parafilm, en laissant un peu d’espace entre les gouttelettes.
    REMARQUE: Le revêtement de fibronectine facilite l’adhésion des cellules aux surfaces à motifs.
18. Utilisez une pince à épiler pour placer les glissières face cachée sur les gouttelettes et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les glissières. Poussez doucement les glissières ensemble sans les soulever.
    REMARQUE: Les pinces à glissière en verre ou les pinces à gaufrettes avec des pointes droites et larges sont recommandées pour manipuler les glissières.
19. Laissez la boîte de Petri dans l’armoire de biosécurité pendant 30 min.
20. Après 30 min, placez les lames d’or face vers le haut dans PBS après avoir rincé 3 fois.
    REMARQUE: Les lames à motif de fibronectine peuvent être stockées dans PBS à 4 ° C pendant environ un mois.

4. Ensemencement de cellules sur des lames à micromotifs

1. Réchauffez le milieu de culture cellulaire et la trypsine dans un bain-marie à 37 °C.
   REMARQUE: La description suivante de la sous-culture concerne les cellules NIH / 3T3. Les conditions de culture peuvent varier selon les types de cellules.
2. (Facultatif) Tremper les lames à motifs dans les milieux de culture dans une plaque de 12 puits, réchauffer jusqu’à 37 °C dans un incubateur avant la trypsinisation des cellules pour une meilleure fixation cellulaire.
3. Trypsiniser les cellules, neutraliser avec des milieux contenant du FBS, centrifuger à 100 x g pendant 3 min, puis remettre en suspension en mélangeant bien avec du milieu frais.
   REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont complètement dissociées les unes des autres.
4. Comptez les cellules, diluez à 200 000 cellules/mL et ajoutez 0,5 mL de suspension cellulaire à chaque puits contenant une lame d’or.
5. Secouez doucement la plaque du puits plusieurs fois pour un ensemencement cellulaire uniforme et conservez-la dans un incubateur pendant 15 minutes pour permettre la fixation des cellules.
6. Après 15 minutes, vérifiez la fixation des cellules au microscope. Prévoyez plus de temps, si nécessaire.
   REMARQUE: Les cellules attachées s’étendront sur la surface avec du filopodium visible ou un aplatissement et ne bougeront pas de la surface lorsque la plaque du puits est doucement tapotée ou déplacée.
7. Aspirer les milieux contenant des cellules non attachées de chaque puits et ajouter 1 mL de milieux de culture. Pour le traitement médicamenteux, complétez des réactifs supplémentaires dans les milieux de culture à cette étape.
8. Cultivez les cellules dans l’incubateur pendant 24 h et vérifiez la confluence pour déterminer si la chiralité s’est formée.
   REMARQUE: Une confluence supérieure à 75% est recommandée pour la plupart des types de cellules, et une surconfluence peut affecter la caractérisation de la chiralité.

5. Collection d’images

1. Fixez les cellules en cas de confluence.
   1. Retirer le milieu de culture de la plaque du puits et rincer une fois avec du PBS.
   2. Ajouter la solution de paraformaldéhyde à 4%, incuber à température ambiante pendant 15 min, puis rincer 3 fois avec du PBS.
      REMARQUE: Si la fixation modifie de manière significative la morphologie de la cellule, l’imagerie avant la fixation est recommandée
2. Utilisez un microscope à contraste de phase avec fonctionnalité de caméra, imagez chaque anneau sur les diapositives à haute résolution (un objectif d’objet 10x est suffisant pour l’analyse).

6. Caractérisation de la chiralité cellulaire (Figure 2)

1. Téléchargez les fichiers de code MATLAB pour la caractérisation de la chiralité à partir des fichiers supplémentaires (fichier supplémentaire 1).
   REMARQUE : Le code a été testé pour fonctionner avec MATLAB_R2015b et versions ultérieures sur les systèmes Windows et macOS. La boîte à outils de statistiques circulaires est également nécessaire pour exécuter les fichiers, qui se trouvent dans la référence¹⁷.
2. Ajoutez le dossier de code et les sous-dossiers (avec la boîte à outils de statistiques circulaires à l’intérieur) au chemin MATLAB et ouvrez le fichier « ROI_selection.m ». À la ligne 4, remplacez le répertoire par le dossier de données souhaité (pour les utilisateurs de fenêtres, basculez « / » par « \ » aux lignes 4 et 5).
3. Modifiez la taille de l’image à la ligne 14, les deux premières figures représentant la taille du cercle intérieur de l’anneau tandis que les deux autres représentant l’extérieur.
   REMARQUE : Assurez-vous que les tailles de toutes les images d’un dossier à analyser sont identiques.
4. Cliquez sur le bouton Exécuter pour exécuter le code MATLAB « ROI_selection.m » afin de déterminer la région d’intérêt (ROI) dans les images à contraste de phase.
5. Faites glisser manuellement le carré de sélection pour l’adapter à l’anneau, puis double-cliquez sur l’image pour confirmer la sélection.
6. Répétez cette étape pour chaque image du dossier (l’image suivante apparaîtra automatiquement après avoir confirmé la sélection du retour sur investissement d’une image précédente); un fichier « .mat » sera généré pour stocker les informations de retour sur investissement pour chaque image.
7. Ouvrez le fichier « Analysis_batch.m » et modifiez le répertoire du dossier de la même manière que l’étape 6.2. (Pour les utilisateurs de fenêtres, pour la première utilisation, basculez « / » en « \ » dans les lignes 5, 6, 124 et 130)
8. Cliquez sur le bouton Exécuter pour exécuter le code « Analysis_batch.m » afin de déterminer la chiralité de plusieurs modèles d’anneaux cellulaires. Un fichier « datatoexcel.txt » sera généré, contenant des statistiques circulaires pour chaque anneau ainsi que le nombre d’anneaux dans le sens des aiguilles d’une montre, non chiraux et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.

Résultats

Quinze minutes après l’ensemencement des cellules NIH/3T3, l’adhésion des cellules sur le motif de l’anneau a été confirmée visuellement par imagerie à contraste de phase. Après une culture ultérieure de 24 h, les cellules sur les motifs sont devenues confluentes et allongées avec des alignements clairement asymétriques, biaisés dans le sens des aiguilles d’une montre (Figure 2). La migration directionnelle des cellules attachées est enregistrée par imagerie time-lapse, ...

Discussion

Le test de motif en forme d’anneau décrit ici fournit un outil facile à utiliser pour la caractérisation quantitative de la chiralité multicellulaire, capable de produire des résultats très fiables et reproductibles. La génération rapide de microenvironnements définis identiques et l’analyse impartiale permettent un traitement automatisé à haut débit d’échantillons de grande taille. Ce protocole traite de la fabrication des micromotifs annulaires, de la structure cellulaire et de l’analyse automatiqu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Koptec	DSP-MD-43
BZX microscope system	Keyence	BZX-600
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Electron beam evaporator	Temscal	BJD-1800	Gold-titanum film coating
Fetal bovine serum	VWR	89510-186
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG
Glass microscope slides	VWR	10024-048
Glass tweezers	Exelta	390BSAPI
Gold evaporation pellets	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
OAI contact aligner	OAI	200	UV photolithography
Octadecanethiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Orbital shaker	VWR	89032-088
Phosphate buffered saline (PBS)	Research product international	P32080-100T
Polydimethylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon Wafer	University Wafer	ID#809
Sodium pyruvate	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Titanium evaporation pellets	International Advanced Materials	TI14
Transparency mask (with feature)	Outputicity.com	N/A	Mask printing service
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072