Un test di micropatterning per la misurazione della chiralità cellulare

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per la determinazione della chiralità multicellulare in vitro, utilizzando la tecnica del micropatterning. Questo test consente la quantificazione automatica dei bias sinistra-destra di vari tipi di cellule e può essere utilizzato a scopo di screening.

Abstract

La chiralità è una proprietà cellulare intrinseca, che raffigura l'asimmetria in termini di polarizzazione lungo l'asse sinistro-destro della cellula. Poiché questa proprietà unica attira sempre più attenzione a causa dei suoi ruoli importanti sia nello sviluppo che nella malattia, un metodo di quantificazione standardizzato per caratterizzare la chiralità cellulare farebbe progredire la ricerca e le potenziali applicazioni. In questo protocollo, descriviamo un test di caratterizzazione della chiralità multicellulare che utilizza array di cellule micropatterned. I micropattern cellulari sono fabbricati su vetrini rivestiti in titanio / oro tramite stampa a microcontatto. Dopo la semina sulle isole geometricamente definite (ad esempio, a forma di anello) rivestite di proteine, le cellule migrano direzionalmente e formano un allineamento distorto verso la direzione in senso orario o antiorario, che può essere automaticamente analizzato e quantificato da un programma MATLAB scritto su misura. Qui descriviamo in dettaglio la fabbricazione di substrati micropatterned, la semina cellulare, la raccolta di immagini e l'analisi dei dati e mostriamo risultati rappresentativi ottenuti utilizzando le celle NIH / 3T3. Questo protocollo è stato precedentemente convalidato in diversi studi pubblicati ed è uno strumento efficiente e affidabile per lo studio della chiralità cellulare in vitro.

Introduzione

L'asimmetria sinistra-destra (LR) della cellula, nota anche come manualità cellulare o chiralità, descrive la polarità cellulare nell'asse LR ed è riconosciuta come una proprietà biofisica fondamentale, conservata, 1,2,3,4,5. La chiralità cellulare è stata osservata sia in vivo che in vitro su più scale. Precedenti risultati hanno rivelato il vortice chirale del citoscheletro di actina in singole cellule seminate su isole circolari⁶, la migrazione distorta e l'allineamento delle cellule entro i confini^{confinati 7,8,9,10,11} e il loop asimmetrico del tubo di calore di pollo¹².

A livello multicellulare, la chiralità cellulare può essere determinata dalla migrazione direzionale o dall'allineamento, dalla rotazione cellulare, dalla dinamica citoscheletrica e dal posizionamento degli organelli cellulari 7,8,9,10,11,12,13. Abbiamo stabilito un test¹⁴ basato sulla micropatterning per caratterizzare in modo efficiente il bias chirale delle cellule^aderenti 7,8,9,10. Con i micropattern a forma di anello che confinano geometricamente i cluster cellulari, le cellule mostrano collettivamente una migrazione direzionale e un allineamento distorto. È stato sviluppato un programma MATLAB per rilevare e misurare automaticamente l'allineamento delle celle nelle immagini a contrasto di fase dell'anello. La direzione dell'allineamento cellulare locale è quantificata con un angolo distorto, a seconda della sua deviazione dalla direzione circonferenziale. A seguito di analisi statistica, il modello ad anello delle celle viene designato come bias in senso antiorario (CCW) o bias in senso orario (CW).

Questo test è stato utilizzato per caratterizzare la chiralità di più fenotipi cellulari (Tabella 1) e l'asimmetria LR delle cellule è risultata essere fenotipo-specifica ^7,11,15. Inoltre, l'interruzione della dinamica e della morfologia dell'actina può provocare un'inversione del bias chirale ^7,8 e lo stress ossidativo può alterare anche la chiralità cellulare⁹. A causa della semplicità della procedura e della robustezza dell'approccio 7,8,9,10, questo test di chiralità 2D fornisce uno strumento efficiente e affidabile per determinare e studiare la chiralità multicellulare in vitro.

Lo scopo di questo protocollo è dimostrare l'uso di questo metodo per caratterizzare la chiralità cellulare. Questo protocollo descrive come fabbricare array cellulari modellati tramite la tecnica di stampa a microcontatto e condurre analisi di chiralità in modo automatizzato utilizzando il programma MATLAB.

Protocollo

1. Fabbricazione di francobolli polidimetilsilossano (PDMS)¹⁶

1. Disegna una serie di anelli su microscala utilizzando il software CAD, con un diametro interno di 250 μm e un diametro esterno di 450 μm. Il modello utilizzato in questo protocollo è un array 10 x 10 con una distanza di 850 μm tra gli anelli.
2. Stampare una maschera di trasparenza del modello alla risoluzione desiderata utilizzando il servizio di stampa di maschere di un'azienda di microfabbricazione (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: le dimensioni fornite dell'anello hanno dimostrato di funzionare per molti tipi di celle⁷.
3. Condurre la fotolitografia ultravioletta (UV) utilizzando la maschera contenente le caratteristiche desiderate per creare uno stampo fotoresistente negativo (come SU-8)⁸.
   1. Coprire un wafer di silicio rivestito con photoresist dalla maschera di trasparenza fabbricata nei passaggi 1.1-1.2.
   2. Su un allineatore di contatto UV, polimerizzare il fotoresist sotto le regioni trasparenti della maschera mediante luce UV.
      NOTA: dopo un ulteriore lavaggio e sviluppo, lo stampo principale con le caratteristiche desiderate viene fabbricato⁸. I dettagli operativi dipendono dall'attrezzatura specifica utilizzata.
4. Preparare i prepolimeri elastomerici PDMS mescolando con il suo agente polimerizzante in un rapporto 10: 1 e quindi gettare la miscela sullo stampo in una capsula di Petri.
5. Posizionare la teglia in una camera a vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria in PDMS e cuocere in forno a 60 °C per almeno 2 ore.
6. Dopo la completa polimerizzazione di PDMS, tagliare le matrici di pattern in timbri.
   NOTA: i timbri più spessi (circa 1 cm) possono essere preferiti a causa della facilità di manipolazione nelle fasi successive della stampa a microcontatto.

2. Rivestimento di vetrini

1. Pulire le diapositive di vetro. Immergere i vetrini in un bagno di etanolo al 100%, sonicare per 5 minuti, quindi risciacquare con acqua.
2. Ripeti questo passaggio prima con acetone, poi con isopropanolo, seguito da essiccazione in un flusso di azoto.
3. Utilizzare un'apparecchiatura di evaporazione a fascio di elettroni (E-beam) per rivestire strati di titanio e oro su vetrini.
   NOTA: Per lo strato di titanio, lo spessore desiderato è 15 Å (1 Å = ^10-10 m). Per lo strato d'oro, lo spessore desiderato è 150 Å. Rivestire prima il titanio e poi l'oro, poiché lo strato di titanio funge da adesivo tra l'oro e il vetrino.
4. Posizionare i vetrini puliti nella camera di evaporazione e inserire crogioli d'oro e titanio sotto le persiane.
5. Pompare la camera per creare un vuoto inferiore a ^10-5 Pa prima di fondere i metalli. Focalizzare il fascio di elettroni sul metallo e regolare la potenza in modo che la velocità di deposizione sia appropriata per controllare lo spessore della deposizione.
6. Aprire l'otturatore per avviare la deposizione del metallo. Chiudere l'otturatore quando viene raggiunto lo spessore desiderato.
7. Commutare crogioli tra l'evaporazione sequenziale di due metalli.
8. Attendere che i crogioli si raffreddino come richiesto dall'apparecchiatura, sfiatare la camera e togliere le diapositive di vetro rivestite d'oro.
9. Pompare nuovamente la camera per la manutenzione delle apparecchiature.
   NOTA: i dettagli operativi possono dipendere da uno specifico evaporatore E-beam. Avere un tasso di deposito ben controllato e basso di titanio è importante. Uno spesso strato di titanio spesso porta a scarsa visibilità, specialmente per l'imaging a fluorescenza delle cellule. Dopo il rivestimento, i vetrini rivestiti in titanio/oro possono essere conservati in una camera a vuoto asciutta a temperatura ambiente per almeno 1 mese.

3. Stampa a microcontatto

1. Tagliare la slitta rivestita in titanio / oro in pezzi più piccoli, se lo si desidera. Una forma quadrata di 12 mm x 12 mm è consigliata per un'applicazione tipica (Figura 1B).
2. Utilizzare una fresa per vetri per scorrere sulla superficie per lasciare una traccia ammaccata, quindi tenere la diapositiva di vetro su entrambi i lati e piegare l'ammaccatura per rompersi in piccoli quarti. Evitare di toccare la superficie rivestita d'oro.
   NOTA: per determinare visivamente quale lato del vetro è la superficie rivestita in caso di ribaltamento accidentale, confrontare il riflesso della luce su entrambi i lati. La superficie rivestita in oro mostrerà un riflesso più luminoso, mentre il lato non rivestito avrà un riflesso più debole (dallo strato di titanio sull'altro lato del vetro). Un modo alternativo è osservare i bordi della diapositiva e il lato del rivestimento può essere determinato dalla superficie di taglio verticale.
3. Pulire le diapositive immergendo l'etanolo al 100% in una capsula di Petri con il lato dorato su uno shaker orbitale per almeno 10 minuti. Aspirare l'etanolo, quindi asciugare ogni vetrino soffiando con un flusso di azoto.
4. Pulire i timbri PDMS con acqua saponata e poi etanolo al 100%. Asciugare i timbri con azoto gassoso.
5. Preparare 2 mM di soluzione di ottadecanetiolo (C18) sciogliendo 5,74 mg di polvere di C18 in 10 ml di etanolo al 100%.
   NOTA: Sigillare e conservare la soluzione C18 a temperatura ambiente. I modelli di stampa con C18 creano un monostrato adesivo autoassemblato per il quale la fibronectina e le cellule si attaccheranno preferenzialmente.
6. Immergere i timbri PDMS in soluzione C18 con la superficie modellata rivolta verso il basso per 10 s e asciugare delicatamente con azoto gassoso per 60 s.
   NOTA: durante l'essiccazione, posizionare prima il flusso lontano dal timbro (circa 1 m) fino a quando la maggior parte del liquido non è evaporato e quindi spostare lentamente il flusso più vicino per asciugare completamente il timbro. Questo per evitare che la soluzione di C18 venga spazzata via invece di asciugarsi sul timbro.
7. Posare il timbro a faccia in giù sulle diapositive d'oro per 60 s prima della rimozione.
8. Per garantire una corretta stampaggio, picchiettare delicatamente le pinzette sui timbri per trasferire correttamente i motivi. Non spingere troppo forte e il peso delle pinzette è in genere sufficiente.
   NOTA: l'ispezione visiva del timbro durante la maschiatura assicurerà che il timbro e la slitta di vetro abbiano stabilito un contatto uniforme.
9. Preparare le camere di umidità.
   1. Pipettare 1 mL di etanolo al 70% in un coperchio invertito della capsula di Petri e stendere un pezzo di parafilm per coprire la superficie (coperto a faccia in su).
   2. Utilizzare una pinzetta per sollevare, stendere il parafilm per garantire che non ci siano bolle d'aria e rimuovere l'etanolo in eccesso, se necessario.
10. Preparare la soluzione HS-(CH₂)_{11-EG 3-OH} (EG3) da 2 mM: diluire la soluzione madre da 5 μL in 5 mL di etanolo al 100%.
    NOTA: la soluzione diluita di EG3 può essere sigillata e conservata a 4 °C e lo stock di EG3 non diluito deve essere conservato a -20 °C. Il trattamento EG3 viene utilizzato per rendere la regione del vetro senza C18 non adesiva alle cellule.
11. Micropipette 40 μL goccioline di EG3 per ogni quarto di vetro scivolano sul parafilm nella camera di umidità, lasciando spazio sufficiente tra le goccioline per tenere conto della spaziatura delle diapositive d'oro.
12. Utilizzare una pinzetta per posizionare le diapositive dorate stampate con C18 a faccia in giù sulle goccioline e assicurarsi che non ci siano bolle sotto le diapositive. Spingere delicatamente le diapositive insieme senza sollevarle per ridurre al minimo l'evaporazione.
    NOTA: posizionare un bordo del vetro che scorre verso il basso vicino alla goccia, quindi abbassare lentamente l'altra estremità del vetro scorrere verso il basso. Se è presente una bolla, spingere la slitta d'oro senza sollevarla fino a quando la bolla non è più presente.
13. Sigillare saldamente la capsula di Petri con parafilm e lasciarla a temperatura ambiente per almeno 3 ore.
    NOTA: Se si desidera un'incubazione prolungata, sigillare due volte la capsula di Petri e lasciarla per un massimo di 24 ore.
14. In un armadietto di biosicurezza, posizionare i vetrini d'oro rivolti verso l'alto in una capsula di Petri, immergere e risciacquare 3 volte in etanolo al 70% per rimuovere EG3, quindi lasciare in etanolo per 10 minuti per la sterilizzazione.
15. Aspirare l'etanolo e sostituirlo con PBS sterile.
16. Preparare un'altra camera di umidità come descritto al punto 3.9, con PBS invece di etanolo.
    NOTA: A causa della differenza di tensione superficiale, è più facile aggiungere prima 4-5 ml di PBS per stendere il parafilm e rimuovere le bolle, quindi aspirare l'eccesso.
17. Preparare la soluzione di fibronectina da 50 μg/mL (altre proteine, se lo si desidera) in PBS sterile e micropipette 50 μL di soluzione di fibronectina per ogni quarto scivolare sul parafilm, lasciando un po 'di spazio tra le goccioline.
    NOTA: il rivestimento in fibronectina facilita l'adesione cellulare alle superfici modellate.
18. Utilizzare una pinzetta wafer per posizionare le diapositive a faccia in giù sulle goccioline e assicurarsi che non ci siano bolle sotto le diapositive. Spingere delicatamente le diapositive insieme senza sollevarle.
    NOTA: per la manipolazione delle diapositive sono consigliate pinzette in vetro o pinzette wafer con punte larghe dritte.
19. Lasciare la capsula di Petri nell'armadio di biosicurezza per 30 minuti.
20. Dopo 30 minuti, posizionare i vetrini d'oro rivolti verso l'alto in PBS dopo il risciacquo per 3 volte.
    NOTA: i vetrini con fibronectina possono essere conservati in PBS a 4 °C per circa un mese.

4. Semina delle cellule su vetrini micropatterati

1. Riscaldare il terreno di coltura cellulare e la tripsina a bagnomaria a 37 °C.
   NOTA: La seguente descrizione della sottocultura è per le cellule NIH/3T3. Le condizioni di coltura possono variare a seconda dei tipi di cellule.
2. (Facoltativo) Immergere i vetrini modellati nei terreni di coltura in una piastra a 12 pozzetti, riscaldare fino a 37 ° C in un incubatore prima della tripsinizzazione delle cellule per un migliore attaccamento cellulare.
3. Tripsinizzare le cellule, neutralizzare con mezzi contenenti FBS, centrifugare a 100 x g per 3 minuti, quindi risospesciare mescolando bene con mezzi freschi.
   NOTA: assicurarsi che le celle siano completamente dissociate l'una dall'altra.
4. Contare le cellule, diluire a 200.000 cellule / mL e aggiungere 0,5 mL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto contenente un vetrino d'oro.
5. Agitare delicatamente la piastra del pozzo un paio di volte per una semina cellulare uniforme e conservarla in un'incubatrice per 15 minuti per consentire l'attaccamento cellulare.
6. Dopo 15 minuti, controllare l'attacco cellulare al microscopio. Concedi più tempo, se necessario.
   NOTA: le celle attaccate si diffondono sulla superficie con filopodio visibile o appiattimento e non si spostano dalla superficie quando la piastra del pozzo viene delicatamente toccata o spostata.
7. Aspirare il supporto contenente cellule non attaccate da ciascun pozzetto e aggiungere 1 mL di terreno di coltura. Per il trattamento farmacologico, integrare reagenti aggiuntivi ai terreni di coltura in questa fase.
8. Coltiva le cellule nell'incubatore per 24 ore e controlla la confluenza per determinare se si è formata la chiralità.
   NOTA: la confluenza superiore al 75% è raccomandata per la maggior parte dei tipi di cellule e l'eccessiva confluenza può influenzare la caratterizzazione della chiralità.

5. Raccolta di immagini

1. Fissare le celle alla confluenza.
   1. Rimuovere i terreni di coltura dalla piastra del pozzo e risciacquare una volta con PBS.
   2. Aggiungere la soluzione di paraformaldeide al 4%, incubare a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi risciacquare 3 volte con PBS.
      NOTA: se la fissazione modifica significativamente la morfologia cellulare, si consiglia l'imaging prima della fissazione
2. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase con funzionalità di fotocamera, visualizzare ogni anello sui vetrini ad alta risoluzione (l'obiettivo dell'oggetto 10x è sufficiente per l'analisi).

6. Caratterizzazione della chiralità cellulare (Figura 2)

1. Scarica i file di codice MATLAB per la caratterizzazione della chiralità dai file supplementari (File supplementare 1).
   NOTA: il codice è stato testato per funzionare con MATLAB_R2015b e versioni successive su sistemi Windows e macOS. La casella degli strumenti delle statistiche circolari è necessaria anche per eseguire i file, che possono essere trovati nel riferimento¹⁷.
2. Aggiungi la cartella del codice e le sottocartelle (con la casella degli strumenti delle statistiche circolari all'interno) al percorso MATLAB e apri il file "ROI_selection.m". Nella riga 4, modificare la directory nella cartella dati desiderata (per gli utenti di finestre, passare da "/" a "\" nelle righe 4 e 5).
3. Modificare le dimensioni dell'immagine nella riga 14, con le prime due figure che rappresentano la dimensione del cerchio interno dell'anello mentre le altre due rappresentano l'esterno.
   NOTA: assicurarsi che le dimensioni di tutte le immagini in una cartella da analizzare siano identiche.
4. Fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il codice MATLAB "ROI_selection.m" per determinare la regione di interesse (ROI) nelle immagini a contrasto di fase.
5. Trascina manualmente il quadrato di selezione per adattarlo all'anello, quindi fai doppio clic sull'immagine per confermare la selezione.
6. Ripeti questo passaggio per ogni immagine nella cartella (l'immagine successiva apparirà automaticamente dopo aver confermato la selezione del ROI di un'immagine precedente); verrà generato un file ".mat" per memorizzare le informazioni sul ROI per ogni immagine.
7. Aprire il file "Analysis_batch.m" e modificare la directory della cartella come il passaggio 6.2. (Per gli utenti di finestre, per il primo utilizzo, passare da "/" a "\" nelle righe 5, 6, 124 e 130)
8. Fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il codice "Analysis_batch.m" per determinare la chiralità di più modelli di anelli cellulari. Verrà generato un file "datatoexcel.txt", contenente statistiche circolari per ciascun anello e il numero di anelli in senso orario, non chirale e antiorario.

Risultati

Quindici minuti dopo la semina delle cellule NIH/3T3, l'adesione cellulare sul modello ad anello è stata confermata visivamente dall'imaging a contrasto di fase. Dopo la successiva coltura di 24 ore, le cellule sui modelli sono diventate confluenti e allungate con allineamenti chiaramente asimmetrici, sbilanciati verso la direzione in senso orario (Figura 2). La migrazione direzionale delle cellule attaccate viene registrata mediante imaging time-lapse, la motilità cellulare e la morfogene...

Discussione

Il test di patterning a forma di anello qui descritto fornisce uno strumento di facile utilizzo per la caratterizzazione quantitativa della chiralità multicellulare, in grado di produrre risultati altamente affidabili e ripetibili. La rapida generazione di microambienti identici definiti e l'analisi imparziale consentono l'elaborazione automatizzata ad alta produttività di campioni di grandi dimensioni. Questo protocollo discute la fabbricazione dei micropattern ad anello, il pattern cellulare e l'analisi automatica de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Koptec	DSP-MD-43
BZX microscope system	Keyence	BZX-600
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Electron beam evaporator	Temscal	BJD-1800	Gold-titanum film coating
Fetal bovine serum	VWR	89510-186
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG
Glass microscope slides	VWR	10024-048
Glass tweezers	Exelta	390BSAPI
Gold evaporation pellets	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
OAI contact aligner	OAI	200	UV photolithography
Octadecanethiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Orbital shaker	VWR	89032-088
Phosphate buffered saline (PBS)	Research product international	P32080-100T
Polydimethylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon Wafer	University Wafer	ID#809
Sodium pyruvate	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Titanium evaporation pellets	International Advanced Materials	TI14
Transparency mask (with feature)	Outputicity.com	N/A	Mask printing service
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072