세포 키랄성 측정을 위한 마이크로패터닝 분석

요약

우리는 마이크로패터닝 기술을 사용하여 시험관 내에서 다세포 키랄성을 결정하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 분석은 다양한 유형의 세포의 좌-우 편향의 자동 정량화를 허용하고 스크리닝 목적으로 사용될 수 있다.

초록

키랄성은 세포의 왼쪽 - 오른쪽 축을 따라 편광의 관점에서 비대칭을 묘사하는 고유 한 세포 특성입니다. 이 독특한 특성이 발달과 질병 모두에서 중요한 역할을하기 때문에 주목을 끌기 때문에 세포 키랄성을 특성화하기위한 표준화 된 정량화 방법은 연구 및 잠재적 인 응용을 앞당길 것입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 세포의 마이크로패턴화된 어레이를 이용하는 다세포 키랄성 특성화 검정을 기술한다. 세포 마이크로 패턴은 마이크로 접촉 인쇄를 통해 티타늄 / 금 코팅 유리 슬라이드에 제작됩니다. 기하학적으로 정의된(예를 들어, 고리 모양의) 단백질 코팅된 섬들 상에 시딩한 후, 세포는 방향적으로 이동하고, 시계 방향 또는 반시계 방향 방향 중 하나를 향해 편향된 정렬을 형성하며, 이는 사용자 정의 작성된 MATLAB 프로그램에 의해 자동으로 분석 및 정량화될 수 있다. 여기서는 마이크로 패턴화 된 기질의 제작, 세포 시딩, 이미지 수집 및 데이터 분석을 자세히 설명하고 NIH / 3T3 세포를 사용하여 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 이전에 여러 발표 된 연구에서 검증되었으며 시험관 내에서 세포 키랄성을 연구하기위한 효율적이고 신뢰할 수있는 도구입니다.

서문

세포의 좌우(LR) 비대칭성(세포 손 또는 키랄성이라고도 함)은 LR 축의 세포 극성을 기술하며 근본적이고 보존된 생물물리학적 특성 1,2,3,4,5로 인식된다. 세포 키랄성은 다수의 스케일에서 생체내 및 시험관내 둘 다에서 관찰되었다. 이전의 발견은 원형 섬⁶에 시달린 단일 세포에서 액틴 세포 골격의 키랄 소용돌이, 제한된 경계 7,8,9,10,11 내의 세포의 편향된 이동 및 정렬^, 닭 히트 튜브 ¹²의 비대칭 루핑을 밝혀냈다.

다세포 수준에서, 세포 키랄성은 방향성 이동 또는 정렬, 세포 회전, 세포골격 역학, 및 세포 소기관 위치^{7,8,9,10,11,12,13}으로부터 결정될 수 있다. 우리는 부착성 세포 7,8,9,10의 키랄 편향을 효율적으로 특성화하기 위해 마이크로 패 터닝 기반 ¹⁴ 검정을 확립했습니다. 기하학적으로 제한된 세포 군집을 갖는 고리 모양의 마이크로패턴으로, 세포는 집합적으로 방향성 이동 및 편향된 정렬을 나타낸다. MATLAB 프로그램은 링의 위상차 이미지에서 세포 정렬을 자동으로 감지하고 측정하기 위해 개발되었습니다. 국소 세포 정렬의 방향은 원주 방향으로부터의 편차에 따라 편향된 각도로 정량화된다. 통계적 분석에 따라, 세포의 고리 패턴은 시계 반대 방향(CCW) 바이어스 또는 시계 방향(CW) 바이어스로 지정된다.

이 분석은 다중 세포 표현형의 키랄성을 특성화하기 위해 사용되었으며(표 1), 세포의 LR 비대칭성은 표현형-특이적 ^7,11,15인 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 액틴 역학 및 형태학에 대한 붕괴는 키랄 편향^7,8의 역전을 초래할 수 있고^, 산화 스트레스는 세포 키랄성도 변화시킬 수 있다⁹. 절차 의 단순성과 접근법 7,8,9,10의 견고성 때문에^, 이 2D 키랄성 분석은 시험관 내에서 다세포 키랄성을 결정하고 연구하기 위한 효율적이고 신뢰할 수 있는 도구를 제공한다.

이 프로토콜의 목적은 세포 키랄성을 특성화하기 위해 이 방법의 사용을 입증하는 것이다. 이 프로토콜은 마이크로 접촉 인쇄 기술을 통해 패턴화된 세포 어레이를 제작하고 MATLAB 프로그램을 사용하여 자동화된 방식으로 키랄성 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 폴리디메틸실록산(PDMS) 우표 제작¹⁶

1. CAD 소프트웨어를 사용하여 내경이 250μm이고 외경이 450μm인 마이크로스케일 링 어레이를 그립니다. 이 프로토콜에 사용되는 패턴은 고리 사이의 거리가 850μm인 10 x 10 어레이입니다.
2. 미세 제조 회사의 마스크 인쇄 서비스를 사용하여 패턴의 투명도 마스크를 원하는 해상도로 인쇄 하십시오 (자료 표 참조).
   참고: 제공된 링의 치수는 많은 셀 유형⁷에서 작동하는 것으로 입증되었습니다.
3. 원하는 특징이 포함된 마스크를 사용하여 자외선(UV) 포토리소그래피를 실시하여 네거티브 포토레지스트 몰드(예: SU-8)⁸을 제작합니다.
   1. 1.1-1.2단계에서 제작된 투명성 마스크에 의해 포토레지스트로 스핀 코팅된 실리콘 웨이퍼를 덮는다.
   2. UV 접촉 얼라이너에서 마스크의 투명한 영역 아래에서 자외선에 의해 포토레지스트를 중합하십시오.
      참고 : 추가 세척 및 개발 후, 원하는 기능을 갖춘 마스터 몰드가 제작됩니다⁸. 작동 세부 정보는 사용되는 특정 장비에 따라 다릅니다.
4. 경화제와 10:1 비율로 혼합하여 PDMS 엘라스토머성 예비중합체를 제조한 다음, 혼합물을 페트리 접시의 몰드 상에 캐스팅한다.
5. 접시를 진공 챔버에 30분 동안 두어 PDMS에서 기포를 제거하고 60°C의 오븐에서 적어도 2시간 동안 베이킹한다.
6. PDMS의 완전한 경화 후, 패턴 어레이를 스탬프로 자른다.
   참고: 더 두꺼운 스탬프(약 1cm)는 미세 접촉 인쇄의 이후 단계에서 취급이 용이하기 때문에 선호될 수 있습니다.

2. 유리 슬라이드의 코팅

1. 유리 슬라이드를 청소하십시오. 슬라이드를 100 % 에탄올 욕조에 담그고 5 분 동안 초음파 처리 한 다음 물로 헹구십시오.
2. 이 단계를 먼저 아세톤으로 반복 한 다음 이소프로판올로 한 다음 질소 기류에서 건조시킵니다.
3. 전자 빔 (E-beam) 증발 장비를 사용하여 유리 슬라이드에 티타늄과 금층을 코팅하십시오.
   참고: 티타늄 층의 경우 원하는 두께는 15 Å (1 Å = ^10-10 m)입니다. 금층의 경우, 원하는 두께는 150 Å이다. 티타늄 층이 금과 유리 슬라이드 사이의 접착제 역할을하기 때문에 티타늄을 먼저 코트 한 다음 금을 코팅하십시오.
4. 청소한 슬라이드를 증발 챔버에 넣고 셔터 아래에 금과 티타늄 도가니를 삽입합니다.
5. 챔버를 펌핑하여 금속을 녹이기 전에 ^10-5 Pa보다 낮은 진공을 만듭니다. 전자빔을 금속에 초점을 맞추고 증착 속도가 증착 두께를 제어하는 데 적합하도록 전력을 조정하십시오.
6. 셔터를 열어 금속 증착을 시작합니다. 원하는 두께에 도달하면 셔터를 닫습니다.
7. 두 금속의 순차적 증발 사이에 도가니를 전환하십시오.
8. 장비에서 필요에 따라 도가니가 식을 때까지 기다렸다가 챔버를 환기시키고 금으로 코팅 된 유리 슬라이드를 꺼냅니다.
9. 장비 유지 보수를 위해 챔버를 다시 펌핑하십시오.
   참고: 작동 세부 정보는 특정 E-빔 증발기에 따라 달라질 수 있습니다. 티타늄의 잘 제어되고 낮은 증착율을 갖는 것이 중요합니다. 두꺼운 티타늄 층은 종종 특히 세포의 형광 이미징을 위해 시력이 떨어집니다. 코팅 후, 티타늄 / 금 코팅 유리 슬라이드는 적어도 1 개월 동안 실온에서 건조한 진공 챔버에 보관할 수 있습니다.

3. 마이크로 접점 인쇄

1. 원하는 경우 티타늄 / 금 코팅 슬라이드를 더 작은 조각으로 자릅니다. 일반적인 응용 분야에서는 12mm x 12mm의 정사각형 모양을 사용하는 것이 좋습니다(그림 1B).
2. 유리 커터를 사용하여 표면을 가로 질러 미끄러 져 움푹 들어간 트랙을 남긴 다음 유리 슬라이드를 양쪽으로 잡고 움푹 들어간 곳을 구부려 작은 분기로 나눕니다. 금으로 코팅 된 표면을 만지지 마십시오.
   참고: 실수로 기울어지는 경우 유리의 어느 쪽이 코팅된 표면인지 시각적으로 확인하려면 양쪽의 빛의 반사를 비교하십시오. 금으로 덮인 표면은 더 밝은 반사를 나타내는 반면, 코팅되지 않은 쪽은 (유리의 다른면에있는 티타늄 층에서) 더 희미한 반사를 갖습니다. 다른 방법은 슬라이드의 가장자리를 관찰하는 것이고, 코팅 측면은 수직 절단 표면으로부터 결정될 수 있다.
3. 페트리 접시에 100% 에탄올을 담가 슬라이드를 닦아내고, 금면을 오비탈 쉐이커에 올려 놓고 최소 10분 동안 닦으십시오. 에탄올을 흡인하고, 질소 기류로 송풍하여 각 슬라이드를 건조시킨다.
4. PDMS 스탬프를 비눗물로 닦은 다음 100 % 에탄올로 청소하십시오. 스탬프를 질소 가스로 건조시킵니다.
5. 5.74 mg의 C18 분말을 100% 에탄올 10 mL에 용해시켜 2 mM 옥타데칸티올(C18) 용액을 제조하였다.
   참고: C18 용액을 실온에서 밀봉하고 보관하십시오. C18로 패턴을 인쇄하면 피브로넥틴과 세포가 우선적으로 부착되는 접착제 자체 조립 단분자층이 만들어집니다.
6. 패터닝된 표면을 아래로 향하게 하여 C18 용액에 PDMS 스탬프를 담그고 60초 동안 질소 가스로 부드럽게 건조시킵니다.
   참고: 건조할 때, 대부분의 액체가 증발될 때까지 먼저 스탬퍼에서 스트림을 멀리 떨어뜨린 다음(약 1m) 천천히 스트림을 더 가깝게 움직여 스탬프를 완전히 건조시킵니다. 이것은 C18 용액이 스탬프에서 건조되는 대신 날아 가지 않도록하기위한 것입니다.
7. 스탬프를 금색 슬라이드에 60초 동안 아래로 향하게 한 후 제거하십시오.
8. 적절한 스탬핑을 보장하려면 핀셋을 스탬프에 부드럽게 탭하여 패턴을 적절하게 전송하십시오. 너무 세게 밀지 말고 핀셋의 무게는 일반적으로 충분합니다.
   참고: 두드리는 동안 스탬프를 육안으로 검사하면 스탬프와 유리 슬라이드가 균일하게 접촉했는지 확인할 수 있습니다.
9. 습도 챔버를 준비하십시오.
   1. 70% 에탄올 1 mL를 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 넣고 파라필름 조각을 내려놓고 표면을 덮는다(얼굴을 위로 덮었다).
   2. 핀셋을 사용하여 들어 올리고, 기포가 없도록 파라 필름을 깔고, 필요한 경우 과도한 에탄올을 제거하십시오.
10. 2 mM HS-(_CH2)11-EG3-OH (_EG3) 용액을 준비하십시오: 5 μL 원액을 ₁₀₀% 에탄올 5 mL에 희석하십시오.
    참고: 희석된 EG3 용액은 밀봉되어 4°C에서 저장될 수 있으며, 희석되지 않은 EG3 스톡은 -20°C에서 보관되어야 한다. EG3 처리는 C18이 세포에 비접착되지 않고 유리 영역을 만드는 데 사용됩니다.
11. 각 쿼터 글라스에 대한 EG3의 마이크로피펫 40 μL 액적이 습도 챔버의 파라필름 상으로 미끄러지면서, 액적 사이에 금 슬라이드의 간격을 설명하기에 충분한 공간을 남긴다.
12. 핀셋을 사용하여 C18 인쇄 골드 슬라이드를 물방울 위에 아래로 향하게 놓고 슬라이드 아래에 거품이 없도록 합니다. 슬라이드를 들어 올리지 않고 부드럽게 밀어 증발을 최소화하십시오.
    참고: 유리 슬라이드의 한쪽 가장자리를 물방울 근처에 놓은 다음 유리 슬라이드의 다른 쪽 끝을 천천히 아래로 내립니다. 거품이 있으면 거품이 더 이상 존재하지 않을 때까지 들어 올리지 않고 금 슬라이드를 밀어 넣습니다.
13. 페트리 접시를 파라 필름으로 단단히 밀봉하고 적어도 3 시간 동안 실온에서 두십시오.
    참고 : 광범위한 배양이 필요한 경우 Petri 접시를 두 번 밀봉하고 최대 24 시간 동안 그대로 두십시오.
14. 생물 안전 캐비닛에서 금 슬라이드를 페트리 접시에 올려 놓고 70 % 에탄올에 3 번 담그고 헹구어 EG3를 제거한 다음 에탄올에 10 분 동안 방치하여 살균하십시오.
15. 에탄올을 흡인하고 멸균 PBS로 교체하십시오.
16. 단계 3.9에 기재된 바와 같이, 에탄올 대신에 PBS로 또 다른 습도 챔버를 준비한다.
    참고 : 표면 장력의 차이로 인해 먼저 PBS 4-5 mL를 추가하여 파라 필름을 깔고 거품을 제거한 다음 과잉을 흡인하는 것이 더 쉽습니다.
17. 멸균 PBS에 50 μg/mL 피브로넥틴 용액(원하는 경우 다른 단백질)을 준비하고, 각 분기 슬라이드마다 피브로넥틴 용액의 마이크로피펫 50μL 액적을 파라필름 상에 준비하여 액적 사이에 약간의 공간을 남겨 둡니다.
    참고: 피브로넥틴 코팅은 패턴화된 표면에 대한 세포 부착을 용이하게 합니다.
18. 웨이퍼 핀셋을 사용하여 슬라이드를 물방울 위에 아래로 향하게 놓고 슬라이드 아래에 거품이 없는지 확인합니다. 슬라이드를 들어 올리지 않고 부드럽게 밀어 넣습니다.
    참고: 유리 슬라이드 핀셋 또는 직선 와이드 팁이 있는 웨이퍼 핀셋은 슬라이드를 취급하는 데 권장됩니다.
19. 페트리 접시를 생물 안전 캐비닛에 30 분 동안 두십시오.
20. 30분 후, 금 슬라이드를 PBS에 올려 놓고 3회 헹구었다.
    참고: 피브로넥틴 패턴화된 슬라이드는 약 한 달 동안 4°C에서 PBS에 저장할 수 있습니다.

4. 마이크로 패턴 슬라이드에 세포 시드

1. 세포 배양 배지 및 트립신을 37°C 수조에서 예열한다.
   참고: 계대 배양에 대한 다음 설명은 NIH/3T3 세포에 대한 것이다. 배양 조건은 세포 유형에 따라 달라질 수 있다.
2. (선택 사항) 패터닝된 슬라이드를 12-웰 플레이트의 배양 배지에 담그고, 더 나은 세포 부착을 위해 세포의 트립신화 전에 인큐베이터에서 37°C까지 예열한다.
3. 세포를 트립신화하고, FBS 함유 배지로 중화시키고, 100 x g 에서 3분 동안 원심분리한 다음, 신선한 배지와 잘 혼합하여 재현탁시킨다.
   참고: 세포가 서로 완전히 분리되어 있는지 확인하십시오.
4. 세포를 계수하고 200,000 cells/mL로 희석한 다음 금 슬라이드 하나가 들어있는 각 웰에 0.5mL의 세포 현탁액을 첨가합니다.
5. 균일한 세포 파종을 위해 웰 플레이트를 몇 번 부드럽게 흔들어 15 분 동안 인큐베이터에 보관하여 세포 부착을 허용하십시오.
6. 15 분 후, 현미경으로 세포 부착을 확인하십시오. 필요한 경우 추가 시간을 허용하십시오.
   참고 : 부착 된 세포는 눈에 보이는 필로 포디움 또는 평평 화로 표면에 퍼져 나가며 우물 플레이트를 부드럽게 두드리거나 움직일 때 표면에서 움직이지 않습니다.
7. 부착되지 않은 세포를 포함하는 배지를 각 웰에서 흡인하고 배양 배지 1 mL를 첨가한다. 약물 치료를 위해, 이 단계에서 배양 배지에 추가 시약을 보충하십시오.
8. 세포를 24시간 동안 배양기에서 배양하고 컨플루언시를 확인하여 키랄성이 형성되었는지 여부를 결정한다.
   참고: 대부분의 세포 유형에서 75% 이상의 컨플루언시가 권장되며, 과도한 컨플루언시는 키랄성 특성화에 영향을 미칠 수 있습니다.

5. 이미지 수집

1. 합류시 셀을 수정하십시오.
   1. 배양 배지를 웰 플레이트에서 제거하고 PBS로 한 번 헹구십시오.
   2. 4% 파라포름알데히드 용액을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 헹구었다.
      참고 : 고정이 세포 형태를 크게 변화시키는 경우 고정 전에 이미징하는 것이 좋습니다.
2. 카메라 기능이있는 위상차 현미경을 사용하여 슬라이드의 각 링을 고해상도로 이미지화하십시오 (10x 오브젝트 렌즈는 분석에 충분합니다).

6. 세포 키랄성 특성화(그림 2)

1. 보충 파일에서 키랄성 특성화를 위한 MATLAB 코드 파일을 다운로드합니다(보충 파일 1).
   참고: 이 코드는 Windows 및 macOS 시스템 모두에서 MATLAB_R2015b 이상 버전에서 작동하도록 테스트되었습니다. 순환 통계 도구 상자는 참조¹⁷에서 찾을 수 있는 파일을 실행하는 데도 필요합니다.
2. 코드 폴더와 하위 폴더(내부에 원형 통계 도구 상자 포함)를 MATLAB 경로에 추가하고 "ROI_selection.m" 파일을 엽니다. 4 행에서 디렉토리를 원하는 데이터 폴더로 변경하십시오 (창 사용자의 경우 4 행과 5 행에서 "/"를 "\"로 전환하십시오).
3. 14선에서 이미지 크기를 변경하고, 처음 두 그림은 링의 내부 원 크기를 나타내고 다른 두 그림은 바깥쪽을 나타냅니다.
   참고: 분석할 폴더에 있는 모든 이미지의 크기가 동일한지 확인하십시오.
4. 실행 버튼을 클릭하여 MATLAB 코드 "ROI_selection.m"을 실행하여 위상차 이미지에서 관심 영역(ROI)을 결정합니다.
5. 수동으로 선택 사각형을 드래그하여 링에 맞게 한 다음 이미지를 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다.
6. 폴더의 모든 이미지에 대해이 단계를 반복하십시오 (이전 이미지의 ROI 선택을 확인한 후 다음 이미지가 자동으로 팝업됩니다). 각 이미지에 대한 ROI 정보를 저장하기 위해 ".mat" 파일이 생성됩니다.
7. "Analysis_batch.m" 파일을 열고 6.2단계와 동일한 폴더의 디렉토리를 변경합니다. (창 사용자의 경우 처음 사용하려면 5, 6, 124 및 130 행에서 "/"를 "\"로 전환하십시오.)
8. 실행 버튼을 클릭하여 코드 "Analysis_batch.m"을 실행하여 여러 세포 링 패턴의 키랄성을 결정합니다. "datatoexcel.txt" 파일이 생성되며, 여기에는 각 링에 대한 순환 통계와 시계 방향, 키랄이 아닌 및 시계 반대 방향 링의 수가 포함됩니다.

결과

NIH/3T3 세포의 시딩 15분 후, 고리 패턴에 대한 세포 부착은 위상차 영상화에 의해 육안으로 확인되었다. 24시간의 후속 배양 후에, 패턴 상의 세포들은 뚜렷하게 비대칭적인 정렬로 합류하고 길쭉해졌고, 시계 방향으로 편향되었다(그림 2). 부착된 세포의 방향성 이동은 타임랩스 영상화에 의해 기록되고, 세포 운동성 및 형태형성은 비디오의 추가 분석으로 정량화될 수 있다. ...

토론

여기에 설명된 고리형 패터닝 분석은 매우 안정적이고 반복 가능한 결과를 생성할 수 있는 다세포 키랄성의 정량적 특성화를 위한 사용하기 쉬운 도구를 제공합니다. 동일한 정의된 미세 환경의 신속한 생성과 편향되지 않은 분석을 통해 대용량 샘플의 자동화된 고처리량 처리가 가능합니다. 이 프로토콜은 링 마이크로패턴의 제작, 셀 패터닝 및 편향된 셀 정렬 및 방향 운동의 자동 분석에 대해 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Koptec	DSP-MD-43
BZX microscope system	Keyence	BZX-600
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Electron beam evaporator	Temscal	BJD-1800	Gold-titanum film coating
Fetal bovine serum	VWR	89510-186
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG
Glass microscope slides	VWR	10024-048
Glass tweezers	Exelta	390BSAPI
Gold evaporation pellets	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
OAI contact aligner	OAI	200	UV photolithography
Octadecanethiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Orbital shaker	VWR	89032-088
Phosphate buffered saline (PBS)	Research product international	P32080-100T
Polydimethylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon Wafer	University Wafer	ID#809
Sodium pyruvate	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Titanium evaporation pellets	International Advanced Materials	TI14
Transparency mask (with feature)	Outputicity.com	N/A	Mask printing service
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072