一种用于测量细胞手性的微图案化检测

摘要

我们提出了一种使用微图案化技术 在体外测定多细胞手性的方案。该测定允许自动定量各种类型细胞的左右偏倚，并可用于筛选目的。

摘要

手性是一种固有的细胞特性，它描绘了沿着细胞左右轴极化的不对称性。由于这种独特的性质由于其在发育和疾病中的重要作用而受到越来越多的关注，因此用于表征细胞手性的标准化定量方法将推进研究和潜在应用。在该协议中，我们描述了一种利用微图案化细胞阵列的多细胞手性表征测定。蜂窝微图案通过微接触印刷在钛/镀金的载玻片上制造。在几何定义的（例如，环形的），蛋白质包被的岛屿上接种后，细胞定向迁移并形成朝时针或逆时针方向的偏倚对齐，这可以通过定制编写的MATLAB程序自动分析和量化。在这里，我们详细描述了微图案底物的制造，细胞接种，图像收集和数据分析，并显示了使用NIH / 3T3细胞获得的代表性结果。该方案先前已在多个已发表的研究中得到验证，是 体外研究细胞手性的高效可靠工具。

引言

细胞的左右（LR）不对称性，也称为细胞手性或手性，描述了LR轴上的细胞极性，并且被认为是基本的，保守的生物物理性质^{1，2，3，4，5}。在体内和体外以多种尺度观察到细胞手性。先前的研究结果揭示了接种在圆形岛屿⁶上的单细胞中肌动蛋白细胞骨架的手性旋转，在受限边界^7，8，^9，10，11内细胞的偏向迁移和^{排列，以及}鸡热管¹²的不对称循环。

在多细胞水平上，细胞手性可以通过定向迁移或排列，细胞旋转，细胞骨架动力学和细胞器定位^7，8，⁹，^10，11^，12，13来确定。我们已经建立了一种基于微图案化的¹⁴测定法，以有效地表征贴壁细胞^7，8，^9，10的手性偏倚。随着环形微图案几何地限制细胞簇，细胞集体表现出定向迁移和偏置对齐。开发了一个MATLAB程序，以自动检测和测量环的相差图像中的细胞对齐。局部像元对齐的方向用偏置角度进行量化，这取决于它与圆周方向的偏差。在统计分析之后，细胞的环模式被指定为逆时针（CCW）偏差或顺时针（CW）偏差。

该测定已被用于表征多种细胞表型的手性（表1），并且已发现细胞的LR不对称性具有表型特异性^7，11，15。此外，对肌动蛋白动力学和形态的破坏可导致手性偏倚^7，8的逆转，氧化应激也可以改变细胞手性⁹。由于程序的简单性和方法^7，8，^9，10的鲁棒性，该2D手性测定为在体外测定和研究多细胞手性提供了有效可靠的工具。

该协议的目的是演示使用这种方法来表征细胞手性。该协议描述了如何通过微接触打印技术制造图案化蜂窝阵列，并使用MATLAB程序以自动方式进行手性分析。

研究方案

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）邮票的制作¹⁶

1. 使用CAD软件绘制一系列微尺度环，内径为250μm，外径为450μm。该协议中使用的模式是10 x 10阵列，环之间的距离为850μm。
2. 使用微细加工公司的掩模打印服务以所需分辨率打印图案的透明掩模（请参见 材料表）。
   注意:所提供的环尺寸已被证明适用于许多⁷型细胞。
3. 使用含有所需特征的掩模进行紫外（UV）光刻，以制作负性光刻胶模具（如SU-8）⁸。
   1. 覆盖由步骤1.1-1.2中制造的透明掩模旋转涂覆光刻胶的硅晶圆。
   2. 在UV接触矫正器上，通过UV光将光刻胶在掩模的透明区域下聚合。
      注:经过进一步的清洗和开发，制造出具有所需特征的主模⁸。操作细节取决于所使用的特定设备。
4. 通过以10:1的比例与其固化剂混合来制备PDMS弹性预聚物，然后将混合物浇注到培养皿中的模具上。
5. 将培养皿置于真空室中30分钟以除去PDMS中的气泡，并在60°C的烤箱中烘烤至少2小时。
6. PDMS完全固化后，将图案阵列切割成图章。
   注意:较厚的印章（约1厘米）可能是首选，因为在微接触印刷的后期步骤中易于处理。

2. 载玻片的镀膜

1. 清洁载玻片。将载玻片浸泡在100%乙醇浴中，超声处理5分钟，然后用水冲洗。
2. 首先用丙酮重复此步骤，然后用异丙醇，然后在氮气流中干燥。
3. 使用电子束（E-beam）蒸发设备在载玻片上涂覆钛和金层。
   注意:对于钛层，所需厚度为15 Å（1 Å = ^10-10 m）。对于金层，所需的厚度为150 Å。首先涂覆钛，然后涂覆金，因为钛层充当金和载玻片之间的粘合剂。
4. 将清洁后的载玻片放入蒸发室，并在百叶窗下插入金和钛坩埚。
5. 在熔化金属之前，泵送腔室以产生低于^10-5 Pa的真空。将电子束聚焦到金属上并调整功率，使沉积速率适合于控制沉积厚度。
6. 打开快门开始金属沉积。当达到所需厚度时，关闭快门。
7. 在两种金属的顺序蒸发之间切换坩埚。
8. 等待坩埚按照设备要求冷却，将腔室通风，然后将镀金玻璃滑出。
9. 再次抽下腔室以进行设备维护。
   注:操作细节可能取决于特定的电子束蒸发器。具有良好控制的低钛沉积速率非常重要。厚的钛层通常会导致能见度差，特别是对于细胞的荧光成像。镀膜后，钛/镀金的载玻片可以在室温下在干燥真空室中储存至少1个月。

3. 微接触印刷

1. 如果需要，将钛/镀金的载玻片切成更小的碎片。对于典型应用，建议使用 12 mm x 12 mm 的正方形（图 1B）。
2. 使用玻璃切割机在表面上滑动以留下凹陷的轨迹，然后在两侧握住载玻片并在凹痕处弯曲以分成小区域。避免接触涂有金的表面。
   注:为了在意外翻倒的情况下直观地确定玻璃的哪一侧是镀膜表面，请比较两侧的光反射。覆盖金的表面将显示更亮的反射，而未镀膜的一面将具有较暗的反射（来自玻璃另一侧的钛层）。另一种方法是观察滑块的边缘，并且可以从垂直切割表面确定涂层侧。
3. 通过在培养皿中浸泡100%乙醇来清洁载玻片，并将金面朝上放在轨道振荡器上至少10分钟。吸出乙醇，然后用氮气流吹干每张载玻片。
4. 用肥皂水清洁PDMS印章，然后用100%乙醇清洁。用氮气擦干印章。
5. 通过将5.74mg C18粉末溶解在10mL 100%乙醇中来制备2mM十八烷硫醇（C18）溶液。
   注意:密封并将C18溶液储存在室温下。用C18打印图案形成粘合剂自组装的单层，纤连蛋白和细胞将优先附着。
6. 将 PDMS 印章浸泡在 C18 溶液中，图案化表面朝下 10 秒，并用氮气轻轻干燥 60 秒。
   注意:干燥时，首先将流远离印章（约1米），直到大部分液体蒸发，然后缓慢地将流移近以完全干燥印章。这是为了避免C18溶液被吹走，而不是在印章上干燥。
7. 将印章正面朝下放在金质载玻片上60秒，然后取下。
8. 为确保正确冲压，请轻轻地将镊子轻拍到印章上，以正确转移图案。不要用力向下推，镊子的重量通常就足够了。
   注:在攻丝过程中对印章进行目视检查将确保印章和载玻片均匀接触。
9. 准备湿度室。
   1. 将1mL 70%乙醇移液到倒置的培养皿盖中，并放下一块parafilm以覆盖表面（面朝上覆盖）。
   2. 使用镊子抬起，放下石蜡膜以确保没有气泡，并在需要时去除多余的乙醇。
10. 制备2mM HS-（CH₂）_{11-EG 3-OH}（EG3）溶液:在5mL 100%乙醇中稀释5μL储备溶液。
    注:稀释后的EG3溶液可以密封并储存在4°C，未稀释的EG3储备液应储存在-20°C。 EG3处理用于使没有C18的玻璃区域对细胞不粘附。
11. 每四分之一玻璃将40μL的微量移液滴40μL载玻片滑到湿度室中的parafil膜上，在液滴之间留出足够的空间以考虑金载玻片的间距。
12. 使用镊子将C18印刷的黄金载玻片面朝下放在液滴上，并确保载玻片下方没有气泡。轻轻地将载玻片推在一起，不要提起它们，以尽量减少蒸发。
    注意:将载玻片的一条边缘放在液滴附近，然后缓慢地将载玻片的另一端向下放下。如果存在气泡，请推动黄金滑块而不提起它，直到气泡不再存在。
13. 用石蜡膜密封培养皿，并将其置于室温下至少3小时。
    注意:如果需要广泛的孵育，请双重密封培养皿并使其放置长达24小时。
14. 在生物安全柜中，将金载玻片正面朝上放在培养皿中，浸泡并在70%乙醇中冲洗3次以除去EG3，然后在乙醇中放置10分钟进行灭菌。
15. 吸出乙醇并用无菌PBS代替。
16. 如步骤3.9所述，用PBS代替乙醇制备另一个湿度室。
    注意:由于表面张力的差异，首先添加4-5 mLPBS以铺设parafil并去除气泡，然后吸出多余的气泡更容易。
17. 在无菌PBS和微量移液50μL纤连蛋白溶液中制备50μg/ mL纤连蛋白溶液（如果需要，其他蛋白质），每四分之一滑到副膜上，在液滴之间留出一些空间。
    注意:纤连蛋白涂层有助于细胞粘附在图案表面上。
18. 使用晶圆镊子将载玻片面朝下放在液滴上，并确保载玻片下方没有气泡。轻轻地将滑块推在一起，不要抬起它们。
    注:对于载玻片，建议使用载玻片镊子或带有直宽尖端的晶圆镊子。
19. 将培养皿放在生物安全柜中30分钟。
20. 30分钟后，冲洗3次后，将黄金载玻片正面朝上放在PBS中。
    注意:纤连蛋白图案的载玻片可以在4°C的PBS中储存约一个月。

4. 将细胞接种到微图案载玻片上

1. 在37°C水浴中加热细胞培养基和胰蛋白酶。
   注意:以下传代描述适用于NIH / 3T3细胞。培养条件可能因细胞类型而异。
2. （可选）将图案化的载玻片浸泡在12孔板中的培养基中，在细胞胰蛋白酶消化之前在培养箱中加热至37°C，以获得更好的细胞附着。
3. 胰蛋白酶消化细胞，用含FBS的培养基中和，以100× g 离心3分钟，然后通过与新鲜培养基充分混合来重悬。
   注意:确保单元格彼此完全解离。
4. 计数细胞，稀释至200，000个细胞/ mL，并向每个含有一个金载玻片的孔中加入0.5mL细胞悬浮液。
5. 轻轻摇动孔板几次以进行均匀的细胞接种，并将其储存在培养箱中15分钟以允许细胞附着。
6. 15分钟后，在显微镜下检查细胞附着。如果需要，请留出更多时间。
   注意:附着的细胞将以可见的丝状物或扁平化在表面上扩散，并且当轻轻敲击或移动孔板时不会从表面移动。
7. 从每个孔中抽出含有未连接细胞的培养基，并加入1mL培养基。对于药物治疗，在此步骤中向培养基补充额外的试剂。
8. 在培养箱中培养细胞24小时并检查汇合度以确定是否已经形成手性。
   注意:对于大多数细胞类型，建议汇合度高于75%，过度汇合可能会影响手性表征。

5. 图像收集

1. 在汇合时固定细胞。
   1. 从孔板中取出培养基，并用PBS冲洗一次。
   2. 加入4%多聚甲醛溶液，室温孵育15分钟，然后用PBS冲洗3次。
      注意:如果固定显著改变细胞形态，建议在固定前进行影像学检查
2. 使用具有相机功能的相差显微镜，以高分辨率对载玻片上的每个环进行成像（10x物体镜头足以进行分析）。

6. 细胞手性表征（图2）

1. 从补充文件（补充文件 1）下载用于手性表征的 MATLAB 代码文件。
   注意:该代码已经过测试，可在 Windows 和 macOS 系统上与 MATLAB_R2015b 及更高版本配合使用。运行文件还需要循环统计工具箱，可在参考文献^{17 中找到}。
2. 将代码文件夹和子文件夹（内部有循环统计工具箱）添加到 MATLAB 路径，然后打开"ROI_selection.m"文件。在第 4 行中，将目录更改为所需的数据文件夹（对于窗口用户，在第 4 行和第 5 行中将"/"切换为"\"）。
3. 在第 14 行中更改图像大小，前两个数字表示戒指的内圆大小，而其他两个数字表示外圈大小。
   注意:确保要分析的文件夹中所有图像的大小都相同。
4. 单击" 运行 "按钮执行 MATLAB 代码"ROI_selection.m"，以确定相差图像中的感兴趣区域 （ROI）。
5. 手动拖动选择方块以适合戒指，然后双击图像以确认选择。
6. 对文件夹中的每个图像重复此步骤（确认上一个图像的ROI选择后，将自动弹出下一个图像）;将生成一个".mat"文件来存储每个图像的 ROI 信息。
7. 打开"Analysis_batch.m"文件并更改与步骤6.2相同的文件夹的目录。（对于窗口用户，对于首次使用，请在第 5、6、124 和 130 行中将 "/" 切换为 "\"）
8. 单击" 运行 "按钮执行代码"Analysis_batch.m"以确定多个细胞环模式的手性。将生成一个"datatoexcel.txt"文件，其中包含每个环的循环统计信息以及顺时针、非手性和逆时针环的数量。

结果

在NIH / 3T3细胞接种15分钟后，通过相衬成像视觉上确认细胞在环图案上的粘附。在随后培养24小时后，图案上的细胞变得融合并细长，具有明显的不对称对齐方式，偏向顺时针方向（图2）。通过延时成像记录附着细胞的定向迁移，细胞运动和形态发生可以通过进一步分析视频来量化。为了进行手性分析，在固定后拍摄高分辨率相差图像（图2A-C

讨论

这里描述的环形图案化测定为定量表征多细胞手性提供了一种易于使用的工具，能够产生高度可靠和可重复的结果。快速生成相同的定义微环境和无偏倚分析，可实现大尺寸样品的自动化高通量处理。该协议讨论了环微图案的制造，细胞图案化以及偏置细胞排列和定向运动的自动分析。该方法与实时成像技术兼容，用于研究细胞运动和手性形态发生，并且可以潜在地集成到其他平面形式中，用于?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Koptec	DSP-MD-43
BZX microscope system	Keyence	BZX-600
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Electron beam evaporator	Temscal	BJD-1800	Gold-titanum film coating
Fetal bovine serum	VWR	89510-186
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-5MG
Glass microscope slides	VWR	10024-048
Glass tweezers	Exelta	390BSAPI
Gold evaporation pellets	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658
OAI contact aligner	OAI	200	UV photolithography
Octadecanethiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Orbital shaker	VWR	89032-088
Phosphate buffered saline (PBS)	Research product international	P32080-100T
Polydimethylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon Wafer	University Wafer	ID#809
Sodium pyruvate	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Titanium evaporation pellets	International Advanced Materials	TI14
Transparency mask (with feature)	Outputicity.com	N/A	Mask printing service
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo fisher scientific	25200-072