İnsan α-Sinükleini Kodlayan Adeno İlişkili Viral Vektörler Tarafından İndüklenen Parkinson Hastalığı Fare Modelinin Analizi

Özet

Bu çalışma, Parkinson hastalığının bu klinik öncesi modelinde nöroinflamasyonu, nörodejenerasyonu ve motor bozukluğu indüklemek için gereken vektör dozunu ve maruz kalma süresini analiz etmektedir. İnsan α-sinükleini kodlayan bu vektörler, Parkinson hastalığı ile ilişkili sinüklein patolojisini özetlemek için substantia nigra'ya verilir.

Özet

Parkinson hastalığı, nigrostriatal yolun dopaminerjik nöronlarının ölümünü ve sonuç olarak gönüllü hareketlerin kontrolünün ilerleyici kaybını içeren nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nörodejeneratif süreç, esas olarak α-sinükleinden oluşan beyindeki protein agregalarının birikmesiyle tetiklenir. Birçok çalışma, Parkinson hastalığı ile ilişkili nörodejenerasyonu geliştirmek için nöroinflamasyonun gerekli olduğunu göstermiştir. Özellikle, nöroinflamatuar süreç, mikroglial aktivasyonun yanı sıra periferik T hücrelerinin substantia nigra'ya (SN) infiltrasyonunu içerir. Bu çalışma, mikroglial aktivasyonu, SN'ye T hücresi infiltrasyonunu, nigral dopaminerjik nöronların nörodejenerasyonunu ve motor bozukluğu özetleyen Parkinson hastalığının bir fare modelini analiz etmektedir. Parkinson hastalığının bu fare modeli, insan vahşi tipi α-sinükleini (AAV-hαSyn) SN'ye kodlayan adeno ilişkili viral vektörlerin stereotaksik olarak verilmesiyle indüklenir. Viral vektörlerin SN'ye doğru şekilde verilmesi, yeşil floresan proteini (GFP) kodlayan kontrol vektörleri kullanılarak doğrulandı. Daha sonra, SN'de uygulanan AAV-hαSyn dozunun hαSyn ekspresyonunun derecesini nasıl etkilediği, nigral dopaminerjik nöronların kaybı ve motor bozulma değerlendirildi. Ayrıca, hαSyn ekspresyonu, mikroglial aktivasyon ve T-hücresi infiltrasyonunun dinamikleri, hastalık gelişiminin seyri boyunca belirlendi. Bu nedenle, bu çalışma, Parkinson hastalığının bu klinik öncesi modelinde sinüklein patolojisini ve nöroinflamasyonu hedeflemek için yararlı olabilecek kritik zaman noktaları sunmaktadır.

Giriş

Alzheimer hastalığından sonra, Parkinson hastalığı dünya çapında en yaygın ikinci nörodejeneratif hastalıktır. Parkinson hastalığında etkilenen birincil nöronlar, dopamin üreten ve gönüllü hareketi kontrol eden nigrostriatal yolun nöronlarıdır. Sonuç olarak, bu bozuklukla ilişkili en karakteristik semptom motor bozukluktur. Bu patoloji aynı zamanda beyinde, esas olarak presinaptik terminallerle ilişkili sitozolik bir protein olan α-sinükleinden (αSyn)¹ oluşan protein agregalarının birikmesini de içerir. Kanıtlar, αSyn'in patojenik inklüzyonları oluşumunun, yanlış katlanarak veya bu proteinin bazı post-translasyonel modifikasyonları tarafından tetiklendiğini göstermiştir².

Özellikle, αSyn patolojisi ile insan Parkinson hastalığında ve hayvan modellerinde nigrostriatal yolun dopaminerjik nöronlarının kaybı arasında yakın bir ilişki kurulmuştur ^3,4. αSyn agregalarının nasıl üretildiğini ve nöronal ölümü nasıl indüklediklerini anlamak, bu alanda önemli bir zorluğu temsil eder. Giderek artan bir grup çalışma, oksidatif stresi artırarak, mitokondriyal disfonksiyonun αSyn agregalarının² oluşumunun önde gelen nedenlerinden biri olduğunu göstermiştir. Gerçekten de, Parkinson hastalığı riski ile ilişkili birkaç gen, mitokondriyal fonksiyon, morfoloji ve dinamiklerde rol oynayan proteinleri kodlar ^5,6. Ek olarak, işlevsiz mitokondri birikimi ve yanlış katlanmış αSyn ile sonuçlanan lizozomal disfonksiyon, αSyn agregaları^7'nin oluşumunu teşvik eden bir başka önemli olayı oluşturur.

Ortaya çıkan kanıtlar, αSyn agregaları beyinde biriktiğinde, bu patojenik proteinlerin mikroglia üzerindeki toll benzeri reseptörleri (TLR'ler) uyardığını, böylece substantia nigra (SN) ^8,9'da mikroglial aktivasyonu ve ilk enflamatuar ortamı tetiklediğini göstermiştir. Ayrıca, kanıtlar αSyn agregalarının yakalandığını ve antijen sunan hücreler tarafından T hücrelerine sunulduğunu ve αSyn^10,11'e özgü adaptif bir bağışıklık tepkisini indüklediğini ^{göstermektedir.} Bu αSyn-spesifik T hücreleri daha sonra beyne sızar ve aktif mikroglia tarafından yeniden uyarılır, böylece nöronal ölümü uyandıran nörotoksik faktörlerin salgılanmasını teşvik eder ^9,10. İlginç bir şekilde, birkaç kanıt dizisi, αSyn agregalarının önce enterik sinir sisteminde üretildiğini ve daha sonra vagus sinirinden beyin sapına taşındığını ileri sürmüştür¹².

Parkinson hastalığının çeşitli hayvan modelleri, nörotoksik maddelerin (yani, 6-hidroksidopamin, paraquat, rotenon, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin) ve genetik koşulları içerenler (yani, mutant α-sinüklein, mutant lösin bakımından zengin tekrarlayan kinaz 2) uygulanmasıyla indüklenenler de dahil olmak üzere uzun yıllardır kullanılmaktadır. . Parkinson hastalığının bazı yönlerini kopyalayan nörotoksin kaynaklı nörodejenerasyonu içeren modellere rağmen, hiçbiri hastalığın tüm temel yönlerini özetlemez veya ilerleyici değildir¹³. Öte yandan, lösin bakımından zengin tekrar kinaz 2'nin mutant versiyonlarının ekspresyonunu, α-sinükleinin mutant versiyonlarını veya insan vahşi tip α-sinükleinin aşırı ekspresyonunu içeren genetik fare modelleri, motor bozulmaya ve bazı durumlarda sinükleinopatinin gelişmesine neden olsa da, Parkinson hastalığının önemli bir yönü olan nigral dopaminerjik nöronların belirgin nörodejenerasyonunu yeniden üretmezler^{13, 14}. Üçüncü bir tür nörodejenerasyon hayvan modeli, Parkinson hastalığının temel yönlerinin çoğunu, insan α-sinükleini (AAV-hαSyn) kodlayan adeno ilişkili viral vektörlerin (AAV'ler) stereotaksik olarak verilmesini sağlamayı başarmıştır ^14,15. Önemli olarak, AAV'ler, yüksek etkinliğe sahip nöronların transdüksiyonuna ve memelilerin yetişkin beyninde uzun vadede izin verir. Ayrıca, SN'deki AAV-hαSyn'in stereotaksik iletiminin, αSyn patolojisi, mikroglial aktivasyon, nörodejenerasyon ve motor bozukluk^{16,17,18,19,20} dahil olmak üzere hastalığın temel yönlerinin çoğunu yeniden ürettiği gösterilmiştir. Bu çalışma, viral vektör dozunun ve viral vektör dağıtımından sonraki sürenin, nigrostriatal yolaktaki hαSyn ekspresyonunun, nörodejenerasyonun ve nöroinflamasyonun derecesini ve ayrıca SN'deki hαSyn'in tek taraflı stereotaksik iletiminin fare modelinde motor bozulma derecesini nasıl etkilediğinin bir analizini sunmaktadır.

Protokol

Tüm çalışmalar Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun 8. baskısı altında gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokoller, anestezi, ağrı, sıkıntı ve ötenazi içerenler de dahil olmak üzere Fundación Ciencia & Vida'daki (Yaşam için Bilim Vakfı) IACUC tarafından onaylandı (İzin numarası P-035/2022).

1. Stereotaksik cerrahi

1. Ameliyata hazırlık (yaklaşık 1 saat)
   1. Aseptik bir ortamı korumak için, tüm ameliyat boyunca ayakkabı kapakları, cerrahi maske, sıhhi bariyer, eldiven ve cerrahi başlık dahil olmak üzere uygun cerrahi kıyafetler giyin.
   2. Aseptik bir ortam sağlamak için fareye ve tüm cerrahi malzemelere %70 etanol püskürtün.
   3. Analjezi indüklemek için, fareye ameliyattan 1 saat önce başlayıp ameliyattan 3 gün sonrasına kadar devam eden her 12 saatte^bir deri altından 5 mg / kg karprofen (s.c.) enjekte edin.
   4. Fareyi anestezik etmek için, hayvanı bir indüksiyon odasına yerleştirin. İzofluran akışını %0,5 oranında açın ve ardından fare sağ refleksini kaybedene kadar yaklaşık 5 dakika içinde yavaşça %5'e kadar artırın²².
   5. Hayvanı indüksiyon odasından çıkarın. Hayvanı derhal uygun büyüklükte bir burun konisi ile solunum yapmayan bir devreye aktarın. Fare anestezisini ameliyat süresi boyunca% 1 izofluran ile koruyun.
   6. Farenin kuyruğunu ve pençelerini sıkıştırarak tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın. Fare kuyruğunu ve pençelerini sıkıştırmaya tepki vermediğinde, farenin tamamen uyuşturulduğu anlamına gelir.
   7. Makas kullanarak farenin kafasını tıraş edin. Farenin cildini% 2 klorheksidin içeren bir pamuklu çubukla temizleyin ve tüm saçları çıkarın.
   8. Farenin kafasını stereotaksik çerçeveye sabitleyin.
   9. Pamuklu çubukla her iki fare gözüne de kornea koruyucusu yerleştirin. Diğer kemirgenlerde stres indüksiyonunu önlemek için, ameliyat odasında başka bir farenin varlığından kaçının²³.
2. Ameliyat (yaklaşık 30 dk.)
   1. Farenin kafasını üç tur% 2 klorheksidin ve% 70 etanol ile temizleyin. Kafatasını cerrahi malzeme kullanarak ortaya çıkarın ve aşağıdaki koordinatlarda bir matkapla ince bir delik açın: anteroposterior -2.8 mm ve medial çizgiye göre mediolateral 1.4 mm.
   2. 10 μL'lik bir şırınganın iğnesini deliğe koyun ve dura^24'e göre -7.2 mm dorsoventral'a ulaşana kadar iğneyi beynin içinde yavaşça hareket ettirin.
   3. Dokunun biraz yerleşmesine izin vermek için iğneyi 2 dakika boyunca son pozisyonda bırakın ve ardından 0.2 μL / 30 s oranında sağ substantia nigra'ya 1 μL AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) veya araç (pH 7.4'te PBS; sahte cerrahi) enjekte edin.
   4. Viral vektörlerin verilmesinden sonra iğneyi 5 dakika boyunca aynı pozisyonda bırakın ve ardından yavaşça çekin.
3. Ameliyat sonrası (yaklaşık 5 dakika)
   1. Steril ipek örgülü emilemeyen bir dikiş kullanarak yarayı kapatın.
   2. Fareyi, elektrikli ısıtmalı bir yatağın (25 ° C) üzerine yerleştirerek önceden ısıtılmış ev kafesine koyun.
      NOT: Fare, zorluk çekmeden yürüyene ve yara iyileşene kadar ev kafesinde tek başına tutulmalıdır.

2. Kiriş testi kullanılarak motor performansının belirlenmesi

1. Eğitim (fare başına yaklaşık 15 dakika)
   1. Stereotaksik cerrahiden on iki hafta sonra,^25'ten önce tarif edilen ışın testinin basitleştirilmiş bir versiyonunu kullanarak motor performansını değerlendirin. Bu amaçla, 25 cm uzunluğunda ve 3 cm genişliğinde yatay bir kiriş kullanın. Kiriş yüzeyi, 1 cm kareli metalik bir ızgara ile kaplanmalı ve kirişin 1 cm üzerinde yükseltilmelidir.
   2. Farenin, ızgara yüzeyi ışınını bir uçtan ev kafesinin bulunduğu kirişin karşı ucuna doğru geçtiği bir video çekin. Motor performansının belirlenmesinden önce fareyi 2 gün boyunca eğitin.
   3. İlk gün, fareyi ızgara olmadan ışının içinden beş kez yürümesi için eğitin.
   4. İkinci gün, fareyi ızgaranın varlığında ışının içinden beş kez yürümesi için eğitin.
2. Test (fare başına yaklaşık 5 dakika)
   1. Üçüncü günde, motor performansını değerlendirin. Bunu yapmak için, videoları ağır çekim modunda izleyerek sol pençeler veya sağ pençeler tarafından gerçekleştirilen hataların sayısını ayrı ayrı ölçün.
      NOT: Bir hata, bir pençenin ızgaraya doğru şekilde basmaması ve bu nedenle ızgaranın yan tarafında veya ızgara ile kiriş yüzeyi arasında görünür hale gelmesi olarak tanımlanır.

3. Doku işleme

1. Transkardiyal perfüzyon (fare başına yaklaşık 15 dakika)
   1. Fareyi anestezik etmek için, 1 mL'lik bir şırınga ve 27 G iğne²⁶ kullanarak intraperitoneal olarak (i.p.) ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı enjekte edin.
   2. Fare tamamen anestezi altına alındıktan sonra (adım 1.1.6.'daki gibi onaylanmıştır), toraksı cerrahi malzeme ile açın ve kalbi açığa çıkarın.
   3. Ardından, kalbin sol ventrikülüne 21 G'lik bir iğne yerleştirin (matkap kullanarak ucu düz hale getirin).
   4. İğneyi bir boruya bağlayarak, peristaltik bir pompa kullanarak 50 mL PBS (pH 7.4) perfüze edin.
2. Beynin sabitlenmesi ve kriyoproteksiyonu (beyin başına yaklaşık 10 dakika)
   1. Makas ve cımbız kullanarak beyni çıkarın ve ardından 24 saat boyunca 4 ° C'de PBS'de (pH 7.4) 5 mL% 4 paraformaldehit daldırarak sabitleyin.
   2. Daha sonra, sabit beyni 48 saat boyunca 4 ° C'de% 30 sakkarozun 15 mL'sine koyun.
   3. Daha sonra, beyni 4 mL kriyoproteksiyon çözeltisine (PBS'de% 20 gliserin ve% 2 DMSO) koyun ve beyni -80 ° C'de saklayın veya bir sonraki adımda hemen kullanın.
3. Beyin dilimleri elde etmek (beyin başına yaklaşık 20 dakika).
   NOT: Koronal kesikler yapmak için beynin bir kriyostata uygun bir pozisyonda yerleştirildiğinden emin olun.
   1. SN dilimleri elde etmek için, beyni -2,92 mm'den başlayıp -3,64 mm 24'te bitirerek⁴⁰ μm kalınlığında bölümlere ayırın.
   2. Her dilimi,^25,27,28'den önce tarif edildiği gibi anteroposterior bir sırayı takiben 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyusunda (1 mL kriyoproteksiyon çözeltisi içeren) hasat edin.
   3. SN'de immünohistokimyasal (bölüm 4.) ve immünofloresan analizleri (bölüm 5.) yapmak için, 25,27,28'den önce açıklandığı gibi^, çekirdeğin tüm rostrokaudal derecesini (toplamda 720 μm) kapsayan tek tip aralıklarla (¹²⁰ μm) alınan altı koronal SN bölümünü seçin.
   4. Striatal dilimler elde etmek için, beyni +1.34 mm'den başlayıp -0.26 mm 24'te bitirerek⁴⁰ μm kalınlığında bölümlere ayırın.
   5. Her dilimi, anteroposterior bir sırayı takiben 2 mL'lik bir kriyotüp (1 mL kriyoproteksiyon çözeltisi içeren) içinde hasat edin.
   6. Striatumda immünohistokimyasal (bölüm 4.) ve immünofloresan analizleri (bölüm 5.) yapmak için, çekirdeğin tüm rostrokaudal derecesini (toplamda 1600 μm) kapsayan düzgün aralıklarla (320 μm) alınan beş koronal striatal bölüm seçin.

4. Dopaminerjik nöronları ve mikrogliozu ölçmek için immünohistokimyasal analiz (yaklaşık 2 gün)

1. Striatal veya nigral dilimlerin immünohistokimyasal analizi için, aynı beyinden beş (striatum) veya altı (SN) dilim setini 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin.
2. Bölümleri 3x'i 1 mL PBS ile yıkayın ve daha sonra endojen peroksidaz aktivitesini inaktive etmek için oda sıcaklığında ve 30 dakika boyunca çalkalama ile metanolünde% 0.03_H2O2 0.5 mL ile inkübe edin.
3. Bölümleri 3x'te 1 mL PBS ile yıkayın ve 0,5 mL blokaj çözeltisi (% 4 keçi serumu,% 0,05 Triton X-100 ve% 4 BSA) ile oda sıcaklığında ve 40 dakika boyunca çalkalama ile inkübe edin.
4. Daha sonra, oda sıcaklığında ve gece boyunca ajitasyonla primer antikor (tavşan anti-tirozin hidroksilaz [TH] pAb seyreltilmiş 1:1000 [bakınız Tablo 1]; veya tavşan anti-Iba1 antikoru seyreltilmiş 1:1000) içeren 0,5 mL bloke edici çözelti ile inkübe edin.
5. 3x kesitlerini 1 mL PBS ile yıkayın ve biyotinile keçi anti-tavşan pAb (1:500, bakınız Tablo 1) içeren 0,5 mL bloke edici çözelti ile oda sıcaklığında ve 2 saat boyunca ajitasyonla inkübe edin.
6. Daha sonra, 3x kesitleri 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında bloke çözeltisinde ve 90 dakika boyunca ajitasyonla 0,5 mL peroksidaz konjuge avidin (1:5000, bakınız Tablo 1) ile inkübe edin.
7. Bölümleri 3x, 1 mL PBS ile yıkayın ve 0,5 mL substrat çözeltisi (pH 7,6'da %0,03 H_{2 O 2/}Trizma-HCl tamponunda %0,05 diaminobenzidin) ile inkübe edin. Bu adım için eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin, çünkü diaminobenzidin potansiyel bir kanserojendir.
8. Spesifik boyama belirgin olduğunda (tipik olarak TH için 30 saniye ve Iba1 için 5 dakika), substrat çözeltisini çıkarın ve 3x bölümlerini oda sıcaklığında ve ajitasyonda 1 mL PBS ile yıkayın. Her zaman aynı deneyde yer alan tüm beyin dilimlerinin immün boyamasını aynı anda gerçekleştirin.
   NOT: TH'nin spesifik boyanması, beyinde karakteristik bir şekil gösteren SN bölgesinde TH immün boyaması ortaya çıktığında belirgindir. Iba1'in spesifik işareti, mikroskop gözlemi ile doğrulanan tipik mikroglial şekillere sahip kontrol beyin dilimlerinde Iba1 immün boyama göründüğünde belirlenir. Bu şekilde, IHC analizi için substrat açıklığının tam zamanı her bir deney için belirlenir.
9. Beyin bölümlerini 0.05 M Tris'te (pH 7.6) % 0.2'lik bir jelatin çözeltisi kullanarak cam slaytlara monte edin. Aynı beyinden elde edilen beş (striatum) veya altı (SN) dilimden oluşan her seti rostrokaudal sırayla aynı cam slayta yerleştirin.
10. SN'deki TH⁺ nöronlarının sayısını sayın.
    1. SN'deki TH⁺ nöronlarını ölçmek için, ^25,27,28'den önce açıklandığı gibi parlak alan mikroskobu kullanarak^20x büyütmede altı dilimin fotoğraflarını alın. Aşağıdaki renk ayarını kullanın: renk sıcaklığı 3200 K, camgöbeği kırmızısı% 40, macenta-yeşil% 39, sarı-mavi% 54, gama 0,5, kontrast 37, parlaklık 13, doygunluk 5.
    2. Image J yazılımını kullanarak, analiz edilen yarımküredeki SN pars compacta'nın çevresini seçin. Ventral tegmental alandan (VTA) TH⁺ nöronlarının seçiminden kaçının.
    3. Daha sonra, yazılımdan seçilen alanı hesaplamasını isteyin (rostrokaudal konuma bağlı olarak tipik olarak 0.04-0.07 mm² / yarımküre). Ardından, çok noktalı aracı kullanarak, her bir TH⁺ nöronunu bir nokta ile etiketleyin.
    4. Nokta aracını kullanarak, yazılımdan toplam nokta sayısını saymasını isteyin. Toplam nokta sayısı (TH+ nöronlar) ve SNpc'nin alanı ile TH⁺ nöronlarının /^mm2'nin yoğunluğunu hesaplayın.
    5. Aynı hesaplamayı altı SN diliminde her iki yarımkürede de tekrarlayın ve ardından ipsilateral ve kontralateral taraflardaki TH⁺ nöronlarının /^mm2'nin ortalamasını hesaplayın.
11. Striatumdaki aktif mikroglia sayısını ölçün
    1. Striatumdaki aktif mikrogliayı ölçmek için, parlak alan mikroskobu ve adım 4.10.1'de belirtilen aynı ayarları kullanarak 20x büyütmede beş striatal dilimin tümü için her yarım kürede iki fotoğraf elde edin. Image J yazılımını kullanarak, her bir fotoğrafta (660 μm x 877 μm alan görüntüleyerek), çok noktalı aracı kullanarak yüksek Iba1 yoğunluğunu ve ameboid şeklini ifade eden her bir hücreyi bir nokta ile etiketleyin. Nokta aracını kullanarak, yazılımdan toplam nokta sayısını saymasını isteyin.
    2. Toplam nokta sayısı ve fotoğrafın alanı ile,^29'dan önce gerçekleştirilen aktif mikroglia yoğunluğunu (Iba1^yüksek hücreler /^mm2) hesaplayın.

Hedef antijen	Şuna bağlı	Klonalite	Ana bilgisayar özellikleri	Özel reaktivite*	Seyreltme**
Tirozin Hidroksilaz	Yok	Poliklonal	Tavşan	Fare, Sıçan, İnsan	1/200 - 1/1000
İba1	Yok	Monoklonal	Tavşan	Fare, Sıçan, İnsan	1/1000
alfa-Sinüklein	Yok	Monoklonal	Tavşan	İnsan	1/150
CD4	Yok	Monoklonal	Sıçan	Fare	1/250
IgG (H+L)	Biyotinillenmiş	Poliklonal	Keçi	Tavşan	1/500
IgG (H+L)	AlexaFluor 546 ·	Poliklonal	Keçi	Tavşan	1/500
IgG (H+L)	AlexaFluor 647 ·	Poliklonal	Keçi	Tavşan	1/500
IgG (H+L)	AlexaFluor 546 ·	Poliklonal	Keçi	Sıçan	1/500

Tablo 1: Antikor seyreltmeleri. N/A, geçerli değil. *, Diğer türlerle reaktiviteden bağımsız olarak, yalnızca fare, sıçan ve insan ile reaktivite varsa belirtilir. **, Tek bir seyreltme veya seyreltme aralığı belirtilir.

5. Nigrostriatal yolakta T hücresi infiltrasyonunu değerlendirmek için immünofloresan analizi (yaklaşık 2 gün)

1. Striatal veya nigral dilimler üzerinde hαSyn veya TH/GFP'nin immünofloresan analizi için, aynı beyinden beş (striatum) veya altı (SN) dilim setini 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda bir araya getirin.
   1. 3x kesitleri 1 mL PBS ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında ve 40 dakika boyunca çalkalama ile 0,5 mL blokaj çözeltisi (% 0,3 Triton X-100,% 0,05 ara20 ve% 5 BSA) ile inkübe edin.
   2. Daha sonra, birincil antikoru (tavşan anti-TH pAb seyreltilmiş 1:500; veya tavşan anti-hαSyn antikoru seyreltilmiş 1:150) içeren 0.5 mL bloke edici çözelti ile inkübe edin, oda sıcaklığında ve gece boyunca ajitasyonla.
2. 3x bölümlerini 1 mL PBS ile yıkayın ve AlexaFluor546 kuplajlı anti-tavşan sekonder antikoru (1:500, bakınız Tablo 1) ve 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1:1000) içeren 0,5 mL bloke çözeltisi ile oda sıcaklığında ve 2 saat boyunca ajitasyonla inkübe edin. Ardından, bölümleri 3x olarak 1 mL PBS ile yıkayın.
3. Beyin bölümlerini yukarıda açıklandığı gibi cam slaytlara monte edin (adım 4.9.). Görüntüler, bir güç kaynağı ünitesine bağlanmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu ile elde edildi.
4. Nigral dilimler üzerinde TH/CD4/GFP(Foxp3)'ün immünofloresan analizi için, aynı beyinden altı (SN) dilim setini 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. 3x kesitleri 1 mL PBS ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında ve 2 saat boyunca ajitasyonla 0,5 mL bloke edici çözelti (PBS'de% 0,5 Triton X-100,% 0,5 balık derisi jelatini) ile inkübe edin.
5. Birincil antikorlar tavşan anti-TH pAb (1:200, bakınız Tablo 1) ve sıçan anti-CD4 (1:250) içeren 0.5 mL bloke edici çözelti ile 4 ° C'de ve gece boyunca ajitasyonla inkübe edin.
6. Bölümleri 3x'i 1 mL PBS ile yıkayın ve AlexaFluor 647'ye (1:500, bakınız Tablo 1) bağlı anti-tavşan ve AlexaFluor 546'ya ( 1:500) bağlı anti-sıçan içeren 0,5 mL bloke çözeltisi ile oda sıcaklığında ve 2 saat boyunca ajitasyonla inkübe edin. Ardından, bölümleri 3x olarak 1 mL PBS ile yıkayın.
7. Aynı beyinden elde edilen altı (SN) dilim setini rostrokaudal sırayla aynı cam slayta koyun ve bunları Fluoromount G. kullanarak monte edin Leica DMi8 mikroskobu kullanarak görüntü elde edin. İmmünofloresan analizinden görüntü elde etmek için Tablo 2'de belirtilen konfokal mikroskop ayarlarını kullanın.

Chanel Adı	Küp	Emisyon Dalga Boyu	Arama Tablosu adı	Pozlama süresi	Kazanç	Çözünürlük XY	Çözünürlük Z
Kanal 1	Y5 Serisi	700nm	Gri	1.011,727 ms	yüksek kuyu kapasitesi	2.237 um	24.444 um
Kanal 2	cesaret	525nm	Yeşil	326.851 ms	yüksek kuyu kapasitesi	2.237 um	24.444 um
Kanal 3	cesaret	630nm	Kırmızı	406.344 ms	yüksek kuyu kapasitesi	2.237 um	24.444 um
Kanal 4	Dapi Dili	460nm	Mavi	91.501 ms	yüksek kuyu kapasitesi	2.237 um	24.444 um

Tablo 2: İmmünofloresan analizinden görüntü elde etmek için kullanılan konfokal mikroskop ayarları.

6. İstatistiksel analiz

1. İpsilateral ve karşıt taraflardan elde edilen verileri karşılaştırmak için, eşleştirilmiş iki kuyruklu bir Öğrenci t-testi kullanın.
2. AAV-hαSyn alan farelerden ve AAV-GFP veya sahte cerrahi alan farelerden elde edilen verileri karşılaştırmak için, eşleşmemiş iki kuyruklu bir Öğrenci t-testi kullanın. P değerleri 0,05 < olduğunda önemli farklılıklar göz önünde bulundurun.

Sonuçlar

Nigrostriatal yolun dopaminerjik nöronlarında AAV vektörlerinin doğru iletiminin doğrulanması
Sinüklein patolojisi tarafından teşvik edilen nöroinflamasyon, nörodejenerasyon ve motor bozukluk süreçlerini incelemek için, SN^{16,17,30,31'de} AAV kodlama hαSyn'in tek taraflı stereotaksik iletimi ile indüklenen Parkinson hastalığının bir fare modeli kullanılmıştır (Ek Şekil 1'deki deneysel tasarıma bakınız). ). Nigrostriatal yolun dopaminerjik nöronlarında AAV vektörlerinin doğru iletimini doğrulamak için, SN'ye GFP (AAV-GFP) kodlayan AAV enjekte edildi ve 12 hafta sonra, GFP floresan ve tirozin hidroksilaz (TH) immünoreaktivitesi SN ve striatumda immünofloresan ile analiz edildi. GFP ile ilişkili floresan sadece ipsilateral tarafta gözlendi ve hem SN hem de striatumda TH immünoreaktivitesi ile anlamlı kolokalizasyon vardı, bu da nigrostriatal yolun dopaminerjik nöronlarında AAV vektörlerinin doğru verildiğini gösterdi (Şekil 1).

Şekil 1: AAV-GFP'nin nigrostriatal yolakta verilmesinin analizi. Farelere AAV-GFP (1 x 10¹⁰ vg / fare) verildi ve 12 hafta sonra kurban edildi ve TH, (A) SN'de (ölçek çubukları 118 μm) ve (B) striatumda (ölçek çubukları 100 μm) immünoboyadı. TH- ve GFP ile ilişkili floresan epifloresan mikroskopi ile analiz edildi. Çekirdekler DAPI ile boyandı. TH (kırmızı), GFP (yeşil) ve DAPI'nin (mavi) birleştirilmiş veya tek boyanmasının temsili görüntüleri gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

AAV-hαSyn tarafından indüklenen Parkinson hastalığının fare modelinde nörodejenerasyon ve motor bozukluğu indüklemek için uygulanan viral vektör dozunun ayarlanması
Nigral dopaminerjik nöronların nörodejenerasyonunu destekleyen hαSyn'in anlamlı bir aşırı ekspresyonunu indüklemek için gereken AAV-hαSyn dozunu test etmek için, AAV-hαSyn'in farklı dozları (1 x 10⁸ viral genom [vg] / fare, 1 x 10⁹ vg / fare veya^{1 x 10 10} vg / fare) enjekte edildi ve 12 hafta sonra, nigrostriatal yolda hαSyn immünoreaktivitesi ve TH immünoreaktivitesinin derecesi değerlendirildi. SN'de test edilen tüm dozlarda hαSyn immünoreaktivitesi belirgin olmasına rağmen (Şekil 2), sadece 1 x 10¹⁰ vg / fare alan fareler striatumda belirgin hαSyn immünoreaktivitesi göstermiştir (Şekil 3). Ayrıca, AAV-hαSyn'den^{1 x 10} vg / fare alan fareler, SN'de önemli miktarda dopaminerjik nöron kaybı gösterdi (Şekil 4A, B). AAV-GFP'nin 1 x^{10 10} vg / faresini alan fareler düşük derecede (~% 20) nöronal kayıp göstermesine rağmen (Şekil 4A, B), aynı dozda AAV-hαSyn alan fareler, nigral dopaminerjik nöronların önemli ölçüde daha yüksek bir nörodejenerasyon derecesini göstermiştir (Şekil 4C). Buna göre, AAV-hαSyn'in 1 x^{10 10} vg / faresi kullanılarak daha ileri deneyler yapıldı. Ek olarak, motor bozukluğun derecesi,^25'ten önce açıklandığı gibi, ışın testi (Şekil 5A) kullanılarak farklı dozlarda AAV-hαSyn alan farelerde belirlendi. Motor performansında önemli bir azalma, ışın testinde hem sağ hem de sol pedler tarafından yapılan hataların sayısını karşılaştırırken (Şekil 5B) ve AAV-hαSyn alan farelerin toplam hata sayısını AAV-GFP kontrol vektörünü alan farelerle karşılaştırıldığında (Şekil 5C) sadece 1 x 10¹⁰ vg / fare AAV-hαSyn ile tespit edilmiştir (Şekil 5C). Buna göre, AAV-hαSyn'in 1 x^{10 10} vg / faresi kullanılarak daha ileri deneyler yapıldı.

Şekil 2: Farklı dozlarda AAV-hαSyn ile tedavi edilen farelerin SN'sinde insan α-sinüklein ekspresyonunun analizi. Farelere (A) 1 x 10 10 vg / fare, (B) 1 x 10⁹ vg / fare veya (C)^{1 x 10 8} vg / farede AAV-hαSyn verildi ve 12 hafta sonra feda edildi ve hαSyn ekspresyonu epifloresan mikroskobu kullanılarak SN'de immünofloresan ile analiz edildi. Çekirdekler DAPI ile boyandı. hαSyn (kırmızı) veya DAPI'nin (mavi) birleştirilmiş veya tek boyanmasının temsili görüntüleri gösterilir. Ölçek çubukları 118 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Farklı dozlarda AAV-hαSyn ile tedavi edilen farelerin striatumunda insan α-sinüklein ekspresyonunun analizi. Farelere (A) 1 x 10 10 vg / fare, (B) 1 x^{10 9} vg / fare veya (C) 1 x 10⁸ vg / fare) AAV-hαSyn verildi ve 12 hafta sonra kurban edildi ve hαSyn ekspresyonu epifloresan mikroskobu kullanılarak striatumdaki immünofloresan ile analiz edildi. Çekirdekler DAPI ile boyandı. hαSyn (kırmızı) veya DAPI'nin (mavi) birleştirilmiş veya tek boyanmasının temsili görüntüleri gösterilir. Ölçek çubukları 100 μm'dir. Birleştirilen görüntülerin sağ üst köşesindeki ek, daha yüksek büyütmeye ilgi duyan bir alanı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farklı dozlarda AAV-hαSyn veya kontrol vektörü ile tedavi edilen farelerde SN'nin dopaminerjik nöronlarının kaybı. Farelere AAV-hαSyn (1 x 10 10 vg/fare, 1 x 10⁹ vg/fare veya 1 x 10⁸ vg/fare) veya AAV-GFP (1 x 10¹⁰ vg/fare) verildi ve¹² hafta sonra kurban edildi ve TH, immünohistokimya ile SNpc'de analiz edildi. (A) Temsili görüntüler. Ölçek çubukları, 100 μm. (B,C) Nöronların yoğunluğu, TH+ nöronların/^mm2'nin sayısı olarak ölçüldü. Veriler ortalama ± SEM temsil eder. n = grup başına 3-8 fare. (B) İki kuyruklu eşleştirilmiş Öğrencinin t-testi kullanılarak ipsilateral ile kontralateral tarafların karşılaştırılması yapılmıştır. (C) AAV-hαSyn veya AAV-GFP 1 x¹⁰ vg/fare alan farelerden ipsilateral kenarların karşılaştırılması gerçekleştirilmiştir. (B,C) Beyaz çubuklar, AAV-hαSyn alan farelerin ipsilateral tarafındaki TH+ nöronlarının miktarını gösterirken, yeşil çubuklar, AAV-GFP alan farelerin ipsilateral tarafındaki TH+ nöronlarının miktarını gösterir. Gri çubuklar, karşılık gelen grubun karşıt tarafındaki TH+ nöronlarının miktarını gösterir. Karşılaştırmalar iki kuyruklu eşlenmemiş bir Student's t-testi ile yapıldı. *p < 0,05; **p 0,01 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Farklı dozlarda AAV-hαSyn ile tedavi edilen farelerde motor performansının analizi. Farelere AAV-hαSyn veya AAV-GFP'nin farklı dozları (1 x 10 10 10 vg / fare, 1 x 10⁹ vg / fare veya 1 x 10⁸ vg / fare) verildi ve 12 hafta sonra motor performansı ışın testi ile değerlendirildi. (A) Kiriş üzerinde yürüyen bir farenin görüntüsü. (B) AAV-hαSyn alan fare gruplarında sol ekstremiteler (kontralateral) ile sağ ekstremiteler (ipsilateral) arasında gerçekleştirilen hataların sayısı ölçülmüştür. (C) Toplam hata sayısı, aynı dozda AAV-hαSyn veya AAV-GFP alan farklı deney grupları arasında karşılaştırılmıştır. Veriler ortalama SEM ± temsil eder. n = grup başına 3-5 fare. Karşılaştırmalar (B) eşleştirilmiş iki kuyruklu bir Öğrencinin t-testi veya (C) eşlenmemiş iki kuyruklu bir Öğrencinin t-testi ile gerçekleştirilmiştir. *p < 0,05; **p 0,01 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

AAV-αSyn tarafından indüklenen Parkinson hastalığı modelinin kinetiğinin kurulması
Önemli düzeyde nörodejenerasyon ve motor bozukluğu indüklemek için kullanılan uygun AAV-hαSyn dozunu belirledikten sonra, hαSyn aşırı ekspresyonunun başlangıcını tanımlamak için deneyler yapıldı. Bu amaçla fareler 1 x 10 10^vg /fare AAV-hαSyn veya sahte cerrahi ile tedavi edildi. hαSyn ekspresyonunun kapsamı, stereotaksik cerrahiden sonraki 2-5. haftalarda haftada bir kez SN'de analiz edildi ( Ek Şekil 2'deki deneysel tasarıma bakınız). Sonuçlar, hαSyn ekspresyonunun ameliyattan 2 hafta kadar erken bir sürede düşük seviyelerde tespit edilmesine rağmen, hαSyn kümelerinin stereotaksik cerrahiden sonraki 5. haftada ortaya çıktığını göstermektedir (Şekil 6).

Şekil 6: AAV-hαSyn ile tedavi edilen farelerin SN'sinde insan α-sinüklein ekspresyonunun zaman seyrinin analizi. Farelere AAV-hαSyn (1 x^{10 10} vg / fare) veya sadece sahte stereotaksik cerrahi verildi ve SN'deki hαSyn ekspresyonu (A) 2 hafta, (B) 3 hafta, (C) 4 hafta veya (D) 5 hafta sonra epifloresan mikroskobu kullanılarak immünofloresan ile analiz edildi. Çekirdekler DAPI ile boyandı. hαSyn (kırmızı) veya DAPI'nin (mavi) birleştirilmiş veya tek boyanmasının temsili görüntüleri gösterilir. Ölçek çubukları, 100 μm. Birleştirilen görüntülerin sağ üst köşesindeki ek, daha yüksek büyütmeye ilgi duyan bir alanı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Daha sonra, AAV-hαSyn'in stereotaksik dağıtımından sonra merkezi sinir sisteminde (CNS) nöroinflamasyonu ve T-hücresi infiltrasyonunu analiz etmek için uygun zaman noktalarını belirlemek için deneyler yapıldı. AAV-hαSyn ile farelerin tedavisinden sonra mikroglial aktivasyonun zirvesini belirlemek için, steriatumda yüksek Iba1 seviyelerini eksprese eden hücrelerin derecesi, stereotaksik cerrahiden sonraki 2-15. haftalarda haftada bir kez değerlendirildi. Sonuçlar, AAV-hαSyn tedavisinden 15 hafta sonra farelerin kontralateral tarafına kıyasla ipsilateral tarafın mikroglial aktivasyonunda anlamlı bir artış olduğunu göstermektedir (Şekil 7). SNpc'ye sızan Treg (CD4 + Foxp3 ⁺) hücrelerinin sayısı, immünofloresan ve konfokal mikroskopi gözlemi ile AAV-hαSyn'in stereotaksik olarak verilmesinden sonra farklı zaman noktalarında da değerlendirildi. Sonuçlar, Treg infiltrasyonunun SNpc'ye infiltrasyonunun zirvesinin ameliyattan 11 hafta sonra olduğunu, Treg'in beynin bu bölgesine sızma derecesinin ameliyattan sonraki 8. haftada veya 13. haftada daha düşük olduğunu göstermektedir (Şekil 8). Striatuma sızan CD4 ⁺ T hücresi tespit edilmedi (veriler gösterilmedi). Toplamda, bu sonuçlar, AAV-hαSyn'in 1 x 10 10 vg / faresini kullanarak, nöroinflamasyonu analiz etmek için en uygun zaman noktasının stereotaksik cerrahiden sonraki 15. hafta olduğunu, CNS'ye T hücresi infiltrasyonunu analiz etmek için uygun bir zaman noktasının AAV-hαSyn tedavisinden sonra¹¹. hafta olduğunu göstermektedir.

Şekil 7: AAV-hαSyn ile aşılanmış farelerde mikroglial aktivasyonun zaman seyrinin analizi. Farelere AAV-hαSyn (1 x 10¹⁰ vg/fare) verildi ve mikroglial aktivasyon, ameliyat sonrası farklı zaman noktalarında striatumdaki Iba1'in immünohistokimyasal analizi ile değerlendirildi. (A) AAV-hαSyn ile aşılamadan 5 hafta, 10 hafta veya 15 hafta sonra kurban edilen farelerden Iba1'in immünohistokimyasal analizinin temsili genel görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 110 μm. (B) Aktif mikroglianın yoğunluğu, alan başına yüksek düzeyde Iba1 ve ameboid şekli eksprese eden hücre sayısı olarak ölçülmüştür. Veriler ortalama ± SEM temsil eder. n = grup başına 3 fare. Her grupta ipsilateral ve kontralateral Iba1 arasındaki istatistiksel farklılıkları belirlemek için iki kuyruklu eşleştirilmiş bir Öğrenci t-testi kullanıldı. *p 0,05 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: AAV-hαSyn ile aşılanmış farelerin SN'sine CD4 + T hücresi infiltrasyonunun zaman seyrinin analizi. Foxp3^gfp muhabir fareleri AAV-hαSyn (1 x 10¹⁰ vg / fare) aldı. Foxp3'ü eksprese eden CD4 ⁺ T hücrelerinin varlığı ve TH⁺ nöronlarının varlığı, immünofloresan ile SN'de farklı zaman noktalarında (8. hafta, 11. hafta ve ameliyattan sonraki 13. hafta) analiz edildi. (A) Tek immün boyama veya birleştirme için temsili görüntüler gösterilir. Ölçek çubukları, 100 μm. (B) SN'de alan başına CD4⁺ Foxp3⁺ T hücrelerinin sayısı ölçüldü. Veriler, grup başına 3 fareden ortalama ± SEM'i temsil eder. *p<0.05, iki kuyruklu Öğrenci t-testi ile ipsilateral ve kontralateral ^CD4+ Foxp3⁺ T hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Farklı dozlarda AAV vektörlerinin sinüklein patolojisi, nörodejenerasyon ve motor bozukluk üzerindeki etkisini değerlendirmek için deneysel tasarım. Vahşi tip erkek C57BL / 6 fareler anestezi altına alındı ve CBA promotörünün kontrolü altında insan α-sinükleini (AAV-hαSyn) veya eGFP (AAV-GFP) kodlayan AAV'nin farklı dozlarında (1 x 10 10 vg / fare, 1 x 10⁹ vg / fare veya 1 x 10⁸ vg / fare) stereotaksik aşılama yapıldı. 12 hafta sonra, SN ve striatumda (Str) GFP ve hαSyn ekspresyonu immünofloresan (IF), tirozin hidroksilaz pozitif (TH+) hücreler SN'de immünohistokimya (IHC) ile ölçüldü ve ışın testi ile motor performans değerlendirildi. Her deney grubundaki fare sayısı parantez içinde belirtilmiştir. * Analizlerden önce bir farenin öldüğü grupları gösterir. Her analiz, parantez içinde, karşılık gelen sonuçların gösterildiği kağıdın gövdesindeki şeklin numarasını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: T-hücresi infiltrasyonu, nöroinflamasyon ve hαSyn ekspresyonunun kinetiğini belirlemek için deneysel tasarım. Foxp3^gfp muhabir fareleri anestezi altına alındı ve CBA promotörünün kontrolü altında insan α-sinükleini (AAV-hαSyn) kodlayan AAV'nin (^{1 x 10 10} vg / fare) stereotaksik aşılaması yapıldı. Fareler farklı zaman noktalarında kurban edildi ve SN ve striatumdaki hαSyn ekspresyonu immünofloresans (IF), GFP (Foxp3), CD4 ile değerlendirildi ve tirozin hidroksilaz pozitif (TH⁺) hücreler SN'de IF ile ölçüldü ve Iba1 ekspresyonu striatumda (Str) immünohistokimya (IHC) ile analiz edildi. Her deney grubundaki farelerin sayısı belirtilmiştir. Her analize dahil edilen zaman noktaları aralığı belirtilir. Her analiz, parantez içinde, karşılık gelen sonuçların gösterildiği kağıdın gövdesindeki şeklin numarasını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Burada analiz edilen nörodejenerasyonun fare modeli, αSyn patolojisinde ve mikroglial aktivasyonda yer alan mekanizmalar, periferik bağışıklık sisteminin nöroinflamasyonun düzenlenmesine katılımı ve nörodejenerasyon mekanizmaları dahil olmak üzere Parkinson hastalığının patofizyolojisinde yer alan birçok kritik yönün incelenmesine yardımcı olabilir. αSyn patolojisinde yer alan mekanizmalar arasında, SN^2'nin dopaminerjik nöronlarında aşırı miktarda αSyn yükü varlığında mitokondriyal, lizozomal veya proteazomal disfonksiyon ile ilişkili hücre altı mekanizmalar bulunmaktadır. AAV aracılı transdüksiyonun neden olduğu hαSyn ekspresyonuna ek olarak, endojen fare αSyn'in de toplam αSyn ekspresyonunun yüküne katkıda bulunduğunu düşünmek önemlidir. Fare αSyn'i aşırı eksprese eden transgenik fareler, hαSyn^32'nin aşırı ekspresyonuna dayanan bu fare modellerine benzer sinüklein patolojisi, nöropatoloji ve motor bozukluk geliştirir. Mikroglial aktivasyon ile ilgili olarak, mevcut fare modeli, sitokinler, nörotransmiterler, astrositler, nöronlar, kan-beyin bariyeri ve T hücreleri gibi farklı moleküler ve hücresel oyuncuların pro-inflamatuar veya anti-inflamatuar fonksiyonel fenotiplerin edinimini nasıl düzenleyebileceğini incelemek için kullanılabilir 8,10,11 . Bu model aynı zamanda sadece T hücreleri değil, makrofajlar, monositler ve nötrofiller de dahil olmak üzere periferik bağışıklık sisteminin nigral nöronların nöroinflamasyon ve nörodejenerasyon süreçleri üzerindeki rolünü incelemek için önemli bir araç oluşturmaktadır 11,33,34. Son olarak, bu fare modeli aynı zamanda oksidatif stres, enerji açıkları ve hasarlı organeller ² gibi iç hücresel süreçler tarafından indüklenenler veya mikroglial hücreler, astrositler ve sitotoksik T hücreleri^tarafından üretilen nörotoksik faktörler gibi dış oyuncular tarafından uygulananlar da dahil olmak üzere nörodejenerasyonun hücresel ve moleküler mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için değerli bir sistemi temsil eder^{. 28,29,35}.

Bu fare modelinin bir sınırlaması, αSyn'in ekstra-serebral lokalizasyonlarda patolojik agregasyonunun Parkinson hastalığının gelişiminde ilk aşamaları nasıl oluşturabileceğinin incelenmesidir³⁶. Bu bağlamda, nigral nöronların nörodejenerasyonundan ve motor bozulmadan önce, αSyn patolojisinin bağırsak mukozasında ve koku alma epiteli^{36'da ve muhtemelen αSyn'e} özgü T-hücresi yanıtında da başladığını gösteren kanıtlar artmaktadır¹². Daha sonra, αSyn agregaları vagus sinirinden beyin sapına göç edecek ve dopaminerjik nöronların nöroinflamasyonunu ve nörodejenerasyonunu tetikleyecektir¹². AAV-hαSyn modeli Parkinson hastalığının birçok yönünü özetlemesine rağmen, bu modelde ekstra-serebral lokalizasyonlarda αSyn'in patolojik agregasyonunun belirgin bir katılımı yoktur. Parkinson hastalığının bu yönlerini incelemek için uygun hαSyn patolojisini içeren alternatif bir model, hastalık gelişiminin bağırsak mikrobiyotasına bağlı olduğu ve belirgin bir gastrointestinal bozukluk içerdiği Thy1 promotörü, Thy1-SNCA model^37'nin kontrolü altında hαSyn'i aşırı eksprese eden transgenik fareler olabilir³⁸.

Parkinson hastalığının patofizyolojisi ile ilişkili çeşitli süreçlerin incelenmesi için yararlı olmasına rağmen, mevcut fare modeli, viral vektörlerin karşılık gelen uzamsal koordinatlarda doğru verilmesi, nöronlarda hαSyn'in seçici ekspresyonu (AAV serotipine ve vektör yapısına bağlı olarak) dahil olmak üzere dikkatle kontrol edilmesi gereken kritik adımları içerir. ve Parkinson fenotipini analiz etmeden önce uygun AAV dozu ve zamanlaması. SN'deki viral vektörlerin uygun şekilde verilmesinin analizi gereklidir, çünkü SN'nin doğru uzamsal koordinatlarının kullanılması, iğne tamamen düz olmadığında yeterli olmayabilir, bu da bazen insan gözüyle algılanamaz. Ayrıca, AAV vektörlerinin difüzyonu AAV serotip^39'a bağlıdır. Bu nedenlerle, SN alanını içeren beyin dilimlerinde GFP'nin gözlemlenmesini takiben, enjekte edilen AAV-GFP vektörlerinin doğru iletimini ve difüzyonunu kontrol eden periyodik kalite kontrollerinin yapılması gerekmektedir.

Nöronlarda hαSyn'in seçici ekspresyonu ile ilgili olarak, prensip olarak, hαSyn ekspresyonu, nöronlar için seçici bir promotör tarafından kontrol edilmek üzere veya daha kesin olarak, dopaminerjik nöronlarda genlerin seçici ekspresyonunu indüklemek için AAV vektörlerinde TH promotörünün kullanılması gibi dopaminerjik nöronlar için seçici olarak tasarlanabilir⁴⁰ . Bununla birlikte, bu strateji, aranan şey ilgi geninin aşırı ifadesi olduğunda işe yaramaz. Bu nedenle, mevcut modelde, güçlü bir promotör (aşağı akış geninin yüksek ekspresyonunu indükleyen bir promotör) ve nöronal tropizmli AAV serotiplerinin kullanılması esastır. Bu çalışmada, CBA promotörü, hαSyn'in aşırı ekspresyonunu indüklemek için güçlü bir promotör olarak kullanıldı ve viral vektör için AAV5 serotipi kullanıldı. Bu serotip daha önce fare ve sıçan nöronlarını^41,42 dönüştürmek için kullanılmıştır. Burada, sonuçlar, farelerin SN'sinde AAV5-GFP'nin verilmesinden 12 hafta sonra, yeşil floresanın hem SN hem de striatumun ipsilateral tarafında seçici olarak mevcut olduğunu göstermiştir (Şekil 1), bu da nigrostriatal yolun nöronlarının verimli transdüksiyonunu göstermektedir.

Parkinson hastalığının bu fare modelinin bir diğer kritik yönü, ameliyattan sonra belirli bir süreci analiz etmek için gereken zaman noktasıdır. Bu bağlamda, bu çalışma patolojide yer alan farklı süreçlerin kinetik bir çalışmasını göstermektedir. Anahtar zaman noktaları, fare başına verilen viral genomların dozu, kullanılan AAV'nin serotipi veya hatta kullanılan AAV partisi ile değiştiğinden, ilk önce TH+ nöronlarında ve motor bozulmada önemli bir kayba neden olmak için gereken AAV-αSyn miktarının doz-yanıt analizi yapılmıştır. Önceki çalışmalar, farelerde 12 haftalık AAV-αSyn enjeksiyonlarından sonra^{, fare başına} 6 x 10 ^8-3 x 10 10 10^{viral genom} 16,17,30,31 arasında değişen dozlarda önemli motor bozulma ve nigrostriatal yolun TH+ nöronlarının kaybını ^{göstermiştir.} Buna göre, nigrostriatal yolakta hαSyn ekspresyonunu, TH⁺ nöronlarının kaybını ve farelerde motor bozulmayı indüklemek için kullanılan AAV-hαSyn dozu, fare başına 1 x 10^8-1 x 10¹⁰ viral genom arasında değişmiştir. Ayrıca, TH⁺ nöronlarının kaybının ve motor bozukluğun, SN nöronlarının AAV enfeksiyonu ile değil, SN'deki hαSyn'in aşırı ekspresyonuyla indüklendiğini kontrol etmek için, farelerin SN'sinde tek taraflı olarak bir muhabir gen (AAV-eGFP) için AAV kodlamasının verildiği kontrol grupları dahil edildi ve nörodejenerasyon ve motor bozukluk belirlendi. Sonuçlar, stereotaksik cerrahiden 12 hafta sonra, fare başına 1 x^{10 10} viral genomun uygun bir AAV5-hαSyn dozu olduğunu gösterdi, çünkü bu viral yükü alan fareler nigrostriatal yolda önemli hαSyn (Şekil 2 ve Şekil 3), TH+ nöronlarının kaybı (Şekil 4) ve motor bozukluk (Şekil 5) gösterdi. Buna karşılık, daha düşük AAV5-hαSyn dozları (fare başına 1 x 10⁸ viral genom ve fare başına 1 x 10⁹ viral genom), tüm bu parametrelerde birlikte önemli değişikliklere ulaşacak kadar güçlü değildi (Şekil 2-4). Not olarak, AAV-GFP'nin fare başına 1 x 10 10 viral genomda uygulanması, düşük (~%²⁰), ancak nigral dopaminerjik nöronların TH⁺ nöronlarının önemli derecede kaybına neden olmuştur (Şekil 4A, B). Bu sonuç, bu model^41'i kullanan önceki gözlemlerle aynı fikirdedir ve muhtemelen SN'de AAV vektörlerinin uygulanmasıyla indüklenen düşük bir nöroinflamasyon seviyesinin sonucudur. Bununla birlikte, TH⁺ nöronlarının kaybının derecesi, AAV5-hαSyn alan farelerde, aynı dozda AAV-GFP alanlara kıyasla anlamlı derecede daha yüksekti (Şekil 4C). Not olarak, hαSyn ekspresyonunun kinetiği sadece transdüksiyonun verimliliğine değil, aynı zamanda AAV difüzyonunun derecesine de bağlıdır³⁹. AAV difüzyonu AAV serotipine bağlı olduğundan, bu hayvan modelindeki kesin anahtar zaman noktaları, AAV5'ten farklı başka bir AAV serotipi kullanıldığında değişebilir.

Daha sonra, bu fare modelindeki kilit zaman noktalarını belirlemek için fare başına 1 x 10¹⁰ viral genom kullanılarak kinetik bir analiz yapıldı. Mevcut kanıtlar, Parkinson hastalığının^erken teşhisine izin verecek olan motor bozukluktan önce ortaya çıkan bazı erken semptomları gösterdiğinden^{, bu} deneyler hαSyn ekspresyonunun zaten belirgin olduğu ancak motor bozukluğun yokluğunda zaman noktasını bulmaya çalıştı. Sonuçlar, SN'deki hαSyn ekspresyonunun başlangıcının, AAV-hαSyn'in stereotaksik dağıtımından 5 hafta sonra olduğunu göstermektedir (Şekil 6). Bu zaman noktası, nöroinflamatuar ve nörodejeneratif süreçleri durdurmak için uyarlanmış tedavileri uygulamaya başlamak için ilginç bir zamansal nokta oluşturur. Burada belirlenen diğer önemli zaman noktaları, nöroinflamasyon süreciyle ilişkili iki kritik olayın en yoğun zamanlarıydı: mikroglia'nın maksimum aktivasyon derecesine ulaştığı zaman ve SN'ye maksimum T hücresi infiltrasyon zamanı. Sonuçlar, ilki ameliyattan 10 hafta sonra ve ikincisi ameliyattan 15 hafta sonra olmak üzere iki maksimum mikroglial aktivasyon dalgasına ulaşan bir eğilime sahip bir eğri gösterdi (Şekil 7). T-hücresi infiltrasyonunun kinetik analizi, stereotaksik cerrahiden 11 hafta sonra SN'ye Treg infiltrasyonunun en yüksek zamanını göstermiştir (Şekil 8). Şaşırtıcı bir şekilde, analiz edilen zaman diliminde (ameliyattan 8-13. haftalar) SN'ye sızan hiçbir efektör T hücresi (CD4 ⁺ Foxp3^-) tespit edilmedi. Toplamda, bu sonuçlar, nöroinflamasyon sürecini durdurmaya ve ameliyattan sonraki 5. hafta (hαSyn aşırı ekspresyonunun başlangıcı) ile ameliyattan sonraki 10. hafta (nöroinflamasyon ve T hücresi infiltrasyonunun ilk dalgası) arasında değişen bu klinik öncesi modeli kullanarak SN'ye T hücresi infiltrasyonunu azaltmaya yönelik tedavileri uygulamaya başlamak için uygun bir zaman dilimi önermektedir (Şekil 9).

Şekil 9: Bu hayvan modeli için bulunan önemli zaman noktalarının özeti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS AND ANIMAL FOOD
Foxp3-GFP C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock No: 023800
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Wild-type C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)	Stock No: 000664
VIRAL VECTORS
AAV5-CBA-αSyn	University of Iowa Viral Vector Core Facility	N/A	Stock concentration at 10E13 vg/mL
AAV5-CBA-eGFP	University of Iowa Viral Vector Core Facility	N/A	Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg/mL
ANESTHETICS AND ANALGESICS
Isoflurane	Baxter	218082	1% for stereotaxic surgery
Ketamine	Drag Pharma	CHE30	70 mg/Kg  for stereotaxic surgery
Sevoflurane	Baxter	VE2L9117	For before transcardial perfusion
Tramadol	Drag Pharma	DPH134	30 mg/Kg every 24 h
Xylazine	Centrovet	EHL40	9 mg/kg for stereotaxic surgery
EQUIPMENT
Beam test	Home made	N/A	horizontal beam 25 cm length and 3 cm width. The beam surface was covered by a metallic grid (1 cm2).
Cryostate	Leica	CM1520
Digital camera	Nikon	S2800 Coolpix	For recording the beam test performance
Microscope	Olympus	BX51	Used for IHC analysis (section 4.4)
Microscope	Olympus	IX71	Used for IF analysis (section 5.3)
Microscope	Leica	DMI8	Used for IF analysis (section 5.7)
New Standard Stereotaxic, mouse	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51500	stereotaxic frame for surgery
Peristaltic Pump	Masterflex	C-flex L/S16
Power supply unit	Olympus	U-RFL-T	Used for IF analysis (section 5.3)
Surgical suture	Sylkam®, B Braun	C0760171
Syringe 100 U	BD	324918	For anesthesia before transcardial perfusion, 29G needle
Syringe RN 5uL SYR W/O NEEDLE	Hamilton	HA-7641-01	For viral vector innoculation
BUFFERS AND REAGENTS
Aviden, Peroxidase Conjugate	Merck, Darmstadt, Germany	189728
Bovine Serum Albumin	Merck, Darmstadt, Germany	9048-46-8
Cryotrotection buffer	Home made	N/A	20% glycerine and 2% DMSO in PBS
DAPI	Abcam	ab228549
Diaminobenzidine	Merck, Darmstadt, Germany	D8001
Fluoromount -G T	Electron Microscopy Science	17984-25
Gelatin	Merck, Darmstadt, Germany	104078
Normal goat serum	Jackson ImmunoResearch Laboratory	5000121
Paraformaldehyde	Merck, Darmstadt, Germany	104005
PBS	Home made	N/A	0.125 M, pH 7.4
Peroxidase inactivating buffer	Home made	N/A	0.03% H2O2 in methanol
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5
Trizma Hydrochloride	Merck, Darmstadt, Germany	1185-53-1
Tween 20	Sigma-Aldrich	822184
ANTIBODIES
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratory	111065003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L)  Alexa Fluor 546	ThermoFisher Scientific	A11010
Goat anti-Rabbit IgG (H+L)  Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A21244
Goat anti-Rat IgG (H+L)  Alexa Fluor 546	ThermoFisher Scientific	A11081
Rabbit monoclonal anti-alpha-Synuclein	Abcam	ab138501
Rabbit monoclonal anti-Iba-1	Abcam	EPR16588
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Millipore	AB152
Rat monoclonal anti-CD4	Biolegend	100402
SOFTWARES
GraphPad	Prism	6.0	Fos stats analysis
ImageJ	National Institute of Health	N/A	For image analysis
LAS X	Leica	N/A	For image capture with Leica microscope
ProgRes Capture Pro	Jenoptik	N/A	For image capture with Olympus microscope
VLC media player	VideoLAN Organization	N/A	For analysis of behavioural tests