Sosyal İzolasyon Modeli: Noninvaziv Bir Kemirgen Stres ve Anksiyete Modeli

Özet

Burada, minimal kullanımla ve invaziv prosedürler olmadan stres ve anksiyete benzeri davranışları indüklemek için vahşi tip C56BL / 6J fareleri kullanan sosyal izolasyon (SI) kaynaklı bir anksiyete fare modeli sunulmaktadır. Bu model, sosyal izolasyonun modern yaşam kalıplarını yansıtır ve anksiyete ve ilgili bozuklukları incelemek için idealdir.

Özet

Anksiyete bozuklukları, Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) engelliliğin önde gelen nedenlerinden biridir. Mevcut tedaviler her zaman etkili değildir ve hastaların% 50'sinden azı tam remisyon elde eder. Yeni bir anksiyolitik geliştirmede kritik bir adım, patolojik değişiklikleri incelemek ve ilaç hedeflerini, etkinliğini ve güvenliğini test etmek için fareler gibi bir hayvan modeli geliştirmek ve kullanmaktır. Mevcut yaklaşımlar arasında genetik manipülasyon, anksiyete indükleyici moleküllerin kronik uygulaması veya çevresel stresin uygulanması yer almaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemler, günlük yaşam boyunca indüklenen kaygıyı gerçekçi bir şekilde yansıtmayabilir. Bu protokol, modern yaşamdaki kasıtlı veya kasıtsız sosyal izolasyon kalıplarını taklit eden yeni bir anksiyete modelini tanımlamaktadır. Sosyal izolasyona bağlı anksiyete modeli, algılanan dikkat dağıtıcı unsurları ve istilacılığı en aza indirir ve vahşi tip C57BL / 6 fareleri kullanır. Bu protokolde, 6 ila 8 haftalık fareler (erkek ve dişi), komşu fareler gibi dış ortamı 4 hafta boyunca görsel olarak bloke etmek için opak kafeslerde tek başına barındırılır. Hiçbir çevresel zenginleştirme (oyuncak gibi) sağlanmaz, yatak malzemesi% 50 oranında azaltılır, herhangi bir ilaç tedavisi agar formu olarak uygulanır ve farelerin maruz kalması / taşınması en aza indirilir. Bu protokol kullanılarak üretilen sosyal olarak izole edilmiş fareler, daha fazla kaygı benzeri davranış, saldırganlık ve azalmış biliş sergiler.

Giriş

Anksiyete bozuklukları, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki (ABD) zihinsel hastalıkların en büyük sınıfını ve yükünü temsil eder ve ilgili yıllık maliyetler 42 milyar ABD Doları ^1,2,3'ü aşmaktadır. Son yıllarda, anksiyete ve stres, intihar ve intihar düşüncesinin yaygınlığını %16'nın üzerinde ^{artırmıştır4}. Kronik hastalıkları olan hastalar, zihinsel sıkıntının istenmeyen ikincil etkilerine veya bilişsel işlevlerde azalmaya karşı özellikle savunmasızdır⁵. Anksiyete için mevcut tedaviler psikoterapi, ilaçlar veya her ikisinin bir kombinasyonunu içerir⁶. Bununla birlikte, bu krize rağmen, hastaların% 50'sinden azı tam remisyon^{elde etmektedir 6,7}. Benzodiazepinler (BZ'ler) ve seçici serotonin geri alım inhibitörleri (SSRI'lar) gibi anksiyolitik ilaçların önemli dezavantajları vardır veya çok az veya hiç acil etki üretmez⁸. Dahası, geliştirilmekte olan yeni anksiyolitik ilaçların göreceli bir kıtlığı vardır ve ilaç geliştirmenin maliyetli ve zaman alıcı süreci ^9,10 ile karşı karşıya kalmaktadır.

İlaç geliştirme sürecindeki kritik bir adım, patolojik değişiklikleri incelemek ve ilaç güvenliğini ve etkinliğini test etmek için fareler gibi bir hayvan modelinin kurulması ve kullanılmasıdır¹¹. Anksiyete hayvan modellerinin oluşturulmasına yönelik mevcut yaklaşımlar arasında 1) serotonin reseptörlerini (5-HT1A) veya γ-aminobütirik asit A reseptörünü (_{GABA A}R) α alt birimlerini nakavt etmek gibi genetik manipülasyon¹²; 2) kortikosteron veya lipopolisakkaritler (LPS) gibi anksiyete indükleyicileri kronik olarak ^{uygulamak13,14}; veya 3) sosyal yenilgi ve annelerin ayrılması da dahil olmak üzere çevresel stresi yönetmek¹⁵. Bununla birlikte, bu yöntemler, günlük yaşam boyunca indüklenen kaygıyı gerçekçi bir şekilde yansıtmayabilir ve bu nedenle altta yatan mekanizmayı araştırmak veya yeni ilaçları test etmek için uygun olmayabilir.

İnsanlar gibi, fareler ve sıçanlar da son derece sosyal yaratıklardır^16,17,18. Sosyal temas ve sosyal etkileşimler optimal beyin sağlığı için gereklidir ve yetiştirme döneminde uygun nörogelişim için kritik^{öneme sahiptir 19}. Bu nedenle, yetiştirme döneminde annenin ayrılması veya sosyal izolasyon, daha fazla kaygı, depresyon ve nörotransmisyondaki değişiklikleri gösteren farelerle sonuçlanır²⁰. Dahası, sosyal tımar veya allogrooming, birlikte yaşayan fareler ve sıçanlar arasında yaygın bir bağlanma veya rahatlatıcı davranış biçimidir²¹. Bu nedenle, sosyalleşme kemirgen yaşamının ayrılmaz bir parçasıdır ve izolasyon sağlıklarını olumsuz yönde etkiler.

Bu bağlamda, mevcut protokol, modern yaşamdaki kasıtlı veya kasıtsız sosyal izolasyon kalıplarını taklit etmek için yeni bir kaygı modeli tanımlamaktadır. Bu sosyal izolasyon (SI) modeli, algılanan dikkat dağıtıcı unsurları ve istilacılığı en aza indirir ve yetişkin vahşi tip C57BL / 6 fareleri ve Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını kullanır. Burada sunulan protokol, sosyal izolasyonun bir sonucu olarak artan anksiyete benzeri davranış, saldırganlık, azalmış biliş ve artmış nöroinflamasyon gösteren yayınlanmış kanıtlarımıza dayanan anksiyete fareleri modeline odaklanmaktadır^22,23,24. Anksiyete benzeri davranış, yükseltilmiş artı labirent (EPM) ve açık alan (OF) testleri ile doğrulanırken, bilişsel işlev yeni nesne tanıma (NOR) ve yeni bağlam tanıma (NCR) testleri ile ölçülür. Bu model, anksiyete ve ilgili bozuklukları araştırmak için yararlıdır, ancak hafif bilişsel bozukluğun doğal ilerlemesini ve gelişimini ve strese bağlı metabolik değişiklikleri incelemek için uyarlanabilir veya değiştirilebilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Güney Kaliforniya Üniversitesi (USC) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilir ve tüm yöntemler ilgili yönergelere, düzenlemelere ve tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirilir.

1. Hayvanlar

1. Çalışma için uygun hayvan bakım komitelerinden onay alın.
2. Vivaryumu, sırasıyla 24 ± 2 °C ve% 50 -% 60 arasında kontrollü sıcaklık ve nem ile karanlık ışık 12 saatlik bir döngüye ayarlayın.
3. 6-8 haftalık erkek ve / veya dişi vahşi tip C57BL / 6 fareleri elde edin. Hayvanları cinsiyete göre sınıflandırdıktan sonra, rastgele aşağıdaki gruplardan birine atayın: 1) araç tedavisi ile grup evi; 2) ilaç tedavisi ile grup evi; 3) araç tedavisi ile sosyal izolasyon; veya 4) ilaç tedavisi ile sosyal izolasyon. Cinsiyet başına grup başına en az dört fareyi hedefleyin (ideal olarak grup başına altı fare).
4. Farelerin varışında, onları en az 24 saat boyunca vivaryuma alıştırın. Fareler tek başına evde gelmelidir.

2. Kafes kurulumu

1. Sosyal izolasyon hayvanları için, standart bir fare kafesi (2 zemin alanında 75) alın ve yatak miktarının yarısını ve yuvalama için^{1'de 2} parça pamuk (veya eşdeğeri) ekleyin.
2. Kafeslerin dış duvarlarını opak, siyah plastik torbalara (veya eşdeğeri) sarın ve bant kullanarak sabitleyin. Farelerin dış ortamı veya çevredeki hayvanları göremediğinden emin olun.
   1. Fareler komşu hayvanları içlerinden göremedikleri sürece, kafesin üst ve alt kısımlarını ambalajsız bırakın.
   2. Sarma yaparken, çantanın hiçbir bölümüne kafesin içinden erişilemediğinden emin olun. Bu, hayvanın torbayı parçalamasını önlemek içindir.
   3. Oyuncaklar veya koşu tekerlekleri gibi herhangi bir çevresel zenginleştirme biçimi eklemeyin.
3. Fareleri hazırlanan kafeslere dikkatlice ve nazikçe yerleştirin. Yiyecek ve su ad libitum sağlayın.
4. Normal kafesleme koşulları altında iki veya üç kişilik gruplar halinde ev kontrol fareleri (yani, standart bir fare kafesinde [2 kat alanında 75], tam miktarda yatak, yuvalama için 2'de² parça pamuk veya eşdeğeri ve opak torbaların sarılmaması durumunda).
   1. Grup barındırılan farelerin birbirleriyle uyumlu olduğundan emin olun (yani, aralarında kavga / çatışma yoktur). Çakışma meydana gelirse, saldırganı kaldırın ve analizden hariç tutun.
   2. Erkek ve dişi fareleri ayırın ve koku alma yetenekleri nedeniyle dişi farelerin endokrin seviye değişikliklerini etkileme olasılığını önlemek için erkekler ve dişiler arasındaki mesafeyi koruyun.

3. Sosyal izolasyon döneminde bakım ve tedavi

1. Sosyal izolasyon döneminde fareleri mümkün olduğunca az rahatsız edin. Kafes değişiklikleri ve tedavi uygulaması gibi herhangi bir prosedürü ve aktiviteyi, aktif dönemlerinde (yani karanlık döngü sırasında) ve minimum gürültü rahatsızlıkları altında gerçekleştirin.
2. Kafesleri karanlık döngü sırasında haftada sadece bir kez değiştirin. Aynı plastik torba, önemli bir hasar olmadığı sürece çıkarılabilir ve yeni kafeslere yeniden sarılabilir.
   1. Kontrol (grup barındırılan) fareler için, karanlık döngü sırasında kafesleri haftada iki kez veya daha fazla değiştirin.
3. Farelerin en az 1 hafta dayanacak kadar bol su ve yiyeceğe sahip olduklarından emin olun.
4. En iyi sonuçları görmek için fareleri en az 4 hafta boyunca izole etmeye (veya grup muhafazasına) devam edin.

4. Agar ilacı/tedavisi hazırlığı-noninvaziv ilaç tedavisi

1. Tedaviye (örneğin, araştırılan ilaçlar) dahil edilirse, ideal olarak agar formlarını kullanarak tedaviyi mümkün olduğunca az işlemle uygulayın. Enjeksiyon ve oral gavage gibi yollar, fareler üzerinde kafa karıştırıcı bir endişe faktörü haline gelebilecek ek strese neden olur.
2. Kullanılan ilacın doğasına göre tedavinin zamanlamasını ve sıklığını ayarlayın.
   NOT: Bu çalışmada tedavi olarak 2 mg/kg dihidromisisetin (DHM, [(2R,3R)-3,5,7-trihidroksi-2-(3,4,5-trihidroksifenil)-2,3-dihidrokrom-4-bir]) kullanılmıştır. DHM, izolasyon (veya grup evi) döneminin son 2 haftasının karanlık fazında günlük, tek bir dozda uygulandı.
3. Tedaviyi hazırlamak için, deiyonize (DI) suya% 3 (w / v) agar ekleyin ve çözünmesi için ~ 90 ° C'ye ısıtın. Çözüm kabarcık olacak. Dökülmeyi veya kaynamayı önleyin.
   NOT: Çözeltiyi bir cam şişede kısa, 10 saniyelik mikrodalgalama aralıklarıyla ısıtın.
   DİKKAT: Züccaciye sıcak olacaktır. Çözeltiyi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin.
4. Çözeltiyi döndürün ve görsel olarak homojen bir çözelti sağlayın.
   NOT: Çözelti yarı saydam ve renklendirmede açık sarı ila açık kahverengi olmalıdır.
5. Çözelti hala sıcakken,% 5 (w / v) sakkaroz ve istenen tedavi dozunu ekleyin. Sadece sakkaroz ekleyin ve araç kontrolüne ilgi çekici muameleyi eklemeyin.
6. Çözeltiyi döndürün ve görsel olarak homojen bir çözelti sağlayın. Ardından, çözeltiyi bir kalıba dökün ve katılaşması için oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Tedavi ışığa duyarlıysa, ışıktan koruduğunuzdan emin olun.
   NOT: Çözelti hafif viskoz olmalıdır.
7. Katılaştıktan sonra, agar'ı 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm'lik küpler halinde kesin ve uygulamaya kadar 4 ° C'de saklayın.
8. Tedaviyi uygulamak için, küçük bir tartı teknesine tek bir küp yerleştirin. Açık-karanlık döngüsünün karanlık aşamasında, agar ağırlıklı tekneyi fareye dokunmadan sessizce ve dikkatlice ayrı kafeslere yerleştirin. Farenin agar'ı tüketmesine izin verin.
   NOT: Fareler agar'ı tamamen tüketmek için tipik olarak 15-45 dakika harcarlar.
9. Agarın tam tüketimini onaylayın ve ardından tartım teknesini kafesten dikkatlice çıkarın. Gerektiğinde tekrarlayın.
10. Taze tutmak ve herhangi bir kontaminasyonu önlemek için haftalık olarak agar küpleri hazırlayın.

5. Davranış analizi

1. 4 haftalık (veya daha fazla) izolasyon süresinin son gününden 24 saat sonra davranış testleri yapın. Karanlık aşamada dolaylı kırmızı ışık altında testler yapın ve bir video kamera ile kayıt yapın.
2. Önyargı ve hatayı en aza indirmek için el ile çevrimdışı puanlamayı çift kör bir şekilde yürütmek üzere en az üç kişiyi ayarlayın.
3. Yükseltilmiş artı labirent (EPM)
   1. EPM aparatını hazırlayın. Bu protokolde kullanılan aparat ticari olarak elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu) ve iki açık kollu opak plastikten ve iki kapalı kollu (her biri 33 cm x 5 cm, kapalı kollara dik açık kollar) 5 cm x 5 cm'lik bir merkez platforma sahiptir. Aparatı zeminden 50 cm yükseğe kaldırın.
   2. Hayvanı aparatın ortasına, açık bir kola bakacak şekilde yerleştirin. Hayvanın 5 dakika boyunca keşfetmesine izin verin ve bir video kamera kullanarak etkinliklerini kaydedin.
      1. Her hayvandan sonra tüm yüzeyleri dezenfektan (% 70 etil alkol) ile iyice silerek aparatı temizleyin. Tüm kemirgen dışkılarının silindiğinden emin olun.
   3. Farelerin davranışlarını, açık kollarda, kapalı kollarda ve kronometre kullanarak merkez platformda geçirilen zamana göre çevrimdışı olarak puanlayın. Kronometreyi, fare ilgili kola veya platforma en az üç pençe yerleştirdiğinde başlatın.
4. Açık alan (OF) testi
   1. OF aparatını hazırlayın. Bu protokolde kullanılan aparat (bakınız Malzeme Tablosu) 50 cm x 50 cm x 38 cm (uzunluk x genişlik x yükseklik) ölçülerinde opak plastikten yapılmıştır.
   2. Toplam 25 ızgara için alana kare ızgaralar (her biri 10 cm x 10 cm) çizin.
   3. Hayvanı tarlanın ortasına yerleştirin ve 10 dakika boyunca keşfetmeye izin verin. Etkinliklerini bir video kameraya kaydedin.
      1. Her hayvandan sonra tüm yüzeyi dezenfektan (% 70 etil alkol) ile iyice silerek aparatı temizleyin. Tüm kemirgen dışkılarının silindiğinden emin olun.
   4. Merkezi bölgede geçirilen süreye, köşelerde geçirilen süreye, kat edilen toplam mesafeye ve farenin kaç kez yetiştirildiğine bağlı olarak farelerin davranışını çevrimdışı olarak puanlayın.
      1. Ortada veya köşede geçirilen süreyi kaydetmek için bir kronometre kullanın. Kronometreyi, fare ilgili alana en az üç pençe yerleştirdiğinde başlatın.
      2. Kat edilen mesafeyi ve yetiştirme sıklığını kaydetmek için bir sayaç kullanın. Farenin girdiği kare sayısını sayın (fare kareye en az üç pençe yerleştirdiğinde). Fare arka pençelerinde açıkça ayağa kalktığında yetiştirmeyi sayın. Fare ayağa kalktığında ve duvarlara yaslandığında veya damada karşı durduğunda saymayın.
5. Yeni nesne tanıma (NOR) testi
   1. Bu testi 3 gün boyunca gerçekleştirin. 1. günde, 50 cm x 50 cm x 38 cm'lik (uzunluk x genişlik x yükseklik) bir açık alan aparatı hazırlayın. Hayvanı açık alanın ortasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca tanıdık gelmeye bırakın. Sonra hayvanı tekrar ev kafesine yerleştirin.
      1. Her hayvandan sonra tüm yüzeyleri dezenfektan (% 70 etil alkol) ile iyice silerek aparatı temizleyin. Tüm kemirgen dışkılarının silindiğinden emin olun.
   2. 2. günde, aynı açık alan aparatını hazırlayın ve küçük bir küp gibi iki özdeş nesneyi yerleştirin. Onları yaklaşık 20 cm arayla simetrik olarak yerleştirin. Hayvanı aparatın ortasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca keşfetmeye bırakın. Sonra hayvanı tekrar ev kafesine yerleştirin.
      1. Her hayvandan sonra tüm yüzeyleri dezenfektan (% 70 etil alkol) ile iyice silerek aparatı temizleyin. Tüm kemirgen dışkılarının silindiğinden emin olun.
   3. 3. günde, aynı açık alan aparatını ve tanıdık nesne olarak işlev görecek olan 2. günden itibaren nesnelerden birini (yani, küçük küp) hazırlayın. Ahşap piramit gibi birbirine benzemeyen başka bir yeni nesneyi, tanıdık nesneden yaklaşık 20 cm uzakta simetrik olarak yerleştirin. Hayvanın 3 dakika boyunca keşfetmesine izin verin ve etkinliklerini bir video kameraya kaydedin.
      1. Her hayvandan sonra tüm yüzeyleri dezenfektan (% 70 etil alkol) ile iyice silerek aparatı temizleyin. Tüm kemirgen dışkılarının silindiğinden emin olun.
   4. Farelerin davranışlarını, tanıdık nesneyi ve yeni nesneyi keşfetmek için harcanan zamana göre çevrimdışı olarak puanlayın. Nesne tanıma indeksini (ORI%) hesaplayın, burada ; t_f ve t_n, sırasıyla tanıdık ve yeni nesneleri keşfetme zamanlarını temsil eder.
6. Yeni bağlam tanıma (NCR) testi
   1. Bu testi 2 gün boyunca gerçekleştirin. Farklı şekilli iki açık alan ve iki çift belirgin şekilli nesne hazırlayın. OF aparatı bağlamlardan biri olarak kullanılabilir (açık alan). Diğer bağlam benzer boyutta ancak yuvarlak açık alan gibi farklı şekillerde olmalıdır.
   2. 1. günde, kare bağlamda bir çift özdeş nesne (yani iki küp) ve diğer özdeş nesne çiftini (yani iki piramit) yuvarlak bağlama yerleştirin. Nesneler 15-20 cm aralıklarla simetrik olarak yerleştirilmelidir.
   3. Hayvanı merkeze yerleştirin ve bir bağlamda 5 dakika boyunca keşfetmeye izin verin. Diğer bağlamda tekrarlayın. Ardından, hayvanı tekrar ev kafesine yerleştirin.
      1. Her hayvandan sonra tüm yüzeyleri dezenfektan (% 70 etil alkol) ile iyice silerek aparatı temizleyin. Tüm kemirgen dışkılarının silindiğinden emin olun.
   4. 2. günde, nesnelerden birini bir bağlamdan diğeriyle değiştirin (yani, kare bağlamda bir küp ve bir piramit ve yuvarlak bağlamda bir küp ve bir piramit yerleştirin).
   5. Hayvanı merkeze yerleştirin ve 3 dakika boyunca keşfetmeye izin verin. Etkinliklerini bir video kameraya kaydedin. Hayvanların her iki bağlamda da kaydedilmesine gerek yoktur.
      1. Her hayvandan sonra tüm yüzeyleri dezenfektan (% 70 etil alkol) ile iyice silerek aparatı temizleyin. Tüm kemirgen dışkılarının silindiğinden emin olun.
   6. Farklı nesneleri keşfetmek için harcanan zamana bağlı olarak farelerin davranışını çevrimdışı olarak puanlayın. Tanıma indeksini (RI), yeni "bağlam dışı" nesneyi (yani, kare bağlamdaki piramit) tanıdık "bağlam içi" nesneye (yani, kare bağlamdaki küp) araştırmak için harcanan zamanın oranı olarak hesaplayın. .

Sonuçlar

Tüm temsili sonuçlar ve rakamlar son yayınlarımızdan^22,23 oranında değiştirilmiştir. Sosyal izolasyonun anksiyete ve keşif davranışı üzerindeki etkilerini değerlendirmek amacıyla 4 haftalık sosyal izolasyon süresinin bitiş tarihini takip eden 24 saat sonra EPM ve OF testleri yapıldı. Sosyal olarak izole edilmiş fareler, kontrole (2.31 ± 0.27 dakika) kıyasla açık kolda anlamlı derecede daha az zaman (1.28 ± 0.17 dakika) ve kapalı kolda...

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar, sosyal izolasyon kafeslerinin düzgün bir şekilde kurulmasını (yani, opak torbaların sarılması ve yatak miktarının azaltılması), izolasyon süresi boyunca farelerin elleçlenmesini ve rahatsız edilmesini en aza indirmeyi ve farelerin agar'ı tamamen ilaçla elde etmelerini ve tüketmelerini sağlamayı içerir. Vivaryum veya mahfaza durumunun sabit bir sıcaklık ve nemde tutulmasının yanı sıra en aza indirilmiş dış parazitlerin korunması çok önemlidir. Gürül...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black Plastic Bags	Office Depot	791932	24" x 32"
Elevated Plus Maze	SD Instruments	NA	Black color
Open Field enclosure	SD Instruments	NA	White color
Select Agar	Invitrogen	30391-023
Square cotton for nesting (nestlet)	Ancare Corporation	NC9365966	Divide a 2" square piece into 4 pieces to create a 1" square piece for isolation group
Sucrose	Sigma	S1888-1KG
Weigh boat	SIgma	HS1420A	Small, square white polystyrene