Pseudomonas aeruginosa Tarafından Üretilen Mono-Ramnolipidlerin ve Di-Ramnolipidlerin Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

Özet

Pseudomonas aeruginosa, ramnolipid biyoyüzey aktif maddelerini üretir. İnce tabaka kromatografisi, her bir suş tarafından üretilen mono- ve di-ramnolipidlerin oranını tespit eder ve belirler. Toplam ramnolipidlerin miktar tayini, orsinol yöntemi kullanılarak kültür süpernatanlarından ekstrakte edilen bu biyoyüzey aktif maddelerde bulunan ramnoz eşdeğerlerinin değerlendirilmesini içerir.

Özet

Çevresel bakteri Pseudomonas aeruginosa, sağlık açısından tehlike oluşturan yüksek antibiyotik direncine sahip fırsatçı bir patojendir. Bu bakteri, önemli biyoteknolojik değere sahip moleküller olan ancak aynı zamanda virülans özellikleriyle ilişkili olan ramnolipidler (RL) olarak bilinen yüksek düzeyde biyoyüzey aktif maddeler üretir. Bu bağlamda, RL'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi hem biyoteknoloji uygulamaları hem de biyomedikal araştırma projeleri için yararlı olabilir. Bu makalede, ince tabaka kromatografisi (TLC) kullanılarak P. aeruginosa tarafından üretilen iki RL formunun üretimini tespit etme tekniğini adım adım gösteriyoruz: mono-ramnolipidler (mRL), bir ramnoz parçasına bağlı yağ asitlerinin (esas olarak C10-C10) bir dimerinden oluşan moleküller ve di-ramnolipidler (dRL), iki ramnoz parçasına bağlı benzer bir yağ asidi dimerinden oluşan moleküller. Ek olarak, bir P. aeruginosa kültür süpernatantından ekstrakte edilen bu biyoyüzey aktif maddelerin asit hidrolizine ve ardından orsinol ile reaksiyona giren ramnoz konsantrasyonunun tespitine dayalı olarak toplam RL miktarını ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Her iki tekniğin kombinasyonu, burada PAO1 (filogrup 1), PA14 (filogrup 2) ve PA7 (filogrup 3) tip suşları ile örneklendiği gibi, belirli bir suş tarafından üretilen mRL ve dRL'nin yaklaşık konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilir.

Giriş

Pseudomonas aeruginosa, virülansla ilişkili özelliklerin üretilmesi ve yüksek antibiyotik direnci ^1,2 nedeniyle çevresel bir bakteri ve büyük endişe kaynağı olan fırsatçı bir patojendir. Bu bakteri tarafından üretilen karakteristik bir ikincil metabolit, redoks aktivitesine sahip bir antibiyotik olan fenazin piyosiyanin ve proteaz^{elastaz 3} gibi virülansla ilişkili çeşitli özelliklerle koordineli bir şekilde üretilen biyosürfaktan RL'dir. RL'nin tensio-aktif ve emülsifikasyon özellikleri farklı endüstriyel uygulamalarda kullanılmıştır ve şu anda ticarileşti....

Protokol

Bu prosedür Ek Şekil 1'de şematize edilmiştir. Çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. TLC kullanılarak P. aeruginosa'nın kültür süpernatantlarında mRL ve dRL'nin saptanması

1. 24 saat boyunca sıvı ortamda yetiştirilen P. aeruginosa ilgilenilen suşun santrifüjlenmiş suyu ile başlayın (RL'nin üretildiği sabit büyüme fazına ulaşmak için). Tipik olarak, bu kültürler mL başına 1 x 10⁹ bakteri içerir.
2. Konsantre HCl kullanarak kültürün pH'ını 2'ye ayarlayın.
3. 50 ....

Tartışmalar

RL'yi tespit etmek ve ölçmek için en doğru yöntem, kütle spektrometresi (MS) ile birleştirilmiş HPLC'dir7,8,27; Bununla birlikte, birçok araştırmacı tarafından erişilemeyebilecek özel ve pahalı ekipman gerektirir. Burada açıklanan yöntemler, RL konsantrasyonlarını tespit etmek ve tahmin etmek için temel laboratuvar malzemeleri ve ekipmanları ile rutin olarak gerçekleştirilebilir, ancak özellikle mRL ve .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C