Обнаружение и количественное определение моно-рамнолипидов и ди-рамнолипидов, продуцируемых Pseudomonas aeruginosa

Резюме

Pseudomonas aeruginosa продуцирует рамнолипидные биоповерхностно-активные вещества. Тонкослойная хроматография обнаруживает и определяет долю моно- и дирамнолипидов, продуцируемых каждым штаммом. Количественное определение общего количества рамнолипидов включает в себя оценку эквивалентов рамнозы, присутствующих в этих биосурфактантах, экстрагированных из надосадочной жидкости культур с использованием метода орцинола.

Аннотация

Экологическая бактерия Pseudomonas aeruginosa является условно-патогенным микроорганизмом с высокой устойчивостью к антибиотикам, представляющим опасность для здоровья. Эта бактерия продуцирует высокие уровни биоповерхностно-активных веществ, известных как рамнолипиды (RL), которые представляют собой молекулы со значительной биотехнологической ценностью, но также связаны с вирулентными свойствами. В этом отношении обнаружение и количественная оценка ЛЛ могут быть полезны как для биотехнологических приложений, так и для биомедицинских исследовательских проектов. В этой статье мы пошагово демонстрируем метод детектирования продукции двух форм RL, продуцируемых P. aeruginosa с помощью тонкослойной хроматографии (TLC): монорамнолипидов (mRL), молекул, состоящих из димера жирных кислот (в основном C10-C10), связанных с одной группой рамнозы, и ди-рамнолипидов (dRL), молекул, состоящих из аналогичного димера жирных кислот, связанного с двумя группами рамнозы. Кроме того, мы представляем метод измерения общего количества RL, основанный на кислотном гидролизе этих биоповерхностно-активных веществ, экстрагированных из надосадочной жидкости культуры P. aeruginosa, и последующем обнаружении концентрации рамнозы, которая реагирует с орцином. Комбинация обоих методов может быть использована для оценки приблизительной концентрации mRL и dRL, продуцируемых конкретным штаммом, как показано здесь на примере типовых штаммов PAO1 (филогруппа 1), PA14 (филогруппа 2) и PA7 (филогруппа 3).

Введение

Pseudomonas aeruginosa является экологической бактерией и условно-патогенным микроорганизмом, вызывающим серьезную озабоченность из-за наличия у нее признаков, связанных с вирулентностью, и высокой устойчивости к антибиотикам ^1,2. Характерным вторичным метаболитом, продуцируемым этой бактерией, является биосурфактант RL, который вырабатывается скоординированным образом с несколькими признаками, связанными с вирулентностью, такими как пиоцианин феназин, антибиотик с окислительно-восстановительной активностью, и протеаза эластаза³. Тензиоактивные и эмульгирующие свойства RL были использованы в различных промышленных приложениях и в настоящее время коммерциализируются⁴.

Большинство штаммов P. aeruginosa, принадлежащих к филогруппам 1 и 2, продуцируют два типа RL: mRL, который состоит из одной группы рамнозы, связанной с димером жирных кислот, в основном состоящим из 10 атомов углерода, и dRL, который содержит дополнительную группу рамнозы, связанную с первой рамнозой⁴ (см. рис. 1). Тем не менее, сообщалось, что две второстепенные филогруппы P. aeruginosa (группы 3 и 5) продуцируют только mRL ^5,6. Эти два типа RL содержат смесь димеров жирных кислот, которые, как уже упоминалось, в основном представляют собой C10-C10, но также образуются меньшие доли молекул, содержащих димеры C12-C10, C12-C12 и C10-C12:1. ^{Сообщается о} характеристике конгенеров RL, продуцируемых различными штаммами с использованием ВЭЖХ, МС/МС ^7,8. Методы, описанные в данной работе, позволяют дифференцировать только mRL и dRL, но не могут быть использованы для характеристики родственных соединений RL.

P. aeruginosa и некоторые виды Burkholderia являются естественными продуцентами RL⁹, но первая бактерия является наиболее эффективным продуцентом. Тем не менее, коммерчески используемый RL в настоящее время продуцируется в производных Pseudomonas putida KT2440, экспрессирующих гены P. aeruginosa, чтобы избежать использования этого условно-патогенного микроорганизма^10,11. Обнаружение и количественное определение RL, продуцируемого P. aeruginosa, имеет большое значение для изучения молекулярных механизмов, участвующих в экспрессии признаков, связанных с вирулентностью12, в характеристике штаммов, принадлежащих к кладам 3 или 5,¹³, и для конструирования производных P. aeruginosa, которые в избытке продуцируют эти биоповерхностно-активные вещества, обладая при этом сниженной вирулентностью14. Производство биоповерхностно-активных веществ различными микроорганизмами было обнаружено на основе некоторых общих характеристик этих соединений, таких как метод капли коллапса или индекс эмульгирования¹⁵, но эти методы не являются ни точными, ни специфичными16.

В данной работе мы описываем протокол детектирования mRL и dRL с использованием жидкостной экстракции общего RL из супернатантов культур различных штаммов типа P. aeruginosa и разделения обоих типов RL с помощью TLC. В этом методе RL, выделенные из надосадочной жидкости культуры, разделяются по их дифференциальной растворимости в растворителях, используемых для TLC, вызывая дифференциальную миграцию на силикагелевой пластине. Таким образом, мРЛ имеют более быструю миграцию, чем дРЛ, и могут быть обнаружены как отдельные пятна при высыхании пластин и окрашивании α-нафтолом.

Описанный здесь метод выявления mRL и dRL методом TLC основан на ранее опубликованной статье¹⁷, который прост в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования. Этот метод оказался полезным для обнаружения ЛЛ в различных изолятах 13 P. aeruginosa с использованием соответствующего контроля, такого как мутант, полученный из P. aeruginosa, неспособный продуцировать РЛ. Тем не менее, это не является предпочтительным методом для характеристики новых биоповерхностно-активных веществ, продуцируемых бактериями, отличными от Pseudomonas aeruginosa, из-за их недостаточной специфичности.

Кроме того, представлен метод количественной оценки рамнозных эквивалентов общего RL, экстрагированного из надосадочной жидкости культуры P. aeruginosa . Этот метод количественно определяет эти биоповерхностно-активные вещества на основе реакции орцина с восстановительными сахарами, в результате чего получается продукт, который может быть измерен спектрофотометрически при длине волны 421 нм, как описано ранее¹⁸. Поскольку реакция с орцинолом не является специфичной для рамнозы, важно выполнять этот метод с RL, экстрагированным из надосадочной жидкости культуры, которая не содержит значительных количеств других сахарсодержащих молекул, таких как липополисахариды (ЛПС). Для жидкой экстракции RL¹⁸ здесь используется подкисленная смесь хлороформа/метанола, но также можно использовать этилацетат, а твердофазная экстракция (SPE) дает очень^{хорошие результаты.} Описанный здесь метод орцина не требует сложного оборудования и может обеспечить надежные результаты, если его применять с особой тщательностью при подготовке анализируемых образцов, как уже говорилось. Чтобы обеспечить надлежащую подготовку образца, важно включить мутант Pseudomonas aeruginosa rhlA , неспособный продуцировать RL²⁰ , и выполнить три биологические и три технические репликации для каждого определения.

В литературе^16,21 существуют значительные разногласия относительно определения RL методом орцинола, при этом некоторые исследования предполагают, что продукция RL завышена и что анализу не хватает специфичности для рамнозы, что потенциально обнаруживает другие сахара. Тем не менее, мы демонстрируем здесь, что описанные методы могут быть точными и специфичными при соответствующих условиях. Кроме того, для сравнения с процедурами, описанными в этой статье, мы используем UPLC-MS/MS обнаружение стандарта dRL и демонстрируем, что аналогичные результаты получены с помощью метода орцина. Подробный протокол количественного определения RL с использованием этого метода включен в Дополнительный файл 1.

Эти протоколы иллюстрируются типовыми штаммами PAO1 (филогруппа 1), PA14 (филогруппа 2) и PA7 (филогруппа 3). Эти штаммы были выбраны потому, что они хорошо охарактеризованы и продуцируют различные профили RL.

протокол

Эта процедура схематизирована на дополнительном рисунке 1. Реагенты и оборудование, использованные для исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Обнаружение mRL и dRL в супернатантах культуры P. aeruginosa с помощью TLC

1. Начните с центрифугированного бульона интересующего нас штамма P. aeruginosa , культивируемого в жидкой среде в течение 24 ч (чтобы достичь стационарной фазы роста, где образуется RL). Как правило, эти культуры содержат 1 х^{10 9} бактерий на мл.
2. Отрегулируйте pH культуры до 2 с помощью концентрированной HCl.
3. Поместите 5 мл подкисленной надосадочной жидкости культуры в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл и добавьте 5 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1.
4. Перемешайте трубку путем инверсии три раза, каждый раз в течение 10 с, и оставьте трубку без инверсии на 2 минуты между каждым перемешиванием.
5. Оставьте пробирку без перемешивания примерно на 3 часа, пока две фазы не разделятся, или центрифугируйте пробирку в течение 10 минут при 3 000 x g при 4 °C.
6. Перенесите органическую фазу (нижний слой) в чистую пробирку и оставьте пробирку в вытяжном колпаке до тех пор, пока не наступит сухость.
7. Повторите процесс, начиная с шага 1.3, поместив органическую фазу из второго хлороформа: экстракции метанола, в пробирку, которая использовалась при первой экстракции.
8. Выпаривайте органическую фазу до тех пор, пока не останется 1 мл или 1,5 мл. Перенесите этот объем в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и выпарите растворитель до сухости в течение ночи.
9. Добавьте 50 мкл метанола в высушенную пробирку для ресуспендирования RL.
10. Провести тонкослойную хроматографию на пластинах с силикагелем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пластины TLC должен быть разрезан в соответствии с количеством образцов, которые будут анализироваться. Каждый образец следует наносить на расстоянии 1,5 см, а точка нанесения должна находиться на расстоянии 1 см от края пластины (карандашом нарисуйте горизонтальную линию).
11. Нанесите по 5 мкл каждого образца с помощью микропипетки объемом 10 мкл.
12. Жидкая фаза TLC состоит из смеси хлороформ: метанол: уксусная кислота в соотношении 65:15:2. Чтобы приготовить 35 мл этой смеси, смешайте 26 мл хлороформа, 6 мл метанола и 0,8 мл 20% исходного раствора уксусной кислоты. Смешайте эти растворители и поместите их в закрытую камеру TLC не менее чем на 10 минут перед началом хроматографии, чтобы атмосфера насытилась летучими растворителями.
13. Поместите пластину TLC в камеру, избегая контакта с местом, где были нанесены образцы.
14. Закройте камеру и оставьте TLC до тех пор, пока растворитель не достигнет 1 см до края пластины. На этом этапе снимите пластину и дайте ей высохнуть (для ускорения процесса можно подать поток воздуха).
15. Приготовьте раствор α-нафтола, растворив 5 г этого соединения в 33 мл этанола. После растворения добавьте 127,5 мл этанола, 12,6 мл воды и 20,5 мл холодного H₂SO₄.
16. Чтобы обнаружить наличие mRL и dRL, распылите раствор α-нафтола на пластину в вытяжном шкафу и поместите распыленную пластину в духовку при температуре 85 °C на несколько минут, пока не станет заметным розоватый след от RL.
17. Используйте изображение ТСХ, чтобы рассчитать долю моно- и ди-РЛ, присутствующих в каждом образце, с помощью программного обеспечения, которое определяет плотность каждого пятна.

2. Количественная оценка общего количества RL, измерение рамнозных эквивалентов, присутствующих в биосурфактанте

1. Поместите 1,2 мл культуры в неподвижной фазе (выращенной в течение 24 ч) в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте на 3 мин при 3000 x g при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость в чистую пробирку.
2. Переложите 333 мкл в чистую пробирку (выполните этот шаг в трех экземплярах) и добавьте 1 мл эфира.
3. Энергично перемешиваем в вихре в течение 30 с. Повторяйте эту процедуру с одной трубкой за раз.
4. Центрифугируйте в течение 2 минут при 3 000 x g при 4 °C. Соберите органическую фазу (верхнюю фазу), переложите ее в чистую пробирку и оставьте открытой в вытяжке до тех пор, пока не появится сухость.
5. Повторите экстракцию эфиром, как описано в шаге 2.2. Повторите шаги 2.3 и 2.4.
6. После полного высыхания добавьте по 1 мл воды в каждую трубку. Оставьте пробирки на 12 часов, чтобы дать RL гидратироваться, затем энергично перемешивайте в вихре.
7. Поместите чистую колбу в лед на 5 минут (так как это экзотермическая реакция). Приготовьте раствор 60% Н₂СО₄ (беречь колбу от света).
8. В чистой пробирке приготовьте 1,6% раствор орцина в дистиллированной воде. Для приготовления реагента орцинола смешайте 4,4 мл 60% раствора H₂SO₄ с 0,6 мл 1,6% раствора орцинола.
9. Рассчитайте конечный объем необходимого реагента для орцинола. Добавьте 900 мкл этого реагента в каждый образец и к каждой концентрации калибровочной кривой, используя различные концентрации рамнозы (как правило, используются 9 концентраций рамнозы в диапазоне от 1 мкг/мл до 9 мкг/мл) и одну концентрацию 100 мкл воды, гарантируя, что все они выполняются в трех экземплярах.
10. Добавьте 100 мкл каждого образца RL к 900 мкл реагента орцинола в стеклянной пробирке и смешайте два раствора.
11. Выдерживать 30 мин на водяной бане, разогретой до 80 °С.
12. Дайте трубкам остыть до комнатной температуры.
13. Считывание коэффициента поглощения образцов и калибровочной кривой при длине волны 421 нм с помощью кварцевой ячейки.
14. Рассчитайте концентрацию рамнозы в каждом образце путем интерполяции поглощения на калибровочной кривой и с учетом объема, использованного для определения.
15. Чтобы рассчитать концентрацию μM, разделите полученную концентрацию в μг/мл на 182,2 (молекулярная масса рамнозы) и умножьте на 1000.

Результаты

В данной статье были использованы три различных типовых штамма P. aeruginosa для представления трех филогрупп, каждая из которых имеет различные уровни продукции RL и пропорции mRL и dRL. Эти штаммы включают PAO1 (раневой изолят из Австралии, 1955-22), PA14 (растительный изолят из США, 1977-23) и P...

Обсуждение

Наиболее точным методом обнаружения и количественного определения RL является ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией (MS)^7,8,27; Однако для этого требуется специализированное и дорогостоящее оборудование, которое может быть недоступно мн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C