Nachweis und Quantifizierung von Mono-Rhamnolipiden und Di-Rhamnolipiden, die von Pseudomonas aeruginosa produziert werden

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa produziert die Rhamnolipid-Biotenside. Die Dünnschichtchromatographie detektiert und bestimmt den Anteil der Mono- und Dirhamnolipide, die von jedem Stamm produziert werden. Die Quantifizierung der Gesamtrhamnolipide umfasst die Bewertung der Rhamnose-Äquivalente, die in diesen Biotensiden vorhanden sind, die mit Hilfe der Orcinol-Methode aus den Kulturüberständen extrahiert werden.

Zusammenfassung

Das Umweltbakterium Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer Erreger mit hoher Antibiotikaresistenz, der eine Gefahr für die Gesundheit darstellt. Dieses Bakterium produziert einen hohen Gehalt an Biotensiden, die als Rhamnolipide (RL) bekannt sind, bei denen es sich um Moleküle mit erheblichem biotechnologischem Wert handelt, die aber auch mit Virulenzmerkmalen in Verbindung gebracht werden. In dieser Hinsicht kann der Nachweis und die Quantifizierung von RL sowohl für biotechnologische Anwendungen als auch für biomedizinische Forschungsprojekte nützlich sein. In diesem Artikel demonstrieren wir Schritt für Schritt die Technik zum Nachweis der Produktion der beiden von P. aeruginosa produzierten RL-Formen mittels Dünnschichtchromatographie (DC): Mono-Rhamnolipide (mRL), Moleküle, die aus einem Dimer von Fettsäuren (hauptsächlich C10-C10) bestehen, das an eine Rhamnose-Einheit gebunden ist, und Di-Rhamnolipide (dRL), Moleküle, die aus einem ähnlichen Fettsäure-Dimer bestehen, das an zwei Rhamnose-Einheiten gebunden ist. Darüber hinaus stellen wir eine Methode zur Messung der Gesamtmenge an RL vor, die auf der sauren Hydrolyse dieser Biotenside basiert, die aus einem Überstand der P . aeruginosa-Kultur extrahiert wurden, und dem anschließenden Nachweis der Konzentration von Rhamnose, die mit Orcin reagiert. Die Kombination beider Techniken kann verwendet werden, um die ungefähre Konzentration von mRL und dRL abzuschätzen, die von einem bestimmten Stamm produziert wird, wie hier am Beispiel der Typstämme PAO1 (Phylogruppe 1), PA14 (Phylogruppe 2) und PA7 (Phylogruppe 3).

Einleitung

Pseudomonas aeruginosa ist ein Umweltbakterium und ein opportunistischer Krankheitserreger, der aufgrund seiner Produktion von Virulenz-assoziierten Merkmalen und seiner hohen Antibiotikaresistenz sehr besorgniserregend^{ist 1,2}. Ein charakteristischer Sekundärmetabolit, der von diesem Bakterium produziert wird, ist das Biotensid RL, das in koordinierter Weise mit mehreren Virulenz-assoziierten Merkmalen wie dem Phenazin Pyocyanin, einem Antibiotikum mit Redoxaktivität, und der Protease Elastase³ hergestellt wird. Die tensioaktiven und emulgierenden Eigensch....

Protokoll

Dieses Verfahren ist in der ergänzenden Abbildung 1 schematisiert. Die für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Nachweis von mRL und dRL in Kulturüberständen von P. aeruginosa mittels TLC

1. Beginnen Sie mit der zentrifugierten Brühe des interessierenden Stammes P. aeruginosa , die 24 Stunden lang in flüssigem Medium kultiviert wird (um die stationäre Wachstumsphase zu erreichen, in der RL produziert wird). Typischerweise enthalten diese Kulturen 1 x 10⁹ Bakterien pro ml.....

Diskussion

Die genaueste Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von RL ist die HPLC gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS)^7,8,27; Es erfordert jedoch spezielle und teure Geräte, die für viele Forscher möglicherweise nicht zugänglich sind. Die hier beschriebenen Methoden können routinemäßig mit grundlegenden Labormaterialien und -geräten durchgeführt werden, um RL-Konzentrationen zu ermitteln und abzuschätzen, aber sie weise.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C