Detecção e quantificação de mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios produzidos por Pseudomonas aeruginosa

Resumo

Pseudomonas aeruginosa produz os biossurfactantes ramnolipídicos. A cromatografia em camada delgada detecta e determina a proporção de mono e di-ramnolipídios produzidos por cada cepa. A quantificação de ramnolipídios totais envolve a avaliação dos equivalentes de ramnose presentes nesses biossurfactantes extraídos dos sobrenadantes de cultura usando o método do orcinol.

Resumo

A bactéria ambiental Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista com alta resistência a antibióticos que representa um risco à saúde. Essa bactéria produz altos níveis de biossurfactantes conhecidos como ramnolipídios (RL), que são moléculas com valor biotecnológico significativo, mas também estão associadas a características de virulência. A este respeito, a detecção e quantificação de RL podem ser úteis tanto para aplicações biotecnológicas quanto para projetos de pesquisa biomédica. Neste artigo, demonstramos passo a passo a técnica para detectar a produção das duas formas de RL produzidas por P. aeruginosa usando cromatografia em camada delgada (TLC): mono-ramnolipídios (mRL), moléculas constituídas por um dímero de ácidos graxos (principalmente C10-C10) ligado a uma porção ramnose, e di-ramnolipídios (dRL), moléculas constituídas por um dímero de ácido graxo semelhante ligado a duas frações ramnose. Além disso, apresentamos um método para medir a quantidade total de RL com base na hidrólise ácida desses biossurfactantes extraídos de um sobrenadante de cultura de P. aeruginosa e a subsequente detecção da concentração de ramnose que reage com o orcinol. A combinação de ambas as técnicas pode ser usada para estimar a concentração aproximada de mRL e dRL produzida por uma cepa específica, como exemplificado aqui com as cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) e PA7 (filogrupo 3).

Introdução

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria ambiental e um patógeno oportunista de grande preocupação devido à sua produção de características associadas à virulência e sua alta resistência a antibióticos ^1,2. Um metabólito secundário característico produzido por essa bactéria é o biossurfactante RL, que é produzido de forma coordenada com várias características associadas à virulência, como a fenazina piocianina, um antibiótico com atividade redox, e a protease elastase³. As propriedades tensioativas e emulsificantes do RL têm sido exploradas em diferentes aplicações industriais e atualmente são comercializadas⁴.

A maioria das cepas de P. aeruginosa, pertencentes aos filogrupos 1 e 2, produz dois tipos de RL: mRL, que consiste em uma porção de ramnose ligada a um dímero de ácido graxo principalmente de 10 carbonos, e dRL, que contém uma porção de ramnose adicional ligada à primeira ramnose⁴ (ver Figura 1). No entanto, foi relatado que dois filogrupos menores de P. aeruginosa (grupos 3 e 5) produzem apenas mRL ^5,6. Os dois tipos de RL contêm uma mistura de dímeros de ácidos graxos, que, como mencionado, são principalmente C10-C10, mas proporções menores de moléculas contendo dímeros C12-C10, C12-C12 e C10-C12:1 também são produzidas. A caracterização dos congêneres RL produzidos por diferentes cepas usando HPLC MS/MS tem sido relatada ^7,8. Os métodos descritos neste trabalho só podem diferenciar entre mRL e dRL, mas não podem ser usados para a caracterização dos congêneres RL.

P. aeruginosa e algumas espécies de Burkholderia são produtoras naturais de RL⁹, mas a primeira bactéria é a produtora mais eficiente. No entanto, o RL usado comercialmente é atualmente produzido em derivados de Pseudomonas putida KT2440 que expressam genes de P. aeruginosa para evitar o uso desse patógeno oportunista^10,11. A detecção e quantificação de RL produzidas por P. aeruginosa são de grande importância para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na expressão de características relacionadas à virulência¹², na caracterização de cepas pertencentes aos clados 3 ou 5¹³ e para a construção de derivados de P. aeruginosa que produzem esses biossurfactantes em excesso e reduzem a virulência¹⁴. A produção de biossurfactantes por diferentes microrganismos tem sido detectada com base em algumas características gerais desses compostos, como o método de queda por colapso ou índice de emulsificação¹⁵, mas esses métodos não são precisos nem específicos¹⁶.

Aqui, descrevemos o protocolo para detectar mRL e dRL usando a extração líquida de RL total dos sobrenadantes de cultura de diferentes cepas do tipo P. aeruginosa e a separação de ambos os tipos de RL usando TLC. Neste método, o RL extraído do sobrenadante de cultura é separado por sua solubilidade diferencial nos solventes usados para TLC, causando migração diferencial na placa de sílica gel. Assim, os mRL têm uma migração mais rápida do que os dRL e podem ser detectados como pontos separados quando as placas são secas e coradas com α-naftol.

O método aqui descrito para detecção de mRL e dRL por TLC é baseado em um artigo¹⁷ publicado anteriormente, que é de fácil execução e não requer equipamentos caros. Este método tem sido útil para detectar RL em vários isolados de P. aeruginosa ¹³ usando controles apropriados, como um mutante derivado de P. aeruginosa incapaz de produzir RL. No entanto, não é o método preferido para caracterizar novos biossurfactantes produzidos por bactérias diferentes de Pseudomonas aeruginosa devido à sua falta de especificidade.

Além disso, é apresentado um método para quantificar os equivalentes de ramnose do RL total extraído de um sobrenadante de cultura de P. aeruginosa . Esse método quantifica esses biossurfactantes com base na reação do orcinol com açúcares redutores, resultando em um produto que pode ser medido espectrofotometricamente a 421 nm, conforme descrito anteriormente¹⁸. Como a reação com orcinol não é específica da ramnose, é importante realizar esse método com RL extraído do sobrenadante da cultura que não contenha quantidades significativas de outras moléculas contendo açúcar, como lipopolissacarídeos (LPS). Uma mistura acidificada de clorofórmio / metanol é usada aqui para extração líquida de RL¹⁸, mas acetato de etila também pode ser usado, e a extração em fase sólida (SPE) produz resultados muito bons¹⁹. O método do orcinol aqui descrito não requer equipamentos sofisticados e pode fornecer resultados confiáveis se realizado com cuidado especial no preparo das amostras analisadas, conforme discutido. Para assegurar uma preparação adequada da amostra, é importante incluir um mutante de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapaz de produzir RL²⁰ e realizar três réplicas biológicas e três réplicas técnicas para cada determinação.

Tem havido controvérsia significativa na literatura^16,21 em relação à determinação do RL pelo método do orcinol, com alguns estudos sugerindo que a produção de RL é superestimada e que o ensaio carece de especificidade para ramnose, potencialmente detectando outros açúcares. No entanto, demonstramos aqui que os métodos descritos podem ser precisos e específicos sob as condições apropriadas. Além disso, para comparação com os procedimentos descritos neste artigo, utilizamos a detecção UPLC-MS/MS de um padrão dRL e demonstramos que resultados semelhantes são obtidos com o método orcinol. O protocolo detalhado para quantificar a RL usando este método está incluído no Arquivo Suplementar 1.

Esses protocolos são exemplificados usando as cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) e PA7 (filogrupo 3). Essas cepas foram escolhidas por serem bem caracterizadas e produzirem diferentes perfis de RL.

Protocolo

Este procedimento está esquematizado na Figura Suplementar 1. Os reagentes e equipamentos utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Detecção de mRL e dRL em sobrenadantes de cultura de P. aeruginosa usando TLC

1. Comece com o caldo centrifugado da cepa de interesse de P. aeruginosa , cultivada em meio líquido por 24 h (para atingir a fase estacionária de crescimento onde o RL é produzido). Normalmente, essas culturas contêm 1 x 10⁹ bactérias por mL.
2. Ajustar o pH da cultura para 2 utilizando HCl concentrado.
3. Colocar 5 ml do sobrenadante de cultura acidificado num tubo de polipropileno de 50 ml e adicionar 5 ml de uma mistura de clorofórmio:metanol 2:1.
4. Agite o tubo por inversão três vezes, cada vez por 10 s, e deixe o tubo sem inversão por 2 min entre cada agitação.
5. Deixar o tubo sem agitação durante cerca de 3 h até que as duas fases estejam separadas, ou centrifugar o tubo durante 10 min a 3.000 x g a 4 °C.
6. Transferir a fase orgânica (camada inferior) para um tubo limpo e deixar o tubo numa coifa de extracção até à secura.
7. Repita o processo a partir da etapa 1.3, colocando a fase orgânica do segundo clorofórmio: extração de metanol, no tubo que foi usado na primeira extração.
8. Evapore a fase orgânica até restarem 1 mL ou 1,5 mL. Transfira esse volume para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e evapore o solvente até a secura durante a noite.
9. Adicione 50 μL de metanol ao tubo seco para ressuspender RL.
10. Realize cromatografia em camada fina em placas de sílica gel.
    NOTA: O tamanho da placa TLC deve ser cortado de acordo com o número de amostras que serão analisadas. Cada amostra deve ser aplicada a 1,5 cm, e o ponto de aplicação deve estar a 1 cm da borda da placa (desenhe uma linha horizontal com um lápis).
11. Aplique 5 μL de cada amostra usando uma micropipeta de 10 μL.
12. A fase líquida da TLC consiste em uma mistura 65:15:2 de clorofórmio: metanol: ácido acético. Para preparar 35 mL dessa mistura, misture 26 mL de clorofórmio, 6 mL de metanol e 0,8 mL de uma solução estoque de ácido acético a 20%. Misture esses solventes e coloque-os na câmara fechada de TLC por pelo menos 10 minutos antes de iniciar a cromatografia, para que a atmosfera fique saturada com os solventes voláteis.
13. Coloque a placa TLC na câmara, evitando o contato com o ponto onde as amostras foram aplicadas.
14. Feche a câmara e deixe o TLC até que o solvente atinja 1 cm antes da borda da placa. Neste ponto, retire a placa e deixe secar (um fluxo de ar pode ser aplicado para acelerar o processo).
15. Preparar uma solução de α-naftol dissolvendo 5 g deste composto em 33 ml de etanol. Depois dissolvido, adicione 127,5 mL de etanol, 12,6 mL de água e 20,5 mL de H₂SO₄ frio.
16. Para detectar a presença de mRL e dRL, pulverize a solução de α-naftol na placa da coifa de extração e coloque a placa pulverizada em uma estufa a 85 °C por vários minutos até que a marca rosada de RL seja aparente.
17. Use uma imagem do TLC para calcular a proporção de mono e di-RL presente em cada amostra usando um software que detecta a densidade de cada ponto.

2. Quantificação da quantidade total de RL medindo os equivalentes ramnose presentes no biossurfactante

1. Coloque 1,2 mL de uma cultura em fase estacionária (cultivada por 24 h) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrifugue por 3 min a 3.000 x g a 4 ° C. Recolher o sobrenadante num tubo limpo.
2. Transfira 333 μL para um tubo limpo (execute esta etapa em triplicata) e adicione 1 mL de éter.
3. Misture vigorosamente em um vórtice por 30 s. Repita este procedimento com um tubo de cada vez.
4. Centrifugue por 2 min a 3.000 x g a 4 °C. Recolher a fase orgânica (fase superior), transferi-la para um tubo limpo e deixá-la aberta na coifa até à secura.
5. Repita a extração com éter conforme descrito na etapa 2.2. Repita as etapas 2.3 e 2.4.
6. Depois de completamente seco, adicione 1 mL de água a cada tubo. Deixe os tubos por 12 h para permitir que o RL hidrate e, em seguida, agite vigorosamente no vórtice.
7. Coloque um frasco limpo no gelo por 5 min (pois é uma reação exotérmica). Prepare uma solução de 60% H₂SO₄ (proteja o frasco da luz).
8. Em um tubo limpo, prepare uma solução de orcinol a 1,6% em água destilada. Para preparar o reagente de orcinol, misture 4,4 mL da solução de 60% H₂SO₄ com 0,6 mL da solução de orcinol a 1,6%.
9. Calcular o volume final do reagente de orcinol necessário. Adicionar 900 μL deste reagente a cada amostra e a cada concentração da curva de calibração, utilizando diferentes concentrações de ramnose (normalmente, utilizam-se 9 concentrações de ramnose na faixa de 1 μg/mL a 9 μg/mL), e uma com 100 μL de água, garantindo que todas sejam realizadas em triplicata.
10. Adicionar 100 μl de cada amostra de RL a 900 μl do reagente de orcinol num tubo de vidro e misturar as duas soluções.
11. Incubar durante 30 min em banho-maria pré-aquecido a 80 °C.
12. Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente.
13. Ler a absorvância das amostras e a curva de calibração a 421 nm utilizando uma célula de quartzo.
14. Calcular a concentração de ramnose em cada amostra interpolando a absorvância na curva de calibração e considerando o volume utilizado para a determinação.
15. Para calcular a concentração de μM, divida a concentração obtida em μg/mL por 182,2 (o peso molecular da ramnose) e multiplique por 1000.

Resultados

Neste artigo, três cepas diferentes do tipo P. aeruginosa foram utilizadas para representar três filogrupos, cada um com diferentes níveis de produção de RL e proporções de mRL e dRL. Essas cepas incluem PAO1 (um isolado de ferida da Austrália, 1955²²), PA14 (um isolado de planta dos EUA, 1977²³) e PA7 (um isolado clínico da Argentina, 2010²⁴). Como controle negativo, foi empregado o mutante PAO1 rhlA, que é incapaz de produzir RL....

Discussão

O método mais preciso para detectar e quantificar o RL é a HPLC acoplada à espectrometria de massa (MS)^7,8,27; no entanto, requer equipamentos especializados e caros que podem não ser acessíveis a muitos pesquisadores. Os métodos aqui descritos podem ser realizados rotineiramente com materiais e equipamentos básicos de laboratório para detectar e estimar as concentrações de RL, mas apresentam algumas limitações, part...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C