Détection et quantification des mono-rhamnolipides et des di-rhamnolipides produits par Pseudomonas aeruginosa

Résumé

Pseudomonas aeruginosa produit les biosurfactants rhamnolipides. La chromatographie sur couche mince détecte et détermine la proportion de mono- et di-rhamnolipides produits par chaque souche. La quantification des rhamnolipides totaux consiste à évaluer les équivalents de rhamnose présents dans ces biosurfactants extraits des surnageants de culture à l’aide de la méthode de l’orcinol.

Résumé

La bactérie environnementale Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste à forte résistance aux antibiotiques qui représente un danger pour la santé. Cette bactérie produit des niveaux élevés de biosurfactants connus sous le nom de rhamnolipides (RL), qui sont des molécules ayant une valeur biotechnologique significative mais qui sont également associées à des traits de virulence. À cet égard, la détection et la quantification de l’apprentissage par renforcement peuvent être utiles tant pour les applications biotechnologiques que pour les projets de recherche biomédicale. Dans cet article, nous montrons étape par étape la technique permettant de détecter la production des deux formes de RL produites par P. aeruginosa à l’aide de la chromatographie sur couche mince (CCM) : les mono-rhamnolipides (mRL), molécules constituées d’un dimère d’acides gras (principalement C10-C10) lié à une fraction rhamnose, et les di-rhamnolipides (dRL), molécules constituées d’un dimère d’acide gras similaire lié à deux fractions de rhamnose. De plus, nous présentons une méthode pour mesurer la quantité totale de RL basée sur l’hydrolyse acide de ces biosurfactants extraits d’un surnageant de culture de P. aeruginosa et la détection ultérieure de la concentration de rhamnose qui réagit avec l’orcinol. La combinaison des deux techniques peut être utilisée pour estimer la concentration approximative de mRL et de dRL produite par une souche spécifique, comme illustré ici avec les souches types PAO1 (phylogroupe 1), PA14 (phylogroupe 2) et PA7 (phylogroupe 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie environnementale et un pathogène opportuniste très préoccupant en raison de sa production de traits associés à la virulence et de sa forte résistance aux antibiotiques ^1,2. Un métabolite secondaire caractéristique produit par cette bactérie est le biosurfactant RL, qui est produit de manière coordonnée avec plusieurs traits associés à la virulence tels que la phénazine pyocyanine, un antibiotique à activité redox et la protéase élastase³. Les propriétés tensio-actives et émulsifiantes de RL ont été exploitées dans di....

Protocole

Cette procédure est schématisée dans la figure supplémentaire 1. Les réactifs et l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Détection de mRL et dRL dans les surnageants de culture de P. aeruginosa à l’aide de la CCM

1. Commencer avec le bouillon centrifugé de la souche d’intérêt P . aeruginosa , cultivé en milieu liquide pendant 24 h (pour atteindre la phase stationnaire de croissance où RL est produit). En règle générale, ces cultures contiennent 1 x 10⁹ bactéries par ml.
2. A....

Discussion

La méthode la plus précise pour détecter et quantifier la LR est la HPLC couplée à la spectrométrie de masse (MS)^7,8,27 ; Cependant, cela nécessite de l’équipement spécialisé et coûteux qui n’est peut-être pas accessible à de nombreux chercheurs. Les méthodes décrites ici peuvent être couramment mises en œuvre avec du matériel et de l’équipement de laboratoire de base pour détecter et estimer les concen.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C