Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme

Özet

Protokol, kemirgen kalplerindeki karmaşık kardiyak yapıları araştırmak için uyarlanmış doku temizleme yöntemleriyle birlikte gelişmiş ışık tabakası mikroskobunu kullanır ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Özet

Işık tabakası mikroskobu (LSM), kalbin karmaşık üç boyutlu (3D) yapısını anlamada çok önemli bir rol oynar ve temel kardiyak fizyoloji ve patolojik yanıtlar hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu vesileyle, fare modellerinde kalbin mikro mimarisini aydınlatmak için LSM tekniğinin geliştirilmesini ve uygulanmasını inceliyoruz. Metodoloji, özelleştirilmiş bir LSM sistemini doku temizleme teknikleriyle bütünleştirerek hacimsel görüntüleme için kardiyak dokulardaki ışık saçılımını azaltır. Konvansiyonel LSM'nin görüntü birleştirme ve çoklu görüntüleme evrişim giderme yaklaşımlarıyla kombinasyonu, tüm kalbin yakalanmasına olanak tanır. Eksenel çözünürlük ve görüş alanı (FOV) arasındaki doğal dengeyi ele almak için, odak dışı ışığı en aza indirmek ve kalbi yayılma yönü boyunca eşit şekilde aydınlatmak için eksenel olarak süpürülmüş bir ışık tabakası mikroskobu (ASLM) yöntemini daha da tanıtıyoruz. Bu arada, iDISCO gibi doku temizleme yöntemleri, ışık penetrasyonunu artırarak derin yapıların görselleştirilmesini kolaylaştırır ve tüm kalp boyunca miyokardın kapsamlı bir şekilde incelenmesini sağlar. Önerilen LSM ve doku temizleme yöntemlerinin kombinasyonu, araştırmacılar için kemirgen kalplerindeki kardiyak yapıların çözülmesinde umut verici bir platform sunmakta ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesinin anlaşılması için büyük bir potansiyele sahiptir.

Giriş

Kalp yetmezliği, esas olarak olgun kardiyomiyositlerin rejeneratif kapasitesinin olmaması nedeniyle dünya çapında önde gelen mortalite nedeni olmaya devam etmektedir¹. Kalbin karmaşık mimarisi, işlevinde çok önemli bir rol oynar ve gelişimsel süreçler hakkında bilgi sağlar. Kardiyak yapının derinlemesine anlaşılması, miyokard enfarktüsüne yanıt olarak kardiyak morfogenezin temel süreçlerini ve yeniden şekillenmeyi aydınlatmak için gereklidir. Son gelişmeler, yenidoğan farelerin yaralanma sonrası kardiyak fonksiyonu eski haline getirebildiğini, yetişkin farelerin ise bu tür rejeneratif kapasiteden yoksun olduğunu göstermiştir^2<....

Protokol

Hayvan protokolleri ve deneyleri, Dallas Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ndeki Texas Üniversitesi'nin gözetimi altında onaylanmış ve yürütülmüştür (IACUC # 21-03). Bu çalışmada, doğum sonrası 1. günde (P1) yenidoğanlar ve 8 haftalık yetişkinler dahil olmak üzere C57BL6 fareleri kullanılmıştır. Erkekler ve kadınlar arasında fark gözlenmedi. Tüm veri toplama ve görüntü işleme, açık kaynaklı yazılım veya araştırma veya eğitim lisanslarına sahip platformlar kullanılarak gerçekleştirildi. Kaynaklar, makul talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.

1. Numune hazırlama ve doku temizleme (6 - 10 gün)

1. Doku te....

Tartışmalar

Görüntüleme, hesaplama ve doku temizleme yöntemlerinin ilerlemesi, kardiyak yapı ve fonksiyonu kapsamlı bir şekilde araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlamıştır. Bu, sağlam bir kemirgen kalp modeli kullanarak kardiyak morfogenez ve patogenez anlayışımızı derinleştirmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Benzer bir yaklaşım^40,41,42,43 kullanan zebra balığı kalbi üzerinde yapılan in vivo çalışmaların aksin.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Agarose
Low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
Chemicals for tissue clearing
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans	Sigma-Aldrich	118184
D.E.R.™ 332	Sigma-Aldrich	31185
D.E.R.™ 736	Sigma-Aldrich	31191
Dibenzyl ether (DBE)	Sigma-Aldrich	33630
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)	Sigma-Aldrich	216736
Methanol	Sigma-Aldrich	439193
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Fisher	47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	79383
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Software and algorithms
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
BigStitcher	Hörl et al.22
Fiji-ImageJ	Schindelin et al.20	1.54f
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom body	Olympus	MVX-ZB10
10X Illumination objective	Nikon	MRH00105
1X detection objective	Olympus	MV PLAPO 1X/0.25
473nm DPSS Laser	Laserglow Technologies	LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector	National Instrument	BNC-2110
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes	Physik Instrumente	C-884.4DC
ETL	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable	Optotune	CAB-6-300
ETL Lens Driver	Optotune	EL-E-4i
Filter	Chroma	ET525/30
Filter	Chroma	ET585-40
Filter	Chroma	ET645-75
Filter wheel	Shutter Instrument	LAMBDA 10-B
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.20DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.40DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	M-403.4PD
NI multifunction I/O	National Instrument	PCIe-6363
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Stepper motor	Pololu	1474
Tube lens	Olympus	MVX-TLU