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Resumo

O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.

Resumo

A microscopia de folha de luz (LSM) desempenha um papel fundamental na compreensão da intrincada estrutura tridimensional (3D) do coração, fornecendo informações cruciais sobre a fisiologia cardíaca fundamental e as respostas patológicas. Por meio deste, investigamos o desenvolvimento e a implementação da técnica LSM para elucidar a microarquitetura do coração em modelos de camundongos. A metodologia integra um sistema LSM personalizado com técnicas de limpeza de tecidos, mitigando a dispersão de luz dentro dos tecidos cardíacos para imagens volumétricas. A combinação de LSM convencional com costura de imagem e abordagens de deconvolução multiview permite a captura de todo o coração. Para abordar o trade-off inerente entre resolução axial e campo de visão (FOV), introduzimos ainda um método de microscopia de folha de luz varrida axialmente (ASLM) para minimizar a luz fora de foco e iluminar uniformemente o coração em toda a direção de propagação. Enquanto isso, os métodos de limpeza de tecidos, como o iDISCO, aumentam a penetração da luz, facilitando a visualização de estruturas profundas e garantindo um exame abrangente do miocárdio em todo o coração. A combinação dos métodos propostos de LSM e limpeza de tecidos apresenta uma plataforma promissora para pesquisadores na resolução de estruturas cardíacas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.

Introdução

A insuficiência cardíaca continua sendo a principal causa de mortalidade em todo o mundo, principalmente devido à falta de capacidade regenerativa dos cardiomiócitos maduros1. A intrincada arquitetura do coração desempenha um papel crucial em sua função e fornece informações sobre os processos de desenvolvimento. Uma compreensão profunda da estrutura cardíaca é essencial para elucidar os processos fundamentais da morfogênese e remodelamento cardíaco em resposta ao infarto do miocárdio. Progressos recentes demonstraram que camundongos recém-nascidos podem restaurar a função cardíaca após lesão, enquanto camundongos adultos não têm essa capacidad....

Protocolo

Protocolos e experimentos com animais foram aprovados e conduzidos sob a supervisão do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em Dallas (IACUC # 21-03). Camundongos C57BL6, incluindo neonatos no dia 1 pós-natal (P1) e adultos com 8 semanas de idade, foram usados neste estudo. Não foi observada diferença entre homens e mulheres. Toda a aquisição de dados e pós-processamento de imagens foram realizados por meio de software ou plataformas de código aberto com licenças de pesquisa ou educacionais. Os recursos estão disponíveis com os autores mediante solicitação razoável.

1. Preparação da amostra e limp....

Resultados Representativos

Foi demonstrado que o LSM promove estudos cardíacos 31,32,33,34,35,36,37 devido ao risco mínimo de dano fotográfico, alta resolução espacial e seccionamento óptico, em oposição a outros métodos de imagem óptica, como técnicas de campo claro e varredura pontual <.......

Discussão

O avanço dos métodos de imagem, computação e limpeza de tecidos proporcionou uma oportunidade incomparável para investigar extensivamente a estrutura e a função cardíaca. Isso tem um grande potencial para aprofundar nossa compreensão da morfogênese e patogênese cardíaca usando um modelo de coração de roedor intacto. Em contraste com estudos in vivo de coração de peixe-zebra usando uma abordagem semelhante 40,41,42,43, a integração de técnicas avançadas de LSM e métodos de limpeza de tecidos .......

Divulgações

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Agradecimentos

Expressamos nossa gratidão ao grupo do Dr. Eric Olson no UT Southwestern Medical Center por compartilhar generosamente os modelos animais. Agradecemos todos os comentários construtivos fornecidos pelos membros da incubadora D na UT Dallas. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) e UT Dallas STARS program (YD).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Agarose
Low melting point agaroseThermo Fisher16520050
Deionized water--
Chemicals for tissue clearing 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and transSigma-Aldrich118184
D.E.R.™ 332Sigma-Aldrich31185
D.E.R.™ 736Sigma-Aldrich31191
Dibenzyl ether (DBE)Sigma-Aldrich33630
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997
Fluorescent beadsSpherotechFP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)Sigma-Aldrich216736
MethanolSigma-Aldrich439193
Paraformaldehyde (PFA)Thermo Fisher47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-Aldrich79383
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Software and algorithms
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
BigStitcherHörl et al.22
Fiji-ImageJSchindelin et al.201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom bodyOlympusMVX-ZB10 
10X Illumination objectiveNikonMRH00105
1X detection objectiveOlympusMV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS LaserLaserglow TechnologiesLRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
BNC connectorNational InstrumentBNC-2110
Cylindrical lensThorlabsACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axesPhysik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL CableOptotuneCAB-6-300
ETL Lens DriverOptotuneEL-E-4i
FilterChromaET525/30
FilterChromaET585-40
FilterChromaET645-75
Filter wheel Shutter InstrumentLAMBDA 10-B
Motorized translation stagePhysik InstrumenteL-406.20DG10
Motorized translation stagePhysik InstrumenteL-406.40DG10
Motorized translation stagePhysik InstrumenteM-403.4PD
NI multifunction I/ONational InstrumentPCIe-6363
sCMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
Stepper motorPololu1474
Tube lensOlympusMVX-TLU

Referências

  1. Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331,....

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