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O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.
A microscopia de folha de luz (LSM) desempenha um papel fundamental na compreensão da intrincada estrutura tridimensional (3D) do coração, fornecendo informações cruciais sobre a fisiologia cardíaca fundamental e as respostas patológicas. Por meio deste, investigamos o desenvolvimento e a implementação da técnica LSM para elucidar a microarquitetura do coração em modelos de camundongos. A metodologia integra um sistema LSM personalizado com técnicas de limpeza de tecidos, mitigando a dispersão de luz dentro dos tecidos cardíacos para imagens volumétricas. A combinação de LSM convencional com costura de imagem e abordagens de deconvolução multiview permite a captura de todo o coração. Para abordar o trade-off inerente entre resolução axial e campo de visão (FOV), introduzimos ainda um método de microscopia de folha de luz varrida axialmente (ASLM) para minimizar a luz fora de foco e iluminar uniformemente o coração em toda a direção de propagação. Enquanto isso, os métodos de limpeza de tecidos, como o iDISCO, aumentam a penetração da luz, facilitando a visualização de estruturas profundas e garantindo um exame abrangente do miocárdio em todo o coração. A combinação dos métodos propostos de LSM e limpeza de tecidos apresenta uma plataforma promissora para pesquisadores na resolução de estruturas cardíacas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.
A insuficiência cardíaca continua sendo a principal causa de mortalidade em todo o mundo, principalmente devido à falta de capacidade regenerativa dos cardiomiócitos maduros1. A intrincada arquitetura do coração desempenha um papel crucial em sua função e fornece informações sobre os processos de desenvolvimento. Uma compreensão profunda da estrutura cardíaca é essencial para elucidar os processos fundamentais da morfogênese e remodelamento cardíaco em resposta ao infarto do miocárdio. Progressos recentes demonstraram que camundongos recém-nascidos podem restaurar a função cardíaca após lesão, enquanto camundongos adultos não têm essa capacidad....
Protocolos e experimentos com animais foram aprovados e conduzidos sob a supervisão do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em Dallas (IACUC # 21-03). Camundongos C57BL6, incluindo neonatos no dia 1 pós-natal (P1) e adultos com 8 semanas de idade, foram usados neste estudo. Não foi observada diferença entre homens e mulheres. Toda a aquisição de dados e pós-processamento de imagens foram realizados por meio de software ou plataformas de código aberto com licenças de pesquisa ou educacionais. Os recursos estão disponíveis com os autores mediante solicitação razoável.
1. Preparação da amostra e limp....
Foi demonstrado que o LSM promove estudos cardíacos 31,32,33,34,35,36,37 devido ao risco mínimo de dano fotográfico, alta resolução espacial e seccionamento óptico, em oposição a outros métodos de imagem óptica, como técnicas de campo claro e varredura pontual <.......
O avanço dos métodos de imagem, computação e limpeza de tecidos proporcionou uma oportunidade incomparável para investigar extensivamente a estrutura e a função cardíaca. Isso tem um grande potencial para aprofundar nossa compreensão da morfogênese e patogênese cardíaca usando um modelo de coração de roedor intacto. Em contraste com estudos in vivo de coração de peixe-zebra usando uma abordagem semelhante 40,41,42,43, a integração de técnicas avançadas de LSM e métodos de limpeza de tecidos .......
Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.
Expressamos nossa gratidão ao grupo do Dr. Eric Olson no UT Southwestern Medical Center por compartilhar generosamente os modelos animais. Agradecemos todos os comentários construtivos fornecidos pelos membros da incubadora D na UT Dallas. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) e UT Dallas STARS program (YD).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% Agarose | |||
Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Deionized water | - | - | |
Chemicals for tissue clearing | |||
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Software and algorithms | |||
Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
Key components of the customized light-sheet system | |||
0.63 - 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
Filter | Chroma | ET525/30 | |
Filter | Chroma | ET585-40 | |
Filter | Chroma | ET645-75 | |
Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
Stepper motor | Pololu | 1474 | |
Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
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