АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В протоколе используется передовая световая микроскопия наряду с адаптированными методами очистки тканей для исследования сложных сердечных структур в сердцах грызунов, что имеет большой потенциал для понимания морфогенеза и ремоделирования сердца.

Аннотация

Световая микроскопия (LSM) играет ключевую роль в понимании сложной трехмерной (3D) структуры сердца, обеспечивая решающее понимание фундаментальной физиологии сердца и патологических реакций. Мы углубляемся в разработку и внедрение метода LSM для выяснения микроархитектуры сердца на мышиных моделях. Методология объединяет индивидуальную систему LSM с методами очистки тканей, уменьшая рассеяние света в тканях сердца для объемной визуализации. Сочетание традиционного LSM со сшивкой изображений и многоракурсной деконволюцией позволяет захватывать все сердце. Чтобы устранить неизбежный компромисс между осевым разрешением и полем зрения (FOV), мы также представляем метод осевой световой листовой микроскопии (ASLM) для минимизации расфокусированного света и равномерного освещения сердца в направлении распространения. В то же время методы очистки тканей, такие как iDISCO, усиливают проникновение света, облегчая визуализацию глубоких структур и обеспечивая всестороннее обследование миокарда по всему сердцу. Комбинация предложенных методов LSM и очистки тканей представляет собой многообещающую платформу для исследователей в разрешении сердечных структур в сердцах грызунов, обладающую большим потенциалом для понимания морфогенеза и ремоделирования сердца.

Введение

Сердечная недостаточность остается основной причиной смертности во всем мире, в первую очередь из-за отсутствия регенеративной способности зрелых кардиомиоцитов1. Сложная архитектура сердца играет решающую роль в его функционировании и дает представление о процессах развития. Глубокое понимание структуры сердца необходимо для выяснения фундаментальных процессов морфогенеза сердца и ремоделирования в ответ на инфаркт миокарда. Недавний прогресс показал, что неонатальные мыши могут восстанавливать сердечную функцию после травмы, в то время как взрослые мыши не имеют такой регенеративной способности2. Это создает основу для исследования сигналов, связанных со структурными и функциональными аномалиями в мышиных моделях. Традиционные методы визуализации, такие как конфокальная микроскопия, имеют технические ограничения, включая ограниченную глубину проникновения, медленную схему точечного сканирования и фотоповреждения при длительном воздействии лазерного света. Они препятствуют всестороннему трехмерному (3D) изображению неповрежденного сердца. В этом контексте светолистовая микроскопия (LSM) становится мощным решением, предлагающим преимущества высокоскоростной визуализации, снижения фотоповреждений и исключительных возможностей оптического среза 3,4,5. Уникальные особенности LSM позиционируют его как многообещающий метод преодоления ограничений традиционных методов, обеспечивающий беспрецедентное понимание процессов развития сердца и ремоделирования 6,7,8.

В этом протоколе мы представляем стратегию визуализации, которая сочетает в себе усовершенствованную LSM с адаптированными подходами к очищению тканей9, что позволяет визуализировать целые сердца мышей без необходимости специальной маркировки и механического среза. Мы также предполагаем, что традиционная визуализация LSM может быть улучшена с помощью методов многоракурсной деконволюции10 или аксиальной светолистовой микроскопии (ASLM) 11,12,13,14,15 для улучшения аксиального разрешения. Кроме того, интеграция сшивки изображений с любым из этих методов может эффективно преодолеть компромисс между пространственным разрешением и полем зрения (FOV), тем самым улучшая визуализацию сердец взрослых мышей. Включение многочисленных подходов к очищению тканей, включая гидрофобные, гидрофильные и гидрогелевые методы, обеспечивает более глубокое проникновение света для захвата морфологии всего сердца 16,17,18,19.

В то время как несколько методов очистки совместимы с существующими системами LSM, цель состоит в том, чтобы свести к минимуму рассеяние фотонов и улучшить проникновение света в ткани, такие как сердце, путем замены липидов средой, которая близко соответствует его показателю преломления. iDISCO был выбран в качестве репрезентативноговарианта 20,21 и адаптирован для автофлуоресцентной визуализации в этом протоколе благодаря его быстрой обработке и высокой прозрачности (рис. 1A). В совокупности интеграция передового подхода LSM с методами очистки тканей предлагает многообещающую основу для разгадки сложной анатомии сердца в сердцах грызунов, что имеет значительный потенциал для улучшения нашего понимания морфогенеза и патогенеза сердца.

протокол

Протоколы и эксперименты на животных были одобрены и проведены под надзором Комитета по уходу и использованию животных Техасского университета в Далласе (IACUC #21-03). В этом исследовании использовались мыши C57BL6, включая новорожденных на 1-й день после рождения (P1) и 8-недельных взрослых. Различий между самцами и самками не наблюдалось. Весь сбор данных и постобработка изображений осуществлялись с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом или платформ с исследовательскими или образовательными лицензиями. Ресурсы предоставляются авторами по обоснованному запросу.

1. Подготовка образцов и очистка тканей (6 - 10 дней)

  1. Перед началом процедуры очищения тканей приготовьте все химические растворы, указанные в таблице материалов , необходимых для метода очищения тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры в вытяжном шкафу, надев надлежащие средства индивидуальной защиты, особенно при работе с токсичными химическими веществами.
  2. Усыпляют животных сСО2 , помещая их в камеруСО2 в желаемые моменты времени, такие как Р1 и 8 недель, для сбора всего сердца и погружают только что выделенное сердце при комнатной температуре (ОТ) в 0,2 М KCl для остановки в диастоле16.
  3. Зафиксируйте сердце, погрузив его в 4% параформальдегид (PFA) в 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) с легким перемешиванием на коромысле на ночь, чтобы сохранить анатомию сердца при 4 °C, см. Таблицу 1.
    ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным химическим веществом и должен выполняться под вытяжным шкафом.
  4. Промыть сердце 1x PBS в RT в течение 30 мин, 3x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно: Вставьте сердце в агарозный гель, чтобы создать сердечную сборку для специально созданной системы LSM на шаге 2, как описано ниже.
    1. Приготовьте 1% раствор агарозы, растворив агарозу в PBS, и нагрейте смесь в микроволновой печи до полного растворения. Перелейте раствор в форму, чтобы создать нижний слой, пока раствор не остынет до 40 °C.
    2. Поместите сердечко в форму и заполните форму агарозным гелем до застывания. Удалите все пузырьки в агарозном геле, чтобы свести к минимуму артефакты при визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание образца снижает риск потенциального повреждения анатомии сердца во время монтажа.
      ВНИМАНИЕ: Используйте агарозу с низкой температурой плавления и избегайте помещения сердца непосредственно в нагретую агарозу, чтобы снизить риск воздействия на образец повышенных температур.
  5. Обезвоживайте сердце с помощью градиентов метанола, смешанного с деионизированной водой (рисунок 1B), обрабатывая последовательными концентрациями 20%, 40%, 60%, 80% и 100%, как показано в таблице 1. Повторите со свежим 100% метанолом 1 раз, чтобы обеспечить полное обезвоживание. Обезвоживайте сердца новорожденных мышей в течение 1 ч в каждой смеси метанола с встряхиванием. Отрегулируйте время инкубации до 2 часов для 8-недельных мышей и крысиных сердец.
    ВНИМАНИЕ: Метанол является летучим, раздражающим и легковоспламеняющимся химическим веществом.
  6. Замените и охладите сердце свежим 100% метанолом в течение 10 минут при температуре 4 °C.
  7. Замените раствор и отбеливайте сердце 5% перекисью водорода (H2O2) в метаноле с объемным соотношением 1:5 (30% H2O2 до 100% метанола) в течение ночи при 4 °C для удаления пигментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление пигментов позволяет свести к минимуму поглощение фотонов, что приводит к улучшению качества изображения с уменьшением артефактов.
  8. Замените раствор и инкубируйте сердце в 100% метаноле в течение 1 ч при РТ.
  9. Делипидатировать сердце раствором, содержащим 66% дихлорметана (ДКМП) и 33% метанола, в течение 3 ч с встряхиванием. Убедитесь, что к концу этого шага сердце опустится на дно флакона. Если нет, замените раствор (66% DCM / 33% метанола) и увеличьте время инкубации (например, еще на 1 час) для достижения полного удаления липидов. Быстро переведите сердце в свежий раствор, чтобы предотвратить высыхание, так как ДКМП очень летуч.
    ВНИМАНИЕ: Для эксперимента используйте полипропилен или стеклянную посуду, так как DCM несовместим с полистиролом.
  10. Используйте дибензиловый эфир (DBE) для согласования показателей преломления (RI = 1,56). Для неонатальных мышиных сердец процесс сопоставления показателя преломления занимает 2 дня, в то время как для 8-недельных мышиных сердец он занимает 5 дней с легким встряхиванием. Замените его свежим ДБЭ и продлите время инкубации до тех пор, пока сердце не достигнет полной прозрачности.
    ВНИМАНИЕ: ДБЭ опасен. Избегайте любого контакта с кожей.

2. Монтаж образца (1 день)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется коммерческая LSM-система, следуйте ее специальному протоколу, предоставленному компанией, чтобы исправить сердце, и пропустите шаги 2.1 - 2.9.

  1. Настройте камеру и держатель, устойчивые к решению для согласования показателя преломления (например, DBE в адаптированном подходе iDISCO) с помощью 3D-принтера и материалов из оникса (рис. 2A)16.
  2. Прикрепите магнит к нижней части камеры, чтобы облегчить быстрое подключение и точную локализацию под системой LSM (рис. 2B).
  3. Прикрепите защитные стекла размером 25 мм x 50 мм x 0,17 мм к камере с помощью прозрачного силиконового клея и проверьте водонепроницаемость камеры, заполнив ее DBE и проверив на герметичность через 1 день.
  4. Настройте держатель зажима с помощью 3D-принтера и прикрепите магнит для крепления блока сердца внутри камеры (рис. 2C) или вставьте иглу в агарозный гель для монтажа блока сердца.
  5. Осуществить разработку собственной системы LSM с использованием цилиндрической линзы и твердотельных лазеров с непрерывной диодной накачкой (DPSS), как сообщалось ранее16,22. Используйте длину волны возбуждения 532 нм, чтобы захватить автофлуоресценцию из миокарда (рис. 2D).
  6. Установите камеру на 6-мерный столик и найдите оптимальное положение, где камера перпендикулярна направлению распространения лазера.
  7. Используйте магнитный держатель зажима, чтобы поместить образец в середину камеры и подключить держатель к 4-мерному моторизованному столику (X, Y, Z и Yaw; Рисунок 2D).
  8. Погрузите сердечный блок в камеру, заполненную ДБЭ, с помощью моторизованного столика и определите дальность сканирования по оси обнаружения (направление Z).
  9. Определите скорость сканирования (Vz) двигателя по оси Z на основе размера шага (S) и времени получения изображения (T) с помощью следующего уравнения:
    figure-protocol-7050
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение между размером шага и осевым разрешением системы визуализации соответствует теореме Найквиста-Шеннона. Например, размер шага был установлен на 1 мкм, учитывая, что осевое разрешение составляло 2,91 мкм, как указано в предыдущем отчете16.
  10. Чтобы проверить пространственное разрешение и свести к минимуму потенциальные проблемы с непрозрачностью на разных глубинах, измерьте функцию рассеяния точки (PSF) системы, визуализируя флуоресцентные шарики диаметром 0,53 мкм, разбавленные в 1% агарозном геле с низкой температурой плавления с концентрацией 1:1,5 x 105. Рассчитайте PSF по всему образцу, измерив полную ширину при половине максимума (FWHM)16.

3. Сшивка изображений (4-8 часов)

  1. Рассчитайте количество плиток, необходимых для покрытия всего сердца мыши, с учетом ограниченного поля зрения. Для каждой плитки размеры соответствуют полю зрения системы LSM. Например, для неонатального сердца мыши с поперечным сечением 3 x 3,6мм2 требуется 2 x 2 плитки для покрытия в индивидуальном LSM (рис. 3A). Напротив, 8-недельное сердце мыши размером 5 x 8мм2 требует 3 x 4 плиток, чтобы покрыть всю сердечную структуру (рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сшивание изображений требуется, если обычный LSM имеет ограниченное поле зрения для визуализации всего сердца.
  2. Сделайте снимки сердца, начиная с плитки 1, т. е. верхней левой угловой плитки сердца (рисунок 3A-B).
  3. Последовательно захватывайте изображения оставшихся плиток с 10-процентным перекрытием между последовательными плитками, пока не будет покрыто все сердцевина, как показано на рисунке 3C.
  4. Загрузите и установите программное обеспечение с открытым исходным кодом Fiji23 . Скачайте и установите плагин для Фиджи, BigStitcher24.
  5. Перейдите в меню «Справка», выберите «Обновить», выберите «Управление сайтом обновлений» и выберите BigStitcher. Затем нажмите кнопку Закрыть, а затем Применить изменения. После завершения загрузки плагина перезапустите программное обеспечение Fiji.
  6. Откройте плагин BigStitcher и импортируйте все необходимые тайлы через каталог с файлами изображений. Сохраните набор данных в виде файла HDF5.
  7. Организуйте плитки, выбрав «Переместить плитку по обычной сетке», выберите узор, который используется для перемещения сердца, и выберите 10-процентное перекрытие между каждой плиткой. Сшейте плитки с помощью параметра Мастер сшивки.
  8. Экспортируйте сшитые данные с помощью Image Fusion, чтобы создать tiff-файл.

4. Многоракурсная деконволюция (5 дней)

  1. Используйте флуоресцентные шарики для регистрации изображений многоракурсной реконструкции вдоль сердца (Рисунок 3D).
    1. Смолу25 готовят путем смешивания диглицидилового эфира бисфенола-А (D.E.R. 332), изофорона-дамина, 5-амино-1,3,3-триметилциклогексанметиламина (IPDA) и диглицидилового эфира полипропиленгликоля (D.E.R. 736) в объемном соотношении 4:1:1.
    2. Центрифугируйте 10 мкл флуоресцентных шариков при 161 x g в течение 5 мин и добавьте 20 мкл метанола для замены раствора для хранения гранул. Повторите это 3 раза.
    3. Приготовьте раствор объемом 10 мл с концентрацией гранул 1:1 x 105 , смешав раствор гранул на основе метанола со смолой, приготовленной на шаге 4.1.1.
    4. Дегазация раствора в вакуумной камере в течение 3 ч для удаления воздушных карманов и пузырьков.
    5. Налейте раствор в силиконовую форму или пластиковую соломинку для питья и подождите 2-3 дня, пока он не застынет. Через 1 день, прежде чем смола станет твердой, поместите стеклянную трубку внутрь формы и подождите, пока трубка прилипнет к смоле. Извлеките смолу из формы с помощью стеклянной трубки (рисунок 3D).
    6. Поместите сердце в стеклянную трубку, наполните ее DBE и установите стеклянную трубку в камеру, заполненную DBE.
  2. Получение последовательных изображений сердца мыши вместе с шариками из освещенной части путем сканирования блока сердца по оси обнаружения (ось Z; Рисунок 3E-F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реализуйте сшивку изображений на шаге 3 для создания отдельных стопок изображений, если размер сердца превышает поле зрения.
  3. Поверните сердце мыши на 60° вдоль оси Y, чтобы захватить последующие стопки под разными углами, т. е. 0°, 60°, 120°, 180°, 240° и 300° (рис. 3E-F).
  4. Откройте плагин BigStitcher и импортируйте все изображения через каталог файлов изображений. Сохраните набор данных в виде файла HDF5.
  5. Выберите «Определить точки интереса » и вручную выберите интересующие вас бусины для регистрации.
  6. Выберите Модель аффинного преобразования для регистрации. Выберите «Функция разброса точек» и назначьте кадр PSF всем видам.
  7. Нажмите Multiview Deconvolution и выберите тип итерации Efficient Bayesian. Определите Число итераций равным 10 и выполнитеего 26.
  8. Нажмите на Image Fusion , чтобы экспортировать файл tiff .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о многоракурсной деконволюции можно найти в других отчетах или протоколах 24,27,28.

5. Аппаратное обеспечение системы светового листа с осевой стреловидностью (1 день)

  1. Установите электрическую перестраиваемую линзу (ETL) на плоскость Фурье цилиндрической линзы (CL)27 (рис. 2D) для сканирования лазерного луча в осевом направлении14. Убедитесь, что граница раздела жидкости в ETL находится горизонтально, чтобы предотвратить искажение волнового фронта, вызванное гравитацией. Точное выравнивание ETL, чтобы свести к минимуму децентрацию луча и оптические аберрации более высокого порядка30.
  2. Установите плату сбора данных на рабочую станцию и подключите кабель BNC к плате сбора данных для синхронизации экспозиции камеры и сканирования ETL.
  3. Откройте корпус ETL-драйвера и снимите крышку (рис. 4).
  4. Припаяйте сигнальный провод кабеля BNC к выводу Analog in B, как указано на нижней части печатной платы (рис. 4).
  5. Припаяйте провод заземления кабеля BNC к выводу GND; после этого подключите другой конец кабеля BNC к AO (аналоговому выходу) на плате сбора данных (рис. 4).
  6. Подключите драйвер ETL к USB-порту рабочей станции, подключите драйвер к ETL с помощью кабеля Hirose и установите программное обеспечение контроллера драйвера объектива.
  7. Измените режим работы в программном обеспечении контроллера драйвера объектива на аналоговый, чтобы управлять ETL с помощью триггера, сгенерированного картой сбора данных.
  8. В программном обеспечении sCMOS камеры переключите режим съемки на Внешний (Light-sheet). Убедитесь, что активное направление сканирования пикселей перпендикулярно направлению лазерного сканирования, чтобы облегчить синхронизацию.
  9. Подключите внешний триггерный порт на задней панели камеры sCMOS к AO платы сбора данных с помощью кабеля BNC (рис. 4).

6. Синхронизация системы светового листа с осевой стреловидностью (7 дней)

  1. Определите время экспозиции на основе приемлемого отношения сигнал/фон (SBR), которое для предлагаемого исследования составляет не менее 10. Увеличьте время экспозиции, если SBR меньше 10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции в диапазоне от 10 до 50 мс обеспечивает приемлемый SBR в этом проекте.
  2. Определите время получения изображения (T) и интервал линии (L) на основе времени экспозиции (E) для камеры и частоты ETL (f), используя следующие уравнения:
    figure-protocol-15765
    figure-protocol-15857
    Где P обозначает количество столбцов пикселей на сенсоре камеры. Репрезентативные параметры для опорного сигнала: f = 1 Гц, P = 2048, E = 10 мс и L = 243 μс соответственно.
  3. В программе LabVIEW Trigger Generator.vi генерирует как квадратные, так и треугольные триггеры для синхронизации (рисунок 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальная программа LabVIEW доступна у авторов по обоснованному запросу.
  4. Установите флуоресцентные шарики, разведенные в 1% агарозном геле16 с низкой температурой плавления с концентрацией 1:1 x 103 , чтобы определить положение талии пучка на изображении (фиг.6А).
  5. В программе определите начальную и конечную точки лазерного луча под полем зрения, изменяя напряжение по направлению сканирования.
  6. Чтобы синхронизировать sCMOS-камеру и ETL, отсканируйте лазерный луч вдоль оси X и активные пиксели вдоль оси Y, чтобы получить 2D-изображение (рис. 6B). Более яркие и четкие бусины по диагонали на изображении указывают на точную синхронизацию между sCMOS и ETL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Синхронизация скорости сканирования ETL и активации пикселей sCMOS имеет решающее значение для качества изображения. Различные распространенные асинхронные ошибки обобщены на рисунке 6C-F.
  7. После определения оптимальных параметров синхронизации для синхронизации поверните sCMOS-камеру на 90° вокруг оси Z, чтобы выровнять направление активного пикселя с направлением лазерного сканирования.
  8. Повторите шаг 2.10 и измерьте FWHM PSF. Используйте тот же метод, что и в предыдущем отчете16, со усредненным боковым и осевым разрешениями ASLM 2,18 мкм и 2,88 мкм, соответственно (рис. 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Равномерное освещение и разрешение по всему полю зрения возможны в идеальных условиях (Рисунок 7A-B). Асинхронная работа ETL с камерой sCMOS, а также несогласованность освещения и обнаружения могут привести к неравномерному пространственному разрешению (рис. 7C-D).
  9. Для визуализации сердца, после выравнивания системы и определения оптимальных параметров для синхронизации системы, перейдите к шагам 2.6–2.9.

Результаты

Было продемонстрировано, что LSM способствует кардиологическим исследованиям 31,32,33,34,35,36,37 из-за минимального риска фотоповреждения, высокого пространственного разрешения и оптического среза по сравнению с другими методами оптической визуализации, такими как светлопольные

Обсуждение

Развитие методов визуализации, вычислений и очистки тканей предоставило беспрецедентную возможность для обширного исследования структуры и функции сердца. Это имеет большой потенциал для углубления нашего понимания морфогенеза и патогенеза сердца с использованием модели сердца ин?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы выражаем благодарность группе доктора Эрика Олсона в Юго-западном медицинском центре Техасского университета за щедрое предоставление моделей животных. Мы ценим все конструктивные комментарии, предоставленные членами D-инкубатора в Техасском университете в Далласе. Эта работа была поддержана NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) и программой UT Dallas STARS (Y.D.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Agarose
Low melting point agaroseThermo Fisher16520050
Deionized water--
Chemicals for tissue clearing 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and transSigma-Aldrich118184
D.E.R.™ 332Sigma-Aldrich31185
D.E.R.™ 736Sigma-Aldrich31191
Dibenzyl ether (DBE)Sigma-Aldrich33630
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997
Fluorescent beadsSpherotechFP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)Sigma-Aldrich216736
MethanolSigma-Aldrich439193
Paraformaldehyde (PFA)Thermo Fisher47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-Aldrich79383
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Software and algorithms
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
BigStitcherHörl et al.22
Fiji-ImageJSchindelin et al.201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom bodyOlympusMVX-ZB10 
10X Illumination objectiveNikonMRH00105
1X detection objectiveOlympusMV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS LaserLaserglow TechnologiesLRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
BNC connectorNational InstrumentBNC-2110
Cylindrical lensThorlabsACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axesPhysik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL CableOptotuneCAB-6-300
ETL Lens DriverOptotuneEL-E-4i
FilterChromaET525/30
FilterChromaET585-40
FilterChromaET645-75
Filter wheel Shutter InstrumentLAMBDA 10-B
Motorized translation stagePhysik InstrumenteL-406.20DG10
Motorized translation stagePhysik InstrumenteL-406.40DG10
Motorized translation stagePhysik InstrumenteM-403.4PD
NI multifunction I/ONational InstrumentPCIe-6363
sCMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
Stepper motorPololu1474
Tube lensOlympusMVX-TLU

Ссылки

  1. Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  3. Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73 (2021).
  4. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002 (2018).
  5. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
  6. Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396 (2018).
  7. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209 (2017).
  8. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  10. Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  11. Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
  12. Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
  13. Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924 (2018).
  14. Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
  15. Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795 (2021).
  16. Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278 (2023).
  17. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  18. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
  19. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  21. Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821 (2020).
  22. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769 (2018).
  23. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
  24. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
  25. Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149 (2014).
  26. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  27. Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
  28. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
  29. Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
  30. Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
  31. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387 (2021).
  32. Sands, G. B., et al. It's clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
  33. Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 323, H257 (2022).
  34. Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
  35. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754 (2018).
  36. Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
  37. Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
  38. Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
  39. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  40. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112 (2023).
  41. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
  42. Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
  43. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263 (2024).
  44. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  45. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807 (2021).
  46. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271 (2018).
  47. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  48. Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
  49. Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
  50. Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678 (2017).
  51. Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101 (2019).
  52. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072 (2017).
  53. Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены