Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В протоколе используется передовая световая микроскопия наряду с адаптированными методами очистки тканей для исследования сложных сердечных структур в сердцах грызунов, что имеет большой потенциал для понимания морфогенеза и ремоделирования сердца.

Аннотация

Световая микроскопия (LSM) играет ключевую роль в понимании сложной трехмерной (3D) структуры сердца, обеспечивая решающее понимание фундаментальной физиологии сердца и патологических реакций. Мы углубляемся в разработку и внедрение метода LSM для выяснения микроархитектуры сердца на мышиных моделях. Методология объединяет индивидуальную систему LSM с методами очистки тканей, уменьшая рассеяние света в тканях сердца для объемной визуализации. Сочетание традиционного LSM со сшивкой изображений и многоракурсной деконволюцией позволяет захватывать все сердце. Чтобы устранить неизбежный компромисс между осевым разрешением и полем зрения (FOV), мы также представляем метод осевой световой листовой микроскопии (ASLM) для минимизации расфокусированного света и равномерного освещения сердца в направлении распространения. В то же время методы очистки тканей, такие как iDISCO, усиливают проникновение света, облегчая визуализацию глубоких структур и обеспечивая всестороннее обследование миокарда по всему сердцу. Комбинация предложенных методов LSM и очистки тканей представляет собой многообещающую платформу для исследователей в разрешении сердечных структур в сердцах грызунов, обладающую большим потенциалом для понимания морфогенеза и ремоделирования сердца.

Введение

Сердечная недостаточность остается основной причиной смертности во всем мире, в первую очередь из-за отсутствия регенеративной способности зрелых кардиомиоцитов1. Сложная архитектура сердца играет решающую роль в его функционировании и дает представление о процессах развития. Глубокое понимание структуры сердца необходимо для выяснения фундаментальных процессов морфогенеза сердца и ремоделирования в ответ на инфаркт миокарда. Недавний прогресс показал, что неонатальные мыши могут восстанавливать сердечную функцию после травмы, в то время как взрослые мыши не имеют такой регенеративной способности2. Это создает основу для....

протокол

Протоколы и эксперименты на животных были одобрены и проведены под надзором Комитета по уходу и использованию животных Техасского университета в Далласе (IACUC #21-03). В этом исследовании использовались мыши C57BL6, включая новорожденных на 1-й день после рождения (P1) и 8-недельных взрослых. Различий между самцами и самками не наблюдалось. Весь сбор данных и постобработка изображений осуществлялись с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом или платформ с исследовательскими или образовательными лицензиями. Ресурсы предоставляются авторами по обоснованному запросу.

1. Подготовка образцов и очистка тканей (6 -....

Результаты

Было продемонстрировано, что LSM способствует кардиологическим исследованиям 31,32,33,34,35,36,37 из-за минимального риска фотоповреждения, высокого пространственного разрешения и оптического среза по сравнению с другими методами оптической визуализации, такими как светлопольные

Обсуждение

Развитие методов визуализации, вычислений и очистки тканей предоставило беспрецедентную возможность для обширного исследования структуры и функции сердца. Это имеет большой потенциал для углубления нашего понимания морфогенеза и патогенеза сердца с использованием модели сердца ин?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы выражаем благодарность группе доктора Эрика Олсона в Юго-западном медицинском центре Техасского университета за щедрое предоставление моделей животных. Мы ценим все конструктивные комментарии, предоставленные членами D-инкубатора в Техасском университете в Далласе. Эта работа была поддержана NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) и программой UT Dallas STARS (Y.D.).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Agarose
Low melting point agaroseThermo Fisher16520050
Deionized water--
Chemicals for tissue clearing 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and transSigma-Aldrich118184
D.E.R.™ 332Sigma-Aldrich31185
D.E.R.™ 736Sigma-Aldrich31191
Dibenzyl ether (DBE)Sigma-Aldrich33630
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997
Fluorescent beadsSpherotechFP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)Sigma-Aldrich216736
MethanolSigma-Aldrich439193
Paraformaldehyde (PFA)Thermo Fisher47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-Aldrich79383
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Software and algorithms
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
BigStitcherHörl et al.22
Fiji-ImageJSchindelin et al.201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom bodyOlympusMVX-ZB10 
10X Illumination objectiveNikonMRH00105
1X detection objectiveOlympusMV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS LaserLaserglow TechnologiesLRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
BNC connectorNational InstrumentBNC-2110
Cylindrical lensThorlabsACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axesPhysik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL CableOptotuneCAB-6-300
ETL Lens DriverOptotuneEL-E-4i
FilterChromaET525/30
FilterChromaET585-40
FilterChromaET645-75
Filter wheel Shutter InstrumentLAMBDA 10-B
Motorized translation stagePhysik InstrumenteL-406.20DG10
Motorized translation stagePhysik InstrumenteL-406.40DG10
Motorized translation stagePhysik InstrumenteM-403.4PD
NI multifunction I/ONational InstrumentPCIe-6363
sCMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
Stepper motorPololu1474
Tube lensOlympusMVX-TLU

Ссылки

  1. Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331,....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены