Визуализация светового листа для выявления структуры сердца в сердцах грызунов

Резюме

В протоколе используется передовая световая микроскопия наряду с адаптированными методами очистки тканей для исследования сложных сердечных структур в сердцах грызунов, что имеет большой потенциал для понимания морфогенеза и ремоделирования сердца.

Аннотация

Световая микроскопия (LSM) играет ключевую роль в понимании сложной трехмерной (3D) структуры сердца, обеспечивая решающее понимание фундаментальной физиологии сердца и патологических реакций. Мы углубляемся в разработку и внедрение метода LSM для выяснения микроархитектуры сердца на мышиных моделях. Методология объединяет индивидуальную систему LSM с методами очистки тканей, уменьшая рассеяние света в тканях сердца для объемной визуализации. Сочетание традиционного LSM со сшивкой изображений и многоракурсной деконволюцией позволяет захватывать все сердце. Чтобы устранить неизбежный компромисс между осевым разрешением и полем зрения (FOV), мы также представляем метод осевой световой листовой микроскопии (ASLM) для минимизации расфокусированного света и равномерного освещения сердца в направлении распространения. В то же время методы очистки тканей, такие как iDISCO, усиливают проникновение света, облегчая визуализацию глубоких структур и обеспечивая всестороннее обследование миокарда по всему сердцу. Комбинация предложенных методов LSM и очистки тканей представляет собой многообещающую платформу для исследователей в разрешении сердечных структур в сердцах грызунов, обладающую большим потенциалом для понимания морфогенеза и ремоделирования сердца.

Введение

Сердечная недостаточность остается основной причиной смертности во всем мире, в первую очередь из-за отсутствия регенеративной способности зрелых кардиомиоцитов1^. Сложная архитектура сердца играет решающую роль в его функционировании и дает представление о процессах развития. Глубокое понимание структуры сердца необходимо для выяснения фундаментальных процессов морфогенеза сердца и ремоделирования в ответ на инфаркт миокарда. Недавний прогресс показал, что неонатальные мыши могут восстанавливать сердечную функцию после травмы, в то время как взрослые мыши не имеют такой регенеративной способности². Это создает основу для....

протокол

Протоколы и эксперименты на животных были одобрены и проведены под надзором Комитета по уходу и использованию животных Техасского университета в Далласе (IACUC #21-03). В этом исследовании использовались мыши C57BL6, включая новорожденных на 1-й день после рождения (P1) и 8-недельных взрослых. Различий между самцами и самками не наблюдалось. Весь сбор данных и постобработка изображений осуществлялись с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом или платформ с исследовательскими или образовательными лицензиями. Ресурсы предоставляются авторами по обоснованному запросу.

1. Подготовка образцов и очистка тканей (6 -....

Результаты

Было продемонстрировано, что LSM способствует кардиологическим исследованиям 31,32,33,34,35,36,37 из-за минимального риска фотоповреждения, высокого пространственного разрешения и оптического среза по сравнению с другими методами оптической визуализации, такими как светлопольные

Обсуждение

Развитие методов визуализации, вычислений и очистки тканей предоставило беспрецедентную возможность для обширного исследования структуры и функции сердца. Это имеет большой потенциал для углубления нашего понимания морфогенеза и патогенеза сердца с использованием модели сердца ин?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Agarose
Low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
Chemicals for tissue clearing
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans	Sigma-Aldrich	118184
D.E.R.™ 332	Sigma-Aldrich	31185
D.E.R.™ 736	Sigma-Aldrich	31191
Dibenzyl ether (DBE)	Sigma-Aldrich	33630
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)	Sigma-Aldrich	216736
Methanol	Sigma-Aldrich	439193
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Fisher	47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	79383
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Software and algorithms
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
BigStitcher	Hörl et al.22
Fiji-ImageJ	Schindelin et al.20	1.54f
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom body	Olympus	MVX-ZB10
10X Illumination objective	Nikon	MRH00105
1X detection objective	Olympus	MV PLAPO 1X/0.25
473nm DPSS Laser	Laserglow Technologies	LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector	National Instrument	BNC-2110
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes	Physik Instrumente	C-884.4DC
ETL	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable	Optotune	CAB-6-300
ETL Lens Driver	Optotune	EL-E-4i
Filter	Chroma	ET525/30
Filter	Chroma	ET585-40
Filter	Chroma	ET645-75
Filter wheel	Shutter Instrument	LAMBDA 10-B
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.20DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.40DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	M-403.4PD
NI multifunction I/O	National Instrument	PCIe-6363
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Stepper motor	Pololu	1474
Tube lens	Olympus	MVX-TLU