Rapamisin ile Düzenlenmiş Tirozin Fosfatazların Geliştirilmesi ve Uygulanması

Özet

Bu protokol, rapamisin tarafından düzenlenen fosfatazların tasarımını, oluşturulmasını ve uygulanmasını açıklar. Bu yöntem, canlı hücrelerde fosfataz aktivasyonunun yüksek özgüllüğü ve sıkı zamansal kontrolünü sağlar.

Özet

Tirozin fosfatazlar, kritik fizyolojik fonksiyonları düzenleyen önemli bir enzim ailesidir. Genellikle insan hastalıklarında düzensizdirler ve bu da onları biyolojik çalışmaların ana hedefleri haline getirir. Fosfataz aktivitesinin düzenlenmesini sağlayan araçlar, işlevlerinin diseksiyonunda etkilidir. Yapısal olarak aktif veya baskın negatif mutantların aşırı ekspresyonu veya siRNA kullanılarak aşağı regülasyon gibi geleneksel yaklaşımlar zamansal kontrolden yoksundur. Fosfataz inhibitörleri genellikle zayıf özgüllüğe sahiptir ve araştırmacıların yalnızca fosfatazın inhibisyonundan hangi süreçlerin etkilendiğini belirlemelerine izin verir.

Fosfataz aktivasyonunun sıkı zamansal kontrolünü sağlayan bir fosfataz katalitik alanının allosterik regülasyonuna izin veren kemogenetik bir yaklaşım olan Rapamisin tarafından düzenlenen (RapR) sistemi geliştirdik. RapR sistemi, fosfatazdaki bir allosterik bölgeye yerleştirilmiş bir iFKBP alanından oluşur. RapR alanının içsel yapısal dinamikleri, katalitik alanı bozarak enzimin inaktivasyonuna yol açar. Rapamisin ilavesi, iFKBP ile iFKBP'yi stabilize eden ve fosfatazın katalitik alanına aktiviteyi geri kazandıran birlikte eksprese edilen bir FRB proteini arasında bir kompleks oluşumuna aracılık eder.

Bu sistem, canlı hücrelerde fosfataz aktivasyonunun yüksek özgüllüğünü ve sıkı zamansal kontrolünü sağlar. Bu sistemin benzersiz yetenekleri, geçici olayların tanımlanmasını ve bir fosfatazın akış aşağısındaki bireysel sinyal yollarının sorgulanmasını sağlar. Bu protokol, bir RapR-fosfatazın geliştirilmesi, biyokimyasal karakterizasyonu ve aşağı akış sinyalizasyonu ve hücre morfodinamiğinin düzenlenmesi üzerindeki etkilerinin analizi için yönergeleri açıklar. Ayrıca, bir protein mühendisliği stratejisinin, fosfataz aktivitesini analiz eden in vitro tahlillerin ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri tanımlayan canlı hücre görüntüleme deneylerinin ayrıntılı bir tanımını sağlar.

Giriş

Protein tirozin fosfatazlar, çok sayıda hücre sinyalleme olayında yer alan kritik bir protein ailesidir. Hücre proliferasyonunun, göçünün ve apoptozun düzenlenmesinde kilit bir rol oynadıkları gösterilmiştir ^1,2,3. Sonuç olarak, protein tirozin fosfatazların düzensizliği çeşitli zayıflatıcı hastalıklara ve bozukluklara yol açar 4,5,6,7. Tirozin fosfatazların fizyolojik fonksiyonunu ve bu patolojilerin gelişimindeki rollerini incelemek, fosfataz sinyallemesinin^{karmaşıklıklarını} araştırmak için gerekli araçların eksikliği nedeniyle tarihsel olarak engellenmiştir 8.

Geleneksel olarak fosfatazlar, istenen özgüllüğe sahip olmayan ve/veya aktivitelerinin zamansal kontrolünü sağlamayan yöntemler kullanılarak incelenir. Mevcut araçların bu kritik sınırlamaları, sinyal yollarındaki fosfatazların belirli rollerini incelemeyi zorlaştırmaktadır. Yapısal olarak aktif ve baskın negatif mutantların aşırı ekspresyonu veya fosfatazın ekspresyonunun aşağı regülasyonu özgüllük sağlar, ancak zamansal kontrolden yoksundur ve sıklıkla enzimin gerçek işlevini maskeleyecek telafi edici mekanizmaları tetikleyebilir.

Farmakolojik inhibitörler, fosfatazların zamansal regülasyonuna izin verir. Bununla birlikte, birçok fosfataz inhibitörü, tirozin fosfatazlar^9'daki aktif bölgenin iyi korunmuş bileşimi nedeniyle herkesin bildiği gibi spesifik değildir. Ek olarak, tasarım kısıtlamaları nedeniyle, katalitik bölgeyi hedefleyen inhibitörler zayıf hücre zarı geçirgenliği^{sergiler 10}. İnhibitörlerin bir başka sınırlaması, sadece fosfataz inaktivasyonunun¹¹ etkilerinin incelenmesine izin vermeleridir. Bu nedenle, fosfatazların spesifik, zamansal olarak düzenlenebilir aktivasyonunu sağlayan araçlara ihtiyaç vardır. Bu araçlar, araştırmacıların fosfataz aktivasyonunun doğrudan etkilerini tanımlamalarına ve bunları genellikle biyolojik uyaranlarla aktive edilen çoklu paralel sinyal kaskadlarından ayırmalarına olanak tanıyacaktır. Daha da önemlisi, aktivitenin sıkı zamansal kontrolü, bir fosfataz tarafından indüklenen geçici olayların tanımlanmasını sağlar ve akut ve uzun süreli fosfataz aktivitesinin etkilerini ayırır. Zamansal düzenlemenin mutasyon analizi ile birleştirilmesi, fosfatazın bireysel alanlarının belirli rollerinin ayrıntılı bir diseksiyonuna ve aşağı akış sinyalizasyonunun^{sorgulanmasına izin verecektir 12}.

Mevcut araçlarda istenen yeteneklerin eksikliğini gidermek için Karginov grubu, Rapamisin Düzenlenmiş (RapR) sistemini^geliştirdi 13,14,15. RapR sistemi, ilgilenilen proteinin (POI) allosterik regülasyonuna izin veren tasarlanmış bir anahtar alanı olan iFKBP'yi kullanır. iFKBP alanının, POI'nin katalitik bölgesine allosterik olarak bağlanmış bir konuma yerleştirilmesi, onu rapamisin tarafından regülasyona duyarlı hale getirir. Rapamisin yokluğunda, iFKBP, iFKBP'nin doğası gereği yüksek yapısal dinamikleri nedeniyle katalitik bölgeyi bozar ve böylece POI'yi etkisiz hale getirir. Rapamisin ilavesi, iFKBP'nin birlikte eksprese edilen protein FRB ile etkileşimini indükler (Şekil 1). Bu, anahtar alanının stabilizasyonuna neden olur ve bu da sonuç olarak POI'nin katalitik alanının yapısını ve işlevini geri yükler. Bu nedenle araç, POI'nin spesifik ve geçici olarak düzenlenebilir aktivasyonuna izin verir.

Şekil 1: RapR-Shp2 rapamisin tarafından düzenlenen sistemin şeması. RapR, rapamisin ilavesiyle ilgilenilen proteinin allosterik aktivasyonuna izin verir. Bu rakam Fauser ve ^ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: iFKBP = takılabilir FKBP12; FRB = FKBP-rapamisin bağlama alanı; R = rapamisin; Shp2 = Src homolojisi-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

RapR aracı farklı protein ailelerine uygulanabilir. Protein kinazların yanı sıra fosfatazları^(fosfatazlar) düzenlemek için kullanılabilir ^12,14. Bu protokol, Shp2 fosfatazı kontrol etmek için RapR aracının uygulanmasına odaklanacaktır. Shp2, proliferasyon, migrasyon, immünomodülasyon ve farklılaşma^gibi sinyalleme süreçlerinde yer alan, her yerde eksprese edilen bir protein tirozin fosfatazdır 1,16,17,18. Shp2'nin düzensizliği bir dizi katı kanser, miyeloid lösemi ve gelişimsel bozukluklarla ilişkilendirilmiştir ^5,7. Bununla birlikte, Shp2, yukarıda açıklandığı gibi aynı araç eksikliklerinin kurbanı olmuştur. Bu sınırlamalarla mücadele etmek için, özel ve zamansal olarak düzenlenebilir bir Shp2 yapısı olan RapR-Shp2 geliştirildi ve karakterize edildi¹².

RapR-Shp2'nin geliştirilmesinden önce, Shp2'nin hücre göçünde rol oynadığı biliniyordu ^19,20,21. Bununla birlikte, bu süreçte yer alan sinyalizasyondaki özel rolü bilinmiyordu. Shp2'nin hangi zaman ölçeğinde hücrelerin göçünü düzenlediği ve aktivasyonunun farklı zaman noktalarında hangi spesifik morfodinamik değişiklikleri indüklediği de bilinmiyordu. Ayrıca, Shp2'nin akut ve uzun süreli aktivasyonunun farklı etkilere neden olup olmayacağı belirsizdi. RapR-Shp2 kullanılarak, Shp2'nin akut aktivasyonunun geçici hücre yayılmasına, çıkıntılarda artışa, hücre polarizasyonuna ve göçe neden olduğu bulundu. Farklı morfodinamik değişiklikleri düzenleyen Shp2'nin akış aşağısındaki spesifik yollar da tanımlanmıştır¹². Bu protokol, diğer RapR fosfatazlarının geliştirilmesine ve uygulanmasına rehberlik etmek için kullanılabilecek RapR-Shp2'nin tasarımı ve karakterizasyonu için ayrıntılar sağlar.

Protokol

1. RapR-fosfatazların Tasarımı

1. Planlama
   NOT: Örnek olarak RapR-Shp2'yi kullanan bu protokol, rapamisin tarafından düzenlenen bir tirozin fosfataz oluşturmak için önemli adımları detaylandırır. Açıklanan protokol Shp2 için optimize edilmiştir ve tek tek fosfatazların belirli özelliklerine uyması için ek modifikasyonlar gerekebilir.
   1. Shp2'nin katalitik aktivitesinin endojen mekanizmalar tarafından değil, tamamen rapamisin tarafından kontrol edilmesini sağlamak için, fosfatazı yapısal olarak aktif bir konformasyonda tutmak için fosfataza bir mutasyon ekleyin. Shp2 durumunda, D61A mutasyonunu tanıtın.
      NOT: Belirli bir PTPaz için aktive edici bir mutasyon tanıtılmazsa, RapR varyantı, endojen sinyaller ve rapamisin tarafından düzenlenen AND kapılı bir sistem olarak işlev görecektir.
   2. Daha önce tarif edildiği gibi seçimi yönlendirmek için kristal yapıyı kullanarak fosfatazın katalitik alanındaki iFKBP yerleştirme bölgelerini tanımlayın¹³. Bir yapı mevcut değilse, ekleme bölgelerini belirlemek için Shp2 fosfatazın katalitik alanı ile amino asit dizisi hizalaması yapın (Şekil 2A). Yerleştirme bölgesinin, yapısal olarak katalitik cebe bağlanmış, ancak iFKBP tarafından substrat bağlanmasının sterik olarak engellenmesini önlemek için cepten uzağa yerleştirilmiş esnek bir halka içinde bulunduğundan emin olun.
      NOT: Eklemeyle ilgili daha fazla ayrıntı Tartışma'da tartışılmıştır.
   3. Eklenen iFKBP etki alanı ile ilgilenilen fosfataz arasında kullanılacak bağlayıcı dizisinin türünü göz önünde bulundurun. En uygun bağlayıcı dizisinin seçilmesi, RapR aracının başarısı için son derece önemlidir ve Tartışma'da daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır (Şekil 2B).

Şekil 2: RapR-fosfataz tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken noktaların şeması. (A) Shp2 (mor), PTP1B (yeşil) ve PTP-PEST'in (pembe) korunan yerleştirme yerleri vurgulanarak hizalanması. (B) Shp2 ve iFKBP arasına bağlayıcı eklemenin temsili. (C) Shp2'nin fosfataz alanı, yerleştirme yerleri mavi ile gösterilen bej renktedir. Bu rakam Fauser ve ^ark.12'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: Shp2 = Src homolojisi-2 alanı içeren protein tirozin fosfataz; iFKBP = takılabilir FKBP12; PTP = protein tirozin fosfataz; RapR = Rapamisin tarafından düzenlenmiş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. RapR-fosfatazın oluşturulması

1. Modifiye bölgeye yönelik mutajenez kullanılarak iFKBP'nin ilgilenilen fosfataza yerleştirilmesi
   1. PCR aracılığıyla bir iFKBP kodlamalı "megaprimer" oluşturun.
      1. iFKPB'nin 5' veya 3' ucuna tavlanan 20-25 nükleotid, iFKPB'yi ilgilenilen fosfataza bağlayacak bir bağlayıcı dizisi ve yerleştirme bölgesine karşılık gelen 28-32 nükleotid içeren "megaprimer" sentezi için primerler tasarlayın (Şekil 3). Elde edilen ürünün, ilgilenilen fosfatazdaki yerleştirme bölgesinden önce ve sonra tavlanan parçalarla çevrili iFKPB'yi içerdiğini onaylayın.
      2. PCR (10 μL 5x polimeraz tamponu, 1 μL 50 ng/μL iFKBP içeren şablon DNA, 2 μL 10 mM dNTP, 0.5 μL 100 μM her "megaprimer" primerinin 100 μM stoğu [ileri ve geri], 35 μL su, 1 μL DNA polimeraz) yoluyla "megaprimer" içeren iFKBP'yi sentezleyin. PCR'yi çalıştırmadan önce bu PCR reaksiyonunu 2 ayrı 25 μL reaksiyona bölün. PCR döngüsünü DNA polimeraz üreticisinin tavsiyelerine veya aşağıdaki standart PCR döngüsüne göre çalıştırın: (i) 2 dakika boyunca 98 °C, (ii) 30 saniye boyunca 98 °C, (iii) 30 saniye boyunca 55-70 °C, (iv) 30 saniye boyunca 72 °C, (v) II-IV 25x adımlarını, (vi) 72 °C'de 2 dakika tekrarlayın.
      3. Agaroz jel elektroforezi kullanarak "megaprimer" i saflaştırın. Önceki adımdaki PCR içeriğini %1'lik bir agaroz jele yükleyin ve yaklaşık 30 dakika boyunca 120 V uygulayın. Jelde 400 nükleotid uzunluğundaki "megaprimer" i arayın, parçayı eksize edin ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın (bkz.
         NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
   2. Modifiye bölgeye yönelik mutajenez
      1. Şablon olarak ilgilenilen fosfatazın genini içeren bir plazmit kullanarak modifiye bölgeye yönelik mutajenez reaksiyonunu hazırlayın (5 μL 5x polimeraz tamponu, 2 μL 50 ng/μL şablon, 2 μL 10 mM dNTP, 10 μL ekstrakte edilmiş "megaprimer", 2.5 μL su, 2.5 μL DMSO, 1 μL DNA polimeraz).
         NOT: Reaksiyon karışımına DMSO ilavesi tavlama sıcaklığını²² düşürür.
      2. Aşağıdaki PCR döngüsünü çalıştırın: 98 ° C'de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon adımı, ardından 30 saniye boyunca 98 ° C'de, 20 saniye boyunca 65 ° C'de, 20 saniye boyunca 60 ° C'de, 20 saniye boyunca 55 ° C, 20 saniye boyunca 50 ° C, 18 dakika boyunca 72 ° C'de 18 döngü ardışık inkübasyon adımı. Döngüyü gece boyunca çalıştırın (döngü süresi 7 saattir). Döngü tamamlandığında, PCR reaksiyonunu 4 °C'de saklayın.
         NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
      3. Döngü tamamlandıktan sonra, 1 μL DpnI enzimi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
         NOT: DpnI , artık şablonu sindirerek yeni sentezlenen ürünün verimini artıracaktır.
      4. Sindirilmiş ürünü, üreticinin talimatlarını izleyerek DH5α yetkin hücrelere dönüştürün. Dönüşümü LB agar plakaları üzerine seçim için uygun antibiyotik (pcDNA RapR-Shp2 yapısı için karbenisilin) ile plakalayın. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Koloniler büyüdükten sonra, LB plakalarını 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
         NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
2. RapR-fosfataz içeren istenen DNA yapısının izolasyonu
   1. Bakteri kolonilerinin PCR taramasını yapın²³. Bir LB plakasında yetiştirilen tüm koloniler istenen plazmidi içermeyeceğinden, plazmit DNA'sının izolasyonundan önce tarama yaptığınızdan emin olun.
      NOT: Şablona tavlanacak ekran için ve iFKBP geninde astarlar kullanın. Ekran, Taq polimeraz mastermix kullanılarak yapılabilir (Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. Pozitif koloniler tanımlandıktan sonra, bir pozitif koloniyi uygun antibiyotik dahil 3 mL LB suyuna aşılayın, inkübe edin ve gece boyunca 37 ° C'de çalkalayın.
   3. Üreticinin plazmit DNA ekstraksiyon kiti talimatlarını izleyerek sıvı kültürden plazmit DNA'yı çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız)
      NOT: İn vitro değerlendirmeye devam etmeden önce yeni oluşturulan RapR PTPase yapısının sıralanması önerilir.

Şekil 3: Astar tasarımının şeması ve modifiye edilmiş bölgeye yönelik mutajenez klonlama stratejisi. Adım 1, ilgilenilen fosfatazın yerleştirme bölgesine tavlanan "yapışkan uçlara" sahip "megaprimer" içeren iFKBP'nin sentezidir ve adım 2, "megaprimer" in ilgilenilen fosfataz içine yerleştirilmesidir. Bu rakam Karginov ve ^ark.13'ten değiştirilmiştir. Kısaltma: iFKBP = takılabilir FKBP12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. RapR-PTPaz'ın in vitro aktivite testi ile değerlendirilmesi

NOT: Bu protokol, tasarlanmış RapR-PTPase'nin aktivitesinin düzenlenmesini değerlendirmek için kullanılır. Aşağıda, bir substrat olarak fosforile N-terminal paxillin fragmanı kullanılarak immünopresipite edilmiş Shp2'nin analizi açıklanmaktadır. İlgilenilen belirli bir PTPaz için farklı bir substratın seçilmesi gerekebilir.

1. 1. Gün
   1. L-glutamin takviyesi (2 mM'lik nihai konsantrasyon) ve hacimce %10 FBS ile desteklenmiş DMEM ortamında 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında 800.000 HEK293T hücre / kuyu plakası. Gece boyunca 37 °C ve %5 CO₂ inkübatöre koyun.
2. 2. Gün
   1. Hücreler ~% 60-80 birleştiğinde, bunları tercih edilen transfeksiyon naibi üreticisinin protokolüne göre transfekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
      1. Transfeksiyon protokolü örneği: 200 μL serumsuz DMEM ve 6 μL transfeksiyon reaktifine 1 μg plazmit DNA (pcDNA-mCherry-FRB ve pcDNA-flag-RapR-Shp2, her biri) ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücrelerin oyuğu başına 100 μL transfeksiyon karışımı ekleyin. Yapısal olarak aktif ve baskın negatif Shp2 yapıları ile transfekte edilmiş örnekleri kontrol olarak dahil edin. Gece boyunca 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin.
3. 3. Gün
   1. Protein-G Sefarozun Hazırlanması
      NOT: Sepharose'u kullanmadan önce kesilmiş pipet uçlarını hazırlayın. Sepharoz'un ele alındığı her adımda kesik uçlar kullanılmalıdır. Sefarozun pipetlemeden önce her adımda tamamen yeniden süspanse edilmesi gerekir.
      1. Uygun miktarda Protein-G Sefarozu tekrar askıya alın ve 1.5 mL'lik bir tüpe alın. 6 oyuklu bir plakadaki her kuyucuk için 10 μL Protein-G Sefaroz kullanın. Tam 6 oyuklu bir plaka için 60 μL Separoz kullanın.
      2. Sefarozu 1 mL Lizis Tamponu ile yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). 2.000 × g'da 1 dakika mikrosantrifüj edin ve Lizis Tamponunu dikkatlice çıkarın. 2x tekrarlayın.
      3. Sefarozu 380 μL lizis tamponunda yeniden süspanse edin. BSA'yı 1 mg / mL nihai konsantrasyona ve antikora ekleyin (her IP örneği için 0.5 μL, anti-Flag Antikoru [Malzeme Tablosuna bakınız]). 4 ° C'de 1.5 saat boyunca bir döndürücü üzerinde ters çevirin.
         NOT: Kullanılan her antikor için optimal antikor miktarı deneysel olarak belirlenmelidir.
   2. Hücreleri immünopresipitasyon için hazırlayın.
      1. 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona uygun miktarda rapamisin (etanol içinde 1 mM stok çözeltisi) ekleyin veya numunelere aynı hacimde etanol (negatif kontrol) ekleyin. 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde 1 saat inkübe edin.
      2. Hücrelerin bulunduğu 6 oyuklu plakayı buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri 3 mL soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 300 μL Lizis Tamponu ekleyin (aktive edilmiş fosfataz numunesi için 1 μM rapamisin veya negatif kontrol numunesinde eşdeğer hacimde etanol ile) ve bir hücre kazıyıcı ile kazıyın. Numuneleri 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve 4 ° C'de 1.000 × g'da 10 dakika boyunca mikrosantrifüje aktarın.
      3. İfade seviyelerini kontrol etmek için süpernatanın 20 μL'sini yeni bir 1.5 mL'lik tüpe aktarın. Ekspresyonu kontrol etmek için kullanılacak her tüpe %5 β-merkaptoetanol içeren 20 μL 2x Laemmli tamponu ekleyin ve 95-100 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Adım 3.3.3.3'te immünopresipitasyon için kalan süpernatanı kullanın.
   3. RapR-SHP2'nin İmmünopresipitasyonu
      1. Protein-G Sefarozu adım 3.3.1.3'ten yıkayın. 1 mL Lizis Tamponu ile. Her seferinde 4 ° C'de 2.000 × g'da 1 dakika mikrosantrifüj edin ve Lizis Tamponunu dikkatlice aspire edin. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
      2. Kesilmiş uçları kullanarak, Sefarozu Lizis Tamponunda yeniden süspanse edin (numune başına 50 μL, bu nedenle 6 oyuklu bir plaka için 300 μL Lysis Tamponunda yeniden süspanse edin). Her numune için 50 μL süspanse Sefaroz karışımını 1,5 mL'lik ayrı bir yeni tüpe pipetleyin.
         NOT: Sefarozun hacminden dolayı kalan Lizis Tampon çözeltisinde yeniden süspanse edilmiş Sefaroz olacaktır.
      3. Adım 3.3.2.3'ten hazırlanan hücrelerden kalan süpernatanı her bir Sepharose tüpüne ekleyin. 4 °C'de 1,5–2 saat döndürün.
   4. Fosfataz aktivite deneyi
      NOT: Shp2 substratı, daha önce tarif edilen kinaz reaksiyon protokolü^12'yi takiben yapısal olarak aktif Src kinaz kullanılarak saflaştırılmış N-terminal paxillin fragmanının fosforile edilmesiyle hazırlanmalıdır.
      1. Adım 3.3.3.3'ün sonuna doğru, fosfo-paxillin solüsyonunu hazırlayın. Numune başına, 40 μL toplam İmidazol Tamponuna fosfo-paxillin solüsyonu (3 μg/mL nihai konsantrasyon) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Aktive edilmiş RapR-Shp2 numuneleri için fosfo-paksilin çözeltisinin alikotuna 1 μM'lik nihai konsantrasyona rapamisin ve aktive edilmemiş numuneler için çözeltiye eşdeğer hacimde etanol ekleyin.
      2. Isıtma çalkalayıcıyı 32 °C'ye ayarlayın.
         NOT: Diğer fosfatazlar, optimum aktivite için farklı bir sıcaklığa ihtiyaç duyabilir.
      3. Sepharose'u adım 3.3.3.3 2x'teki örneklerle 0.5 mL Lizis Tamponu ile yıkayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri 2 kez 0,5 mL Yıkama Tamponu ile yıkayın. Her tampon, aktive edilmiş numuneler için 1 μM'de rapamisin veya aktive edilmemiş numuneler için eşdeğer bir hacimde etanol içermelidir. Son yıkamadan sonra mümkün olduğunca fazla tamponu çıkarın.
         NOT: Bu adıma ulaşıldığında, Sefarozun hiçbirinin aspire edilmediğinden emin olmak için son tampon miktarlarını yavaş ve dikkatli bir şekilde çıkarmak için bir pipet kullanmak faydalı olabilir. Artık herhangi bir tampon, fosfo-paxillin konsantrasyonunu etkileyecek ve yanlış okumaya yol açacaktır.
      4. Hazırlanan fosfo-paksilin İmidazol Tampon karışımından 40 μL'yi rapamisin ile veya rapamisin olmadan (numuneye bağlı) her numuneye ekleyin. Karıştırmak için çok nazikçe hafifçe vurun ve hemen ısıtma çalkalayıcıya yerleştirin ve 32 °C'de 40 dakika inkübe edin. Numunenin inkübasyon süresi boyunca tamamen çalkalandığından emin olmak için ısıtma çalkalayıcıyı minimum 1,000 rpm'ye ayarlayın.
      5. Her numuneye 40 μL 2x Laemmli Tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Numuneleri 95–100 °C'de 5 dakika inkübe edin. Örnekleri soğutun.
      6. Her numuneden 15 μL yükleyin (adım 3.3.2.3'teki lizat numuneleri dahil.)% 4-15 gradyanlı bir SDS-poliakrilamid jel üzerine ve PVDF membranları kullanarak standart bir western blot protokolü çalıştırın.
      7. RapR-Shp2 yapısını tespit etmek için bir anti-Flag antikoru, mCherry-FRB'yi tespit etmek için anti-mCherry ve paxillin fosforilasyonunu tespit etmek için anti-pY118 veya anti-pY31 paxillin kullanarak lekeleyin.
         NOT: Ortaya çıkan batı lekeleri Şekil 4'e benzer görünmelidir.

4. Canlı hücrelerde RapR-Shp2 aktivitesinin analizi

NOT: Bu protokol, RapR-Shp2'nin endojen substratları fosforile etme ve aşağı akış sinyalizasyonunu indükleme yeteneğini belirlemek için kullanılır. Diğer RapR-PTPazlar, spesifik substratlarının ve yollarının analizini gerektirecektir.

1. 1. Gün
   1. % 10 FBS ve L-glutamin (2 mM'lik nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş DMEM ortamında 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında 198.000 A431 hücresi / kuyucuğu. Gece boyunca 37 °C ve %5 CO₂ inkübatöre koyun.
2. 2. Gün
   1. RapR-Shp2 ve FRB'yi eksprese eden adenoviral yapılara sahip hücreleri, adenovirüsü doğrudan tabakta bulunan ortama ekleyerek enfekte edin. Adenovirüsü gece boyunca 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde hücreler üzerinde bırakın. FRB ile enfekte olmuş hücreleri sadece negatif kontrol olarak kullanın.
      NOT: Adenovirüs miktarlarının, titreye bağlı olarak duruma göre belirlenmesi gerekecektir.
3. 3. Gün
   1. Deneyden önce 4 saat boyunca% 0.5 FBS ile DMEM'de inkübe ederek A431 hücrelerini aç bırakın.
   2. Hücrelere 2-4 saat boyunca 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona veya aynı hacimde etanole (negatif kontrol) rapamisin ekleyin.
      NOT: İnkübasyon diğer fosfatazlar için farklı olabilir.
   3. Hücrelerin bulunduğu 6 oyuklu plakayı buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri 3 mL soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin, 300 μL Lizis Tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir hücre kazıyıcı ile kuvvetlice kazıyın. Numuneleri 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve 4 ° C'de 2.000 × g'da 5 dakika boyunca mikrosantrifüjleyin.
   4. Her numunenin 250 μL'sini 1,5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. % 5 β-merkaptoetanol ile 250 μL 2x Laemmli tamponu ekleyin ve 95-100 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   5. Her numuneden 25 μL'yi %4-15 gradyanlı bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve PVDF membranları kullanarak standart bir western blot protokolü çalıştırın.
   6. Anti-pY992 EGFR ve anti-pY783 PLCγ antikorları kullanarak EGFR ve PLCy'nin RapR-Shp2 aracılı defosforilasyonunu değerlendirin. pT202/pY204 kalıntıları üzerindeki fosforilasyonunu değerlendirerek MAP kinaz Erk1/2'nin aşağı akış aktivasyonunu değerlendirin.
      NOT: Ortaya çıkan batı lekeleri Şekil 5'e benzer görünmelidir.

5. HeLa hücrelerinde RapR-Shp2 aktivasyonunun neden olduğu morfodinamik değişikliklerin canlı hücre görüntüleme kullanılarak analiz edilmesi

NOT: Bu protokol, RapR-Shp2 aktivasyonunun hücre çıkıntılarının oluşumu, hücre yayılması ve göçü üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılır.

1. 1. Gün
   1. 700.000 HeLa hücresini 35 mm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin ve 37 °C ve %5_CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin tabağa yapışmasına izin verin (~ 2-3 saat).
   2. Hücreleri, tercih edilen transfeksiyon reaktifi üreticisinin protokolüne göre transfekte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
      1. Örnek transfeksiyon protokolü: 100 μL serumsuz DMEM ve 6 μL transfeksiyon reaktifine 0.5 μg DNA (pcDNA-mCherry-FRB ve pcDNA-Venus-RapR-Shp2 plazmitleri) ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Transfeksiyon karışımını hücrelere ekleyin ve gece boyunca 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin. pcDNA-mCherry-FRB ile transfekte edilmiş hücreleri sadece negatif kontrol olarak kullanın.
   3. 37 ° C'de 1 saat inkübe ederek canlı görüntüleme # 1.5 25 mm yuvarlak cam lamel fibronektin (5 mg / L) ile kaplayın.
2. 2. Gün
   1. Kaplanmış cam lamel PBS ile yıkayın.
   2. Görüntülemeden 4 saat önce %30 birleşme elde etmek için transfekte edilmiş HeLa hücrelerini% 10 FBS ve L-glutamin (2 mM'lik nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş DMEM ortamında kaplanmış cam lamel üzerine yerleştirin.
   3. Kaplamadan iki saat sonra, plakadaki ortamı 2 saat boyunca önceden ısıtılmış serumsuz Leibovitz L-15 ortamına yavaşça geçirin.
   4. Hücreleri, üreticinin protokolüne göre CellMask Deep Red plazma zarı boyası ile boyayın.
   5. Lameli temiz bir görüntüleme hücresi bölmesine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). 1 mL önceden ısıtılmış L-15 ortamı ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için 1 mL önceden ısıtılmış mineral yağ ile kaplayın. Görüntüleme yapılana kadar odayı 37 °C'de tutun.
   6. Hücreleri 37 °C'de ısıtılmış bir aşama kullanarak görüntüleyin.
      1. RapR yapısının görüntülenmesi için uygun kanalları ve epifloresan görüntüleme için CellMask'i seçin. Bu protokolü takip etmek için, referans verilen 40x objektifi (Malzeme Tablosuna bakın) ve aşağıdaki filtre setlerini kullanın: Venus-RapR-Shp2 görüntüleme için 514/10 uyarma ve 540/21 emisyon filtreleri, mCherry-FRB görüntüleme için 561/10 uyarma ve 595/40 emisyon filtreleri ve CellMask Deep Red görüntüleme için 640/20 uyarma ve 655LP emisyon filtreleri. Tüm floresan kanalları için çok bantlı bir polikroik ayna kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
      2. 4–4,5 saat boyunca her 2 dakikada bir görüntü yakalayın.
         NOT: Daha hızlı morfodinamik değişiklikler daha sık edinim gerektirecektir.
      3. 1 saatlik görüntülemeden sonra, RapR-Shp2'yi uyarmak için 1 μM'lik bir son konsantrasyona rapamisin ekleyin.

6. Görüntü analizi

NOT: Bu protokol, aşağıdakilere dayalı olarak hücre maskelerinin oluşturulmasını açıklayacaktır. Canlı görüntüleme deneylerinden toplanan TIF yığın dosyaları. Daha sonra, maskeleri analiz etmek için ImageJ'de bir Makronun nasıl oluşturulacağını açıklayacak, bu da daha sonra zaman içindeki değişiklikler için analiz edilen bir hücre alanı elektronik tablosuyla sonuçlanacaktır. Son olarak, hücre çıkıntılı ve geri çekilmeli aktivite Metamorph kullanılarak analiz edilecektir.

1. CellGeo yazılım paketi^24'ten MovThresh işlevini kullanarak CellMask görüntülerinin ikili bir maskesini oluşturun.
2. MovThresh klasörünü görüntü analizi klasörüne kopyalayın.
3. CellMask veya diğer membran işaretleyici kanal görüntülerini MovThresh klasörüne kopyalayın.
   1. Tek bir konumda birden fazla hücre görüntülendiyse, MatLab'da maskeyi oluşturmadan önce yalnızca tek bir hücre içeren dosyalar oluşturmak için görüntüleri kırpın.
4. Dizinin MatLab'daki MovThresh klasörüne doğru şekilde ayarlandığından emin olun.
5. MovThresh'i çalıştırın.
6. Görüntü yığınlarını teker teker içe aktarın.
7. Düzgünleştirilmiş Eğri'yi seçin ve ardından Yeniden Eşik'i çalıştırın.
8. Maskeler etiketli yeni bir klasöre Mask_Image Numarası olarak kaydedin.
9. Tüm görüntü yığınları Maskelere dönüştürüldükten sonra, görüntü yığınlarını ImageJ yazılımında açın²⁵.
   1. ImageJ'de hücre alanı analizi
      1. ImageJ'deki tüm Maske görüntü yığınlarını açın.
      2. Set Ölçümlerini Alan olarak ayarlayın.
      3. Eklentiler | Makrolar | Kayıt.
      4. İşlem | İkili | İkili Yap.
         1. Varsayılan seçeneği belirleyin.
            NOT: Makroyu kaydederken fazladan bir şeye tıklamayın. Ek adımlar dahil edilirse, 6.9.1.3 adımından yeniden başlatmanız önerilir.
      5. Analiz Et | Parçacıkları analiz edin.
         1. Özet dışındaki tüm kutuların işaretini kaldırın.
      6. Kaydı bitirin ve tıklayın Oluşturmak Makroyu yap.
      7. Seçtikten sonra her görüntü yığını için Çalıştır'a basın ve her görüntü yığını için sonuç tablosunu kaydedin. Varsayılan seçenek bir csv dosyası olarak kaydedilir.
      8. Makroyu kaydedin ve gelecekteki analizler için yeniden kullanın (isteğe bağlı).
   2. Elektronik tabloda alan verilerini işleme
      1. Analiz edilen her hücre için, rapamisin ile aktivasyondan önce alınan görüntülerden hücrenin alanını ortalama.
      2. Tüm alan değerlerini, rapamisin ilavesinden önceki hücrenin ortalama alanına bölün.
      3. Görüntülenen tüm hücreler için her zaman noktası için ortalama değeri hesaplayın ve %90 güven aralıklarını belirleyin. Verileri çizin.
   3. Hücre çıkıntılı aktivite analizi
      1. ProActive klasörünü görüntü analizi klasörüne kopyalayın.
      2. Maskelenmiş görüntü yığınlarını MovThresh'ten yeni oluşturulan ProActive klasörüne kopyalayın.
      3. MatLab'ı açın ve dizini ProActive klasörüne ayarlayın.
      4. ProActive'i çalıştırın.
      5. Maskelenmiş hücre görüntüsü yığın dosyalarını ProActive GUI'ye aktarın.
      6. Faaliyet türünü tanımlayın. Çıkıntılı aktivite analizi, kazanılan alan verilerini üretecektir; geri çekme aktivitesi analizi, kaybedilen alan verilerini üretecektir; Ve toplam aktivite, genel alan değişikliği verilerini (hem kaybedilen hem de kazanılan) üretecektir.
      7. Alanı Normalleştirmeyi Tanımla olarak ayarlayın.
      8. Önerilen eşik değerlerini kullanarak veya her zaman noktasını yeniden eşiklemek için ortalamayı kullanarak düzgün eğri. Bu, belirli bir penceredeki eşiklerin ortalamasını alır ve zaman noktaları arasındaki eşiklemedeki tutarsızlıkları en aza indirir.
      9. Dosya | Farklı Kaydet | Sonuçlar (.mat)
         1. Üç alan etkinliği türünü de işliyorsanız, işlenen veri dosyalarını şu şekilde adlandırın: ProResultData #, RetResultData # veya ResultData #.
            NOT: Numaradan önceki boşluğu ekleyin ve verileri 1'den başlayarak numaralandırın.
      10. Adım 6.9.3.6'dan itibaren tekrarlayın. içe aktarılan tüm maskelenmiş görüntü yığınları için.
      11. Tüm hücreler işlendikten sonra ProActive GUI'yi kapatın.
      12. Toplam etkinlik "ResultData" dosyalarını işlemek için Matlab düzenleyicisinde DataToFileTotalArea'yı açın.
      13. Hücre sayısını, oluşturulan sonuç dosyası sayısıyla eşleşecek şekilde değiştirin. 6.9.3.5–6.9.3.10 adımlarında 7 hücre işlendiyse, komut dosyasının ilk üç satırının aşağıdaki gibi olduğundan emin olun:
          filename='Sonuç Verileri';
          hücreler=1:7;
          gecikme=1;
      14. Çalıştır'a basın ve sırasıyla çıkıntılı ve geri çekilebilir verileri işlemek için DataToFileProtArea ve DataToFileRetArea için bunu tekrarlayın. Bu analiz, "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" ve "AllCellsRet.txt" olmak üzere üç metin dosyası üretecektir
      15. .txt dosyalarını bir elektronik tabloda açın ve bölüm 6.9.2'deki gibi normalleştirin. Görüntülenen tüm hücreler için her zaman noktası için ortalama değeri hesaplayın ve %90 güven aralıklarını belirleyin. Verileri çizin.
          NOT: Yukarıdaki adımlardan elde edilen grafikler Şekil 6'ya benzer görünmelidir.

Sonuçlar

Şekil 4, paxillin bazlı fosfataz aktivite testinden beklenebilecek sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, yapısal olarak aktif ve baskın negatif Shp2 fosfataz aktivitesi, okuma olarak fosfo-paxillin kullanılarak aktif ve inaktif RapR-Shp2 aktivitesi ile karşılaştırıldı. Shp2 yapıları immünopresipite edildi ve protokolde tarif edildiği gibi aktivite testine tabi tutuldu. Yapısal olarak aktif Shp2 ve aktif RapR-Shp2 için fosfo-paxillin okuma...

Tartışmalar

Bu protokol, kemogenetik olarak kontrol edilen fosfatazların geliştirilmesi, karakterizasyonu ve uygulanması için ayrıntılı adımlar sağlar. RapR-Shp2 aracı, Shp2 katalitik alanına yerleştirilmiş rapamisin tarafından düzenlenen bir anahtara dayanır. Bu aletin gücü, fosfataz aktivitesinin özgüllüğü ve sıkı zamansal kontrolüdür. Araç, diğer fosfatazlara uygulanabilir ve daha önce açıklanan RapR-TAP teknolojisi ile kombinasyon halinde, bireysel aşağı akış...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690