Rapamisin ile Düzenlenmiş Tirozin Fosfatazların Geliştirilmesi ve Uygulanması

Özet

Bu protokol, rapamisin tarafından düzenlenen fosfatazların tasarımını, oluşturulmasını ve uygulanmasını açıklar. Bu yöntem, canlı hücrelerde fosfataz aktivasyonunun yüksek özgüllüğü ve sıkı zamansal kontrolünü sağlar.

Özet

Tirozin fosfatazlar, kritik fizyolojik fonksiyonları düzenleyen önemli bir enzim ailesidir. Genellikle insan hastalıklarında düzensizdirler ve bu da onları biyolojik çalışmaların ana hedefleri haline getirir. Fosfataz aktivitesinin düzenlenmesini sağlayan araçlar, işlevlerinin diseksiyonunda etkilidir. Yapısal olarak aktif veya baskın negatif mutantların aşırı ekspresyonu veya siRNA kullanılarak aşağı regülasyon gibi geleneksel yaklaşımlar zamansal kontrolden yoksundur. Fosfataz inhibitörleri genellikle zayıf özgüllüğe sahiptir ve araştırmacıların yalnızca fosfatazın inhibisyonundan hangi süreçlerin etkilendiğini belirlemelerine izin verir.

Fosfataz aktivasyonunun sıkı zamansal kontrolünü sağlayan bir fosfataz katalitik alanının allosterik regülasyonuna izin veren kemogenetik bir yaklaşım olan Rapamisin tarafından düzenlenen (RapR) sistemi geliştirdik. RapR sistemi, fosfatazdaki bir allosterik bölgeye yerleştirilmiş bir iFKBP alanından oluşur. RapR alanının içsel yapısal dinamikleri, katalitik alanı bozarak enzimin inaktivasyonuna yol açar. Rapamisin ilavesi, iFKBP ile iFKBP'yi stabilize eden ve fosfatazın katalitik alanına aktiviteyi geri kazandıran birlikte eksprese edilen bir FRB proteini arasında bir kompleks oluşumuna aracılık eder.

Bu sistem, canlı hücrelerde fosfataz aktivasyonunun yüksek özgüllüğünü ve sıkı zamansal kontrolünü sağlar. Bu sistemin benzersiz yetenekleri, geçici olayların tanımlanmasını ve bir fosfatazın akış aşağısındaki bireysel sinyal yollarının sorgulanmasını sağlar. Bu protokol, bir RapR-fosfatazın geliştirilmesi, biyokimyasal karakterizasyonu ve aşağı akış sinyalizasyonu ve hücre morfodinamiğinin düzenlenmesi üzerindeki etkilerinin analizi için yönergeleri açıklar. Ayrıca, bir protein mühendisliği stratejisinin, fosfataz aktivitesini analiz eden in vitro tahlillerin ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri tanımlayan canlı hücre görüntüleme deneylerinin ayrıntılı bir tanımını sağlar.

Giriş

Protein tirozin fosfatazlar, çok sayıda hücre sinyalleme olayında yer alan kritik bir protein ailesidir. Hücre proliferasyonunun, göçünün ve apoptozun düzenlenmesinde kilit bir rol oynadıkları gösterilmiştir ^1,2,3. Sonuç olarak, protein tirozin fosfatazların düzensizliği çeşitli zayıflatıcı hastalıklara ve bozukluklara yol açar 4,5,6,7. Tirozin fosfatazların fizyolojik fonksiyonunu ve bu patolojilerin gelişimindeki ....

Protokol

1. RapR-fosfatazların Tasarımı

1. Planlama
   NOT: Örnek olarak RapR-Shp2'yi kullanan bu protokol, rapamisin tarafından düzenlenen bir tirozin fosfataz oluşturmak için önemli adımları detaylandırır. Açıklanan protokol Shp2 için optimize edilmiştir ve tek tek fosfatazların belirli özelliklerine uyması için ek modifikasyonlar gerekebilir.
   1. Shp2'nin katalitik aktivitesinin endojen mekanizmalar tarafından değil, tamamen rapamisin tarafından kontrol edilmesini sağlamak için, fosfatazı yapısal olarak aktif bir konformasyonda tutmak için fosfataza bir mutasyon ekleyin. Shp2 durumunda, D61A mutasyonunu tanıtın.

Tartışmalar

Bu protokol, kemogenetik olarak kontrol edilen fosfatazların geliştirilmesi, karakterizasyonu ve uygulanması için ayrıntılı adımlar sağlar. RapR-Shp2 aracı, Shp2 katalitik alanına yerleştirilmiş rapamisin tarafından düzenlenen bir anahtara dayanır. Bu aletin gücü, fosfataz aktivitesinin özgüllüğü ve sıkı zamansal kontrolüdür. Araç, diğer fosfatazlara uygulanabilir ve daha önce açıklanan RapR-TAP teknolojisi ile kombinasyon halinde, bireysel aşağı akış.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690