Développement et application de tyrosine phosphatases régulées par la rapamycine

Résumé

Ce protocole décrit la conception, la création et l’application des phosphatases régulées par la rapamycine. Cette méthode offre une spécificité élevée et un contrôle temporel étroit de l’activation de la phosphatase dans les cellules vivantes.

Résumé

Les tyrosine phosphatases sont une famille importante d’enzymes qui régulent les fonctions physiologiques critiques. Ils sont souvent dérégulés dans les maladies humaines, ce qui en fait des cibles clés des études biologiques. Les outils qui permettent de réguler l’activité de la phosphatase jouent un rôle déterminant dans la dissection de leur fonction. Les approches traditionnelles, telles que la surexpression de mutants négatifs constitutivement actifs ou dominants, ou la régulation négative à l’aide de siRNA, manquent de contrôle temporel. Les inhibiteurs de la phosphatase ont souvent une faible spécificité et ils ne permettent aux chercheurs que de déterminer quels processus sont affectés par l’inhibition de la phosphatase.

Nous avons développé une approche chimiogénétique, le système RapRapR-regulated (RapR), qui permet la régulation allostérique d’un domaine catalytique de la phosphatase qui permet un contrôle temporel serré de l’activation de la phosphatase. Le système RapR est constitué d’un domaine iFKBP inséré dans un site allostérique de la phosphatase. La dynamique structurelle intrinsèque du domaine RapR perturbe le domaine catalytique, conduisant à l’inactivation de l’enzyme. L’ajout de rapamycine médie la formation d’un complexe entre l’iFKBP et une protéine FRB co-exprimée, qui stabilise l’iFKBP et restaure l’activité du domaine catalytique de la phosphatase.

Ce système offre une spécificité élevée et un contrôle temporel étroit de l’activation de la phosphatase dans les cellules vivantes. Les capacités uniques de ce système permettent l’identification d’événements transitoires et l’interrogation de voies de signalisation individuelles en aval d’une phosphatase. Ce protocole décrit les lignes directrices pour le développement d’une RapR-phosphatase, sa caractérisation biochimique et l’analyse de ses effets sur la signalisation en aval et la régulation de la morphodynamique cellulaire. Il fournit également une description détaillée d’une stratégie d’ingénierie des protéines, des tests in vitro analysant l’activité de la phosphatase et des expériences d’imagerie de cellules vivantes identifiant les changements dans la morphologie cellulaire.

Introduction

Les protéines tyrosine phosphatases sont une famille critique de protéines impliquées dans une pléthore d’événements de signalisation cellulaire. Il a été démontré qu’ils jouent un rôle clé dans la régulation de la prolifération, de la migration et de l’apoptose^{cellulaires 1,2,3}. Par conséquent, la dérégulation des protéines tyrosine phosphatases conduit à une variété de maladies et de troubles débilitants 4,5,6,7. L’étude de la fonction physiologique des tyrosine phosphatases et de leur rôle dans le développement de ces pathologies a toujours été entravée par un manque d’outils nécessaires pour sonder les subtilités de la signalisation de la phosphatase⁸.

Traditionnellement, les phosphatases sont étudiées à l’aide de méthodes qui n’ont pas la spécificité souhaitée et/ou qui n’assurent pas de contrôle temporel de leur activité. Ces limites critiques des outils disponibles rendent difficile la dissection des rôles spécifiques des phosphatases dans les voies de signalisation. La surexpression de mutants négatifs constitutivement actifs et dominants ou la régulation négative de l’expression de la phosphatase fournissent une spécificité mais manquent de contrôle temporel et peuvent souvent déclencher des mécanismes compensatoires qui masqueront la véritable fonction de l’enzyme.

Les inhibiteurs pharmacologiques permettent la régulation temporelle des phosphatases. Cependant, de nombreux inhibiteurs de la phosphatase sont notoirement non spécifiques en raison de la composition bien conservée du site actif dans les tyrosine phosphatases⁹. De plus, en raison de contraintes de conception, les inhibiteurs ciblant le site catalytique présentent une faible perméabilité de la membrane cellulaire¹⁰. Une autre limitation des inhibiteurs est qu’ils ne permettent d’examiner que les effets de l’inactivation de la phosphatase¹¹. Il est donc nécessaire de disposer d’outils permettant une activation spécifique et régulable dans le temps des phosphatases. Ces outils permettront aux chercheurs d’identifier les effets directs de l’activation de la phosphatase, en les séparant de multiples cascades de signalisation parallèles souvent activées par des stimuli biologiques. Il est important de noter qu’un contrôle temporel étroit de l’activité permet d’identifier les événements transitoires induits par une phosphatase et de séparer les effets de l’activité aiguë et prolongée de la phosphatase. La combinaison de la régulation temporelle et de l’analyse mutationnelle permettra une dissection détaillée des rôles spécifiques des domaines individuels de la phosphatase et l’interrogation de sa signalisation en aval¹².

Pour remédier au manque de capacités souhaitées dans les outils existants, le groupe Karginov a développé le système Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. Le système RapR utilise un domaine de commutation modifié, iFKBP, qui permet la régulation allostérique de la protéine d’intérêt (POI). L’insertion du domaine iFKBP à une position allostériquement couplée au site catalytique du POI le rend sensible à la régulation par la rapamycine. En l’absence de rapamycine, l’iFKBP perturbe le site catalytique en raison de la dynamique structurelle intrinsèquement élevée de l’iFKBP et inactive ainsi le POI. L’ajout de rapamycine induit l’interaction de l’iFKBP avec la protéine co-exprimée FRB (Figure 1). Cela provoque une stabilisation du domaine de commutation, ce qui restaure par conséquent la structure et la fonction du domaine catalytique du POI. En tant que tel, l’outil permet une activation spécifique et régulable dans le temps du POI.

Figure 1 : Schéma du système régulé par la rapamycine RapR-Shp2. RapR permet l’activation allostérique de la protéine d’intérêt avec l’ajout de rapamycine. Cette figure a été modifiée à partir de Fauser et ^al.12. Abréviations : iFKBP = FKBP12 insérable ; FRB = domaine de liaison FKBP-rapamycine ; R = rapamycine ; Shp2 = protéine tyrosine phosphatase contenant le domaine Src homology-2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’outil RapR peut être appliqué à différentes familles de protéines. Il peut être utilisé pour réguler les protéines kinases ainsi que les phosphatases^12,14. Ce protocole se concentrera sur l’application de l’outil RapR pour contrôler la phosphatase Shp2. Shp2 est une protéine tyrosine phosphatase exprimée de manière ubiquitaire qui est impliquée dans des processus de signalisation tels que la prolifération, la migration, l’immunomodulation et la différenciation 1,16,17,18. La dérégulation de Shp2 a été associée à un certain nombre de cancers solides, à la leucémie myéloïde et à des troubles du développement ^5,7. Cependant, Shp2 a été victime des mêmes défauts d’outils que ceux décrits ci-dessus. Pour lutter contre ces limitations, RapR-Shp2, une construction Shp2 spécifiquement et temporellement régulable, a été développée et caractérisée¹².

Avant le développement de RapR-Shp2, on savait que Shp2 était impliqué dans la migration cellulaire 19,20,21. Cependant, son rôle spécifique dans la signalisation impliquée dans ce processus était inconnu. On ne savait pas non plus à quelle échelle de temps Shp2 régule la migration des cellules et quels changements morphodynamiques spécifiques elle induit à différents moments de son activation. De plus, il n’était pas clair si l’activation aiguë et prolongée de Shp2 provoquerait des effets différents. En utilisant RapR-Shp2, il a été constaté que l’activation aiguë de Shp2 induit une propagation cellulaire transitoire, une augmentation des protubérances, une polarisation cellulaire et une migration. Des voies spécifiques en aval de Shp2 qui régulent des changements morphodynamiques distincts ont également été identifiées¹². Ce protocole fournit des détails pour la conception et la caractérisation de RapR-Shp2, qui peuvent être utilisés pour guider le développement et l’application d’autres phosphatases RapR.

Protocole

1. Conception des RapR-phosphatases

1. Planification
   REMARQUE : En utilisant RapR-Shp2 comme exemple, ce protocole détaille les étapes importantes pour la création d’une tyrosine phosphatase régulée par la rapamycine. Le protocole décrit est optimisé pour Shp2 et des modifications supplémentaires peuvent être nécessaires pour s’adapter aux propriétés spécifiques des phosphatases individuelles.
   1. Pour s’assurer que l’activité catalytique de Shp2 est purement contrôlée par la rapamycine et non par des mécanismes endogènes, introduire une mutation dans la phosphatase pour la maintenir dans une conformation constitutivement active. Dans le cas de Shp2, introduire la mutation D61A.
      REMARQUE : Si aucune mutation activatrice n’est introduite pour une PTPase spécifique, sa variante RapR fonctionnera comme un système AND-gate régulé par des signaux endogènes et la rapamycine.
   2. Identifier les sites d’insertion de l’iFKBP dans le domaine catalytique de la phosphatase en utilisant la structure cristalline pour guider la sélection comme décrit précédemment¹³. Si une structure n’est pas disponible, effectuez un alignement de séquence d’acides aminés avec le domaine catalytique de la phosphatase Shp2 pour identifier les sites d’insertion (Figure 2A). Assurez-vous que le site d’insertion est situé dans une boucle flexible qui est structurellement couplée à la poche catalytique, mais positionnée à l’écart de la poche pour éviter toute entrave stérique de la liaison du substrat par l’iFKBP.
      REMARQUE : De plus amples détails sur l’insertion sont discutés dans la discussion.
   3. Considérons le type de séquence de liaison à utiliser entre le domaine iFKBP inséré et la phosphatase d’intérêt. Le choix de la séquence optimale de l’éditeur de liens est extrêmement important pour le succès de l’outil RapR et est abordé plus en détail dans la discussion (figure 2B).

Figure 2 : Schéma des considérations lors de la conception de la RapR-phosphatase. (A) Alignement de Shp2 (violet), PTP1B (vert) et PTP-PEST (rose) avec les sites d’insertion conservés mis en évidence. (B) Représentation de l’insertion de l’agent de liaison entre Shp2 et iFKBP. (C) Domaine phosphatase de Shp2 en beige avec sites d’insertion indiqués en bleu. Cette figure a été modifiée à partir de Fauser et ^al.12. Abréviations : Shp2 = Src homology-2 domain-containing protein tyrosine phosphatase ; iFKBP = FKBP12 insérable ; PTP = protéine tyrosine phosphatase ; RapR = régulé par la rapamycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Création de la RapR-phosphatase

1. Insertion d’iFKBP dans la phosphatase d’intérêt par mutagenèse dirigée modifiée
   1. Générez une « mégaamorce » d’encodage iFKBP par PCR.
      1. Concevez des amorces pour la synthèse de « méga-amorces » qui contiennent 20 à 25 nucléotides recuits à l’extrémité 5' ou 3' de l’iFKPB, une séquence de liaison qui reliera l’iFKPB à la phosphatase d’intérêt, et 28 à 32 nucléotides correspondant au site d’insertion (Figure 3). Confirmer que le produit résultant contient l’iFKPB flanqué de fragments recuits avant et après le site d’insertion dans la phosphatase d’intérêt.
      2. Synthétiser l’iFKBP contenant la « mégaamorce » par PCR (10 μL de tampon de polymérase 5x, 1 μL d’ADN matrice de 50 ng/μL contenant de l’iFKBP, 2 μL de 10 mM dNTP, 0,5 μL d’un stock de 100 μM de chaque amorce « méga-amorce » [avant et arrière], 35 μL d’eau, 1 μL d’ADN polymérase). Divisez cette réaction PCR en 2 réactions distinctes de 25 μL avant d’exécuter la PCR. Exécutez le cycle de PCR conformément aux recommandations du fabricant de l’ADN polymérase ou au cycle de PCR standard suivant : (i) 98 °C pendant 2 min, (ii) 98 °C pendant 30 s, (iii) 55-70 °C pendant 30 s, (iv) 72 °C pendant 30 s, (v) répétez les étapes ii-iv 25x, (vi) 72 °C pendant 2 min.
      3. Purifier le « méga-amorce » à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Chargez le contenu de la PCR de l’étape précédente dans un gel d’agarose à 1 % et appliquez 120 V pendant environ 30 min. Recherchez la « mégaamorce » de 400 nucléotides de longue dans le gel, excisez le fragment et purifiez-le à l’aide d’un kit d’extraction de gel (voir le tableau des matériaux).
         REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
   2. Mutagénèse dirigée modifiée
      1. Préparez la réaction de mutagénèse dirigée modifiée à l’aide d’un plasmide contenant le gène de la phosphatase d’intérêt comme matrice (5 μL de tampon de polymérase 5x, 2 μL de matrice 50 ng/μL, 2 μL de 10 mM de dNTP, 10 μL de « mégaprimer » extrait, 2,5 μL d’eau, 2,5 μL de DMSO, 1 μL d’ADN polymérase).
         REMARQUE : L’ajout de DMSO dans le mélange réactionnel abaisse la température de recuit²².
      2. Exécutez le cycle de PCR suivant : étape de dénaturation initiale à 98 °C pendant 3 min, suivie de 18 cycles d’incubation consécutifs à 98 °C pendant 30 s, 65 °C pendant 20 s, 60 °C pendant 20 s, 55 °C pendant 20 s, 50 °C pendant 20 s, 72 °C pendant 18 min. Exécutez le cycle pendant la nuit (la durée du cycle est de 7 h). Une fois le cycle terminé, stockez la réaction PCR à 4 °C.
         REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
      3. Une fois le cycle terminé, ajouter 1 μL d’enzyme DpnI et incuber à 37 °C pendant 1 h.
         REMARQUE : DpnI va digérer le modèle résiduel, augmentant ainsi le rendement du produit nouvellement synthétisé.
      4. Transformer le produit digéré en DH5α cellules compétentes en suivant les instructions du fabricant. Plaquez la transformation sur des plaques de gélose LB avec l’antibiotique approprié pour la sélection (carbénicilline pour la construction pcDNA RapR-Shp2). Incuber à 37 °C pendant la nuit. Une fois que les colonies ont grandi, conservez les plaques LB à 4 °C jusqu’à 1 mois.
         REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Isolement d’une construction d’ADN souhaitée contenant de la RapR-phosphatase
   1. Effectuer un dépistage PCR des colonies bactériennes²³. Comme toutes les colonies cultivées sur une plaque LB ne contiendront pas le plasmide souhaité, assurez-vous de dépister avant l’isolement de l’ADN plasmidique.
      REMARQUE : Utilisez des amorces pour l’écran qui recuit à la matrice et dans le gène iFKBP. Le criblage peut être réalisé à l’aide de la polymérase Taq mastermix (voir Tableau des matériaux).
   2. Une fois les colonies positives identifiées, inoculer une colonie positive dans 3 mL de bouillon LB comprenant l’antibiotique approprié, incuber et agiter à 37 °C pendant la nuit.
   3. Extraire l’ADN plasmidique de la culture liquide en suivant les instructions du fabricant pour le kit d’extraction d’ADN plasmidique (voir le tableau des matériaux)
      REMARQUE : Il est recommandé de séquencer la construction RapR PTPase nouvellement créée avant de poursuivre l’évaluation in vitro .

Figure 3 : Schéma de la conception de l’amorce et de la stratégie modifiée de clonage par mutagénèse dirigée vers le site. L’étape 1 est la synthèse de l’iFKBP contenant la « mégaamorce » avec le recuit des « extrémités collantes » au site d’insertion de la phosphatase d’intérêt, et l’étape 2 est l’insertion de la « mégaamorce » dans la phosphatase d’intérêt. Cette figure a été modifiée à partir de Karginov et ^al.13. Abréviation : iFKBP = FKBP12 insérable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Évaluation de la RapR-PTPase par dosage d’activité in vitro

REMARQUE : Ce protocole est utilisé pour évaluer la régulation de l’activité de la RapR-PTPase modifiée. Ci-dessous est décrite l’analyse de Shp2 immunoprécipité à l’aide d’un fragment N-terminal phosphorylé de paxilline comme substrat. Il peut être nécessaire de sélectionner un substrat différent pour une PTPase d’intérêt spécifique.

1. Jour 1
   1. Plaque de 800 000 cellules HEK293T/puits dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits dans un milieu DMEM complété par un supplément de L-glutamine (concentration finale de 2 mM) et 10 % de FBS en volume. Placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
2. Jour 2
   1. Une fois que les cellules sont confluentes à ~60-80 %, transfectez-les selon le protocole du fabricant du régent de transfection préféré (voir le tableau des matériaux).
      1. Exemple de protocole de transfection : Ajouter 1 μg d’ADN plasmidique (pcDNA-mCherry-FRB et pcDNA-flag-RapR-Shp2, chacun) à 200 μL de DMEM sans sérum et 6 μL de réactif de transfection et incuber le mélange à température ambiante pendant 15 min. Ajouter 100 μL de mélange de transfection par puits de cellules. Inclure des échantillons transfectés avec des constructions Shp2 négatives constitutivement actives et dominantes comme témoins. Incuber une nuit dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ .
3. Jour 3
   1. Préparation de la protéine-G sépharose
      REMARQUE : Préparez les pointes de pipette coupées avant de manipuler Sepharose. Les pointes coupées doivent être utilisées à chaque étape où Sepharose est manipulé. Le sépharose doit être soigneusement remis en suspension à chaque étape avant le pipetage.
      1. Remettre en suspension et prendre la quantité appropriée de Protein-G Sepharose dans un tube de 1,5 ml. Pour chaque puits d’une plaque à 6 puits, utilisez 10 μL de Protein-G Sepharose. Pour une plaque pleine à 6 puits, utilisez 60 μL de Sepharose.
      2. Lavez le sépharose avec 1 mL de tampon de lyse (voir le tableau des matériaux). Microcentrifugeuse pendant 1 min à 2 000 × g et retirez soigneusement le tampon de lyse. Répétez l’opération 2 fois.
      3. Remettre le sépharose en suspension dans 380 μL de tampon de lyse. Ajouter de la BSA à une concentration finale de 1 mg/mL et de l’anticorps (0,5 μL pour chaque échantillon IP, anticorps anti-drapeau [voir le tableau des matières]). Renverser sur un rotateur à 4 °C pendant 1,5 h.
         REMARQUE : La quantité optimale d’anticorps doit être déterminée expérimentalement pour chaque anticorps utilisé.
   2. Préparez les cellules pour l’immunoprécipitation.
      1. Ajouter une quantité appropriée de rapamycine (1 mM de solution mère dans de l’éthanol) jusqu’à une concentration finale de 1 μM ou ajouter le même volume d’éthanol (témoin négatif) aux échantillons. Incuber 1 h dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ .
      2. Placez la plaque à 6 puits avec les cellules sur de la glace et lavez délicatement les cellules avec 3 ml de PBS froid. Aspirer le PBS et ajouter 300 μL de tampon de lyse (avec soit 1 μM de rapamycine pour l’échantillon de phosphatase activée, soit un volume équivalent d’éthanol dans l’échantillon de contrôle négatif) et gratter avec un grattoir cellulaire. Transvaser les échantillons dans des tubes de 1,5 mL et microcentrifuger pendant 10 min à 1 000 × g à 4 °C.
      3. Transvaser 20 μL du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL pour vérifier les niveaux d’expression. Ajouter 20 μL de 2 tampons Laemmli avec 5 % de β-mercaptoéthanol dans chaque tube à utiliser pour vérifier l’expression et incuber à 95-100 °C pendant 5 min. Utilisez le surnageant restant pour l’immunoprécipitation à l’étape 3.3.3.3.
   3. Immunoprécipitation de RapR-Shp2
      1. Lavez la protéine-G Sepharose à partir de l’étape 3.3.1.3. avec 1 mL de tampon de lyse. Microcentrifugez pendant 1 min à 2 000 × g à 4 °C à chaque fois et aspirez soigneusement le tampon de lyse. Répétez cette étape 2 fois.
      2. À l’aide des pointes coupées, remettre en suspension le sépharose dans le tampon de lyse (50 μL par échantillon, donc pour une plaque à 6 puits, remettre en suspension dans 300 μL de tampon de lyse). Pipeter 50 μL du mélange de sépharose en suspension dans un nouveau tube séparé de 1,5 mL pour chaque échantillon.
         REMARQUE : Il y aura du Sepharose remis en suspension dans la solution tampon de lyse restante en raison du volume de Sepharose.
      3. Ajouter le surnageant restant des cellules préparées à l’étape 3.3.2.3 dans chaque tube de sépharose. Tourner à 4 °C pendant 1,5 à 2 h.
   4. Dosage de l’activité de la phosphatase
      REMARQUE : Le substrat de Shp2 doit être préparé en phosphorylant un fragment N-terminal purifié de paxilline à l’aide de la kinase Src constitutivement active conformément au protocole de réaction kinase¹² décrit précédemment.
      1. Vers la fin de l’étape 3.3.3.3, préparez la solution de phospho-paxilline. Par échantillon, ajouter une solution de phospho-paxilline (concentration finale de 3 μg/mL) à 40 μL de tampon d’imidazole total (voir le tableau des matières). Ajouter de la rapamycine à la concentration finale de 1 μM à l’aliquote de la solution de phospho-paxilline pour les échantillons activés de RapR-Shp2 et un volume équivalent d’éthanol à la solution pour les échantillons non activés.
      2. Réglez le shaker à 32 °C.
         REMARQUE : D’autres phosphatases peuvent avoir besoin d’une température différente pour une activité optimale.
      3. Lavez Sepharose avec les échantillons de l’étape 3.3.3.3 2 fois avec 0,5 mL de tampon de lyse (voir le tableau des matériaux). Lavez les échantillons 2 fois avec 0,5 ml de tampon de lavage. Chaque tampon doit contenir soit de la rapamycine à 1 μM pour les échantillons activés, soit un volume équivalent d’éthanol pour les échantillons non activés. Retirez autant de tampon que possible après le lavage final.
         REMARQUE : Une fois cette étape atteinte, il peut être utile d’utiliser une pipette pour retirer lentement et soigneusement les quantités finales de tampon afin de s’assurer qu’aucune partie du sépharose n’est aspirée. Tout tampon restant influencera la concentration de phospho-paxilline et entraînera une lecture inexacte.
      4. Ajouter 40 μL du mélange préparé de tampon phospho-paxilline imidazole à chaque échantillon, avec ou sans rapamycine (en fonction de l’échantillon). Agitez très doucement pour mélanger et placez immédiatement dans l’agitateur chauffant et incubez pendant 40 min à 32 °C. Réglez l’agitateur chauffant à un minimum de 1 000 tr/min pour vous assurer que l’échantillon est complètement agité pendant toute la durée de l’incubation.
      5. Arrêtez la réaction en ajoutant 40 μL de 2x tampon Laemmli à chaque échantillon. Incuber les échantillons à 95–100 °C pendant 5 min. Refroidissez les échantillons.
      6. Chargez 15 μL de chaque échantillon (y compris les échantillons de lysat de l’étape 3.3.2.3.) sur un gel SDS-polyacrylamide à gradient de 4 à 15 % et exécutez un protocole de western blot standard à l’aide de membranes PVDF.
      7. Appliquer un transfert à l’aide d’un anticorps anti-Flag pour détecter la construction RapR-Shp2, d’un anticorps anti-mCherry pour détecter mCherry-FRB et d’un anticorps anti-pY118 ou anti-pY31 paxillin pour détecter la phosphorylation de la paxilline.
         REMARQUE : Les taches de western qui en résultent doivent ressembler à la figure 4.

4. Analyse de l’activité de RapR-Shp2 dans les cellules vivantes

REMARQUE : Ce protocole est utilisé pour déterminer la capacité de RapR-Shp2 à déphosphoryler les substrats endogènes et à induire une signalisation en aval. D’autres RapR-PTPases nécessiteront l’analyse de leurs substrats et voies spécifiques.

1. Jour 1
   1. Plaque de 198 000 cellules/puits A431 dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits dans un milieu DMEM complété par 10 % de FBS et de L-glutamine (concentration finale de 2 mM). Placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
2. Jour 2
   1. Infectez les cellules avec des constructions adénovirales exprimant RapR-Shp2 et FRB en ajoutant l’adénovirus directement dans le milieu déjà dans la boîte. Laissez l’adénovirus sur les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit. N’utilisez les cellules infectées par le SRR que comme témoin négatif.
      REMARQUE : Les quantités d’adénovirus devront être déterminées au cas par cas en fonction du titre.
3. Jour 3
   1. Affamez les cellules A431 en les incubant dans du DMEM avec 0,5 % de FBS pendant 4 heures avant l’expérience.
   2. Ajouter de la rapamycine à une concentration finale de 1 μM ou le même volume d’éthanol (témoin négatif) dans les cellules pendant 2 à 4 h.
      REMARQUE : L’incubation peut être différente pour d’autres phosphatases.
   3. Placez la plaque à 6 puits avec les cellules sur de la glace et lavez délicatement les cellules avec 3 ml de PBS froid. Aspirez le PBS, ajoutez 300 μL de tampon de lyse (voir le tableau des matériaux) et grattez vigoureusement avec un grattoir cellulaire. Transvaser les échantillons dans des tubes de 1,5 mL et microcentrifuger pendant 5 min à 2 000 × g à 4 °C.
   4. Transférez 250 μL de chaque échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 250 μL de 2 tampons Laemmli avec 5 % de β-mercaptoéthanol et incuber à 95-100 °C pendant 5 min.
   5. Chargez 25 μL de chaque échantillon sur un gel SDS-PAGE à gradient de 4 à 15 % et exécutez un protocole de transfert Western standard à l’aide de membranes PVDF.
   6. Évaluer la déphosphorylation de l’EGFR et du PLCγ médiée par RapR-Shp2 à l’aide d’anticorps anti-pY992 EGFR et anti-pY783 PLCγ. Évaluer l’activation en aval de la MAP kinase Erk1/2 en évaluant sa phosphorylation sur les résidus pT202/pY204.
      REMARQUE : Les taches Western résultantes doivent ressembler à la figure 5.

5. Analyse des changements morphodynamiques induits par l’activation de RapR-Shp2 dans les cellules HeLa à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes

REMARQUE : Ce protocole est utilisé pour déterminer l’effet de l’activation de RapR-Shp2 sur la formation des protubérances cellulaires, l’étalement cellulaire et la migration.

1. Jour 1
   1. Placez 700 000 cellules HeLa dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm et placez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ . Laissez les cellules adhérer à la boîte (~2–3 h).
   2. Transfectez les cellules selon le protocole du fabricant de réactifs de transfection préféré (voir le tableau des matériaux).
      1. Exemple de protocole de transfection : Ajoutez 0,5 μg d’ADN (plasmides pcDNA-mCherry-FRB et pcDNA-Venus-RapR-Shp2, chacun) à 100 μL de DMEM sans sérum et 6 μL de réactif de transfection. Incuber à température ambiante pendant 15 min. Ajouter le mélange de transfection dans les cellules et incuber toute la nuit dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ . Utilisez des cellules transfectées avec pcDNA-mCherry-FRB uniquement comme contrôle négatif.
   3. Enduire une lamelle ronde en verre #1.5 de 25 mm de fibronectine (5 mg/L) en l’incubant pendant 1 h à 37 °C.
2. Jour 2
   1. Lavez la lamelle en verre revêtu avec du PBS.
   2. Plaquez les cellules HeLa transfectées sur la lamelle de verre revêtue dans un milieu DMEM complété par 10 % de FBS et de L-glutamine (concentration finale de 2 mM) pour atteindre une confluence de 30 % 4 h avant l’imagerie.
   3. Deux heures après le placage, remplacez délicatement le milieu dans la plaque par un milieu Leibovitz L-15 sans sérum préchauffé pendant 2 h.
   4. Teindre les cellules avec la coloration à membrane plasmique CellMask Deep Red selon le protocole du fabricant.
   5. Placez la lamelle dans une chambre de cellule d’imagerie propre (voir le tableau des matériaux). Ajouter 1 mL de milieu L-15 préchauffé et couvrir de 1 mL d’huile minérale préchauffée pour éviter l’évaporation. Maintenez la chambre à 37 °C jusqu’à l’imagerie.
   6. Imagez les cellules à 37 °C à l’aide d’une platine chauffée.
      1. Sélectionner les canaux appropriés pour l’imagerie de la construction RapR et CellMask pour l’imagerie par épifluorescence. Pour suivre ce protocole, utilisez l’objectif 40x référencé (voir Tableau des matériaux) et les jeux de filtres suivants : filtres d’excitation 514/10 et d’émission 540/21 pour l’imagerie Venus-RapR-Shp2, filtres d’excitation 561/10 et d’émission 595/40 pour l’imagerie mCherry-FRB, et filtres d’excitation 640/20 et d’émission 655LP pour l’imagerie CellMask Deep Red. Utilisez un miroir polychroïque multibande pour tous les canaux fluorescents (voir le tableau des matériaux).
      2. Capturez des images toutes les 2 minutes pendant 4 à 4,5 h.
         REMARQUE : Des changements morphodynamiques plus rapides nécessiteront une acquisition plus fréquente.
      3. Après 1 heure d’imagerie, ajouter de la rapamycine à une concentration finale de 1 μM pour stimuler RapR-Shp2.

6. Analyse d’images

REMARQUE : Ce protocole décrit la création de masques cellulaires basés sur . Fichiers de pile TIF collectés à partir d’expériences d’imagerie en direct. Il décrira ensuite comment créer une macro dans ImageJ pour analyser les masques, ce qui aboutira à une feuille de calcul de la surface de la cellule qui est ensuite analysée pour détecter les changements au fil du temps. Enfin, l’activité protrusive et rétractive des cellules sera analysée à l’aide de Metamorph.

1. Générez un masque binaire d’images CellMask à l’aide de la fonction MovThresh du progiciel CellGeo²⁴.
2. Copiez le dossier MovThresh dans le dossier d’analyse d’image.
3. Copiez les images de canal CellMask ou d’autres marqueurs de membrane dans le dossier MovThresh.
   1. Si plusieurs cellules ont été imagées à une seule position, recadrez les images pour générer des fichiers contenant une seule cellule avant de créer le masque dans MatLab.
4. Assurez-vous que le répertoire est correctement défini sur le dossier MovThresh dans MatLab.
5. Exécutez MovThresh.
6. Importez des piles d’images une par une.
7. Sélectionnez Courbe lissée , puis exécutez Reseuillage.
8. Enregistrez sous Mask_Image numéro dans un nouveau dossier intitulé Masques.
9. Une fois que toutes les piles d’images ont été converties en masques, ouvrez les piles d’images dans le logiciel ImageJ²⁵.
   1. Analyse de l’aire cellulaire dans ImageJ
      1. Ouvrez toutes les piles d’images de masque dans ImageJ.
      2. Ajustez les mesures réglées à la surface.
      3. Cliquez sur Plugins | Macros | Enregistrer.
      4. Cliquez sur Traiter | Binaire | Rendre binaire.
         1. Sélectionnez l’option par défaut .
            REMARQUE : Ne cliquez sur rien de plus pendant l’enregistrement de la macro. Si des étapes supplémentaires sont incluses, il est recommandé de redémarrer à partir de l’étape 6.9.1.3.
      5. Cliquez sur Analyser | Analysez les particules.
         1. Décochez toutes les cases sauf Résumé.
      6. Terminez l’enregistrement et cliquez sur Créer pour créer la macro.
      7. Appuyez sur Exécuter pour chaque pile d’images après l’avoir sélectionnée et enregistrez le tableau des résultats pour chaque pile d’images. L’option par défaut est enregistrée sous forme de fichier csv.
      8. Enregistrez la macro et réutilisez-la pour de futures analyses (facultatif).
   2. Traitement des données de la zone dans une feuille de calcul
      1. Pour chaque cellule analysée, faire la moyenne de la surface de la cellule à partir d’images prises avant l’activation avec la rapamycine.
      2. Divisez toutes les valeurs de surface par l’aire moyenne de la cellule précédant l’addition de la rapamycine.
      3. Calculez la valeur moyenne de chaque point temporel pour toutes les cellules imagées et déterminez les intervalles de confiance à 90 %. Tracez les données.
   3. Analyse de l’activité protrusive cellulaire
      1. Copiez le dossier ProActive dans le dossier d’analyse d’image.
      2. Copiez les piles d’images masquées de MovThresh dans le dossier ProActive nouvellement créé.
      3. Ouvrez MatLab et définissez le répertoire sur le dossier ProActive.
      4. Exécutez ProActive.
      5. Importez les fichiers de pile d’images de cellules masquées dans l’interface graphique ProActive.
      6. Définissez le type d’activité. L’analyse de l’activité protrusive générera des données sur la surface gagnée ; l’analyse de l’activité rétractactive générera des données sur les zones perdues ; et l’activité totale généreront des données globales sur les changements de zone (perdus et gagnés).
      7. Définissez la zone sur Définir la normalisation.
      8. Lissez la courbe à l’aide des valeurs de seuil suggérées ou à l’aide de la moyenne pour reseuilr chaque point temporel. Cela permet de faire la moyenne des seuils sur une fenêtre spécifique, ce qui minimise les incohérences dans le seuillage entre les points temporels.
      9. Cliquez sur Fichier | Enregistrer sous | Résultats (.mat)
         1. Si vous traitez les trois types d’activité de zone, nommez les fichiers de données traités comme suit : ProResultData #, RetResultData # ou ResultData #.
            REMARQUE : Incluez l’espace avant le numéro et numérotez les données en commençant par 1.
      10. Répétez l’opération à partir de l’étape 6.9.3.6. pour toutes les piles d’images masquées importées.
      11. Une fois que toutes les cellules ont été traitées, fermez l’interface graphique ProActive.
      12. Ouvrez DataToFileTotalArea dans l’éditeur Matlab pour traiter les fichiers d’activité totale « ResultData ».
      13. Modifiez le nombre de cellules pour qu’il corresponde au nombre de fichiers de résultats générés. Si 7 cellules ont été traitées aux étapes 6.9.3.5 à 6.9.3.10, assurez-vous que les trois premières lignes du script sont les suivantes :
          filename='Données de résultat ' ;
          cellules = 1:7 ;
          lag = 1 ;
      14. Appuyez sur Exécuter et répétez cette opération pour DataToFileProtArea et DataToFileRetArea afin de traiter respectivement les données protrusives et réactives. Cette analyse produira trois fichiers texte « AllCells.txt », « AllCellsPro.txt » et « AllCellsRet.txt »
      15. Ouvrez les fichiers .txt dans une feuille de calcul et normalisez-les comme dans la section 6.9.2. Calculez la valeur moyenne de chaque point temporel pour toutes les cellules imagées et déterminez des intervalles de confiance à 90 %. Tracez les données.
          REMARQUE : Les tracés résultant des étapes ci-dessus doivent ressembler à la figure 6.

Résultats

La figure 4 montre les résultats que l’on peut attendre du test d’activité de la phosphatase à base de paxilline. Dans cette expérience, l’activité négative de la phosphatase Shp2, constitutivement active et dominante, a été comparée à celle de la RapR-Shp2 active et inactive en utilisant la phospho-paxilline comme lecture. Les constructions de Shp2 ont été immunoprécipitées et soumises au test d’activité décrit dans le protocole. Les...

Discussion

Ce protocole fournit des étapes détaillées pour le développement, la caractérisation et l’application de phosphatases contrôlées par chimiogénétique. L’outil RapR-Shp2 repose sur un interrupteur régulé par la rapamycine inséré dans le domaine catalytique Shp2. La force de cet outil est la spécificité et le contrôle temporel serré de l’activité de la phosphatase. L’outil est applicable à d’autres phosphatases et, en combinaison avec la technologie RapR-TAP dé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690