Développement et application de tyrosine phosphatases régulées par la rapamycine

Résumé

Ce protocole décrit la conception, la création et l’application des phosphatases régulées par la rapamycine. Cette méthode offre une spécificité élevée et un contrôle temporel étroit de l’activation de la phosphatase dans les cellules vivantes.

Résumé

Les tyrosine phosphatases sont une famille importante d’enzymes qui régulent les fonctions physiologiques critiques. Ils sont souvent dérégulés dans les maladies humaines, ce qui en fait des cibles clés des études biologiques. Les outils qui permettent de réguler l’activité de la phosphatase jouent un rôle déterminant dans la dissection de leur fonction. Les approches traditionnelles, telles que la surexpression de mutants négatifs constitutivement actifs ou dominants, ou la régulation négative à l’aide de siRNA, manquent de contrôle temporel. Les inhibiteurs de la phosphatase ont souvent une faible spécificité et ils ne permettent aux chercheurs que de déterminer quels processus sont affectés par l’inhibition de la phosphatase.

Nous avons développé une approche chimiogénétique, le système RapRapR-regulated (RapR), qui permet la régulation allostérique d’un domaine catalytique de la phosphatase qui permet un contrôle temporel serré de l’activation de la phosphatase. Le système RapR est constitué d’un domaine iFKBP inséré dans un site allostérique de la phosphatase. La dynamique structurelle intrinsèque du domaine RapR perturbe le domaine catalytique, conduisant à l’inactivation de l’enzyme. L’ajout de rapamycine médie la formation d’un complexe entre l’iFKBP et une protéine FRB co-exprimée, qui stabilise l’iFKBP et restaure l’activité du domaine catalytique de la phosphatase.

Ce système offre une spécificité élevée et un contrôle temporel étroit de l’activation de la phosphatase dans les cellules vivantes. Les capacités uniques de ce système permettent l’identification d’événements transitoires et l’interrogation de voies de signalisation individuelles en aval d’une phosphatase. Ce protocole décrit les lignes directrices pour le développement d’une RapR-phosphatase, sa caractérisation biochimique et l’analyse de ses effets sur la signalisation en aval et la régulation de la morphodynamique cellulaire. Il fournit également une description détaillée d’une stratégie d’ingénierie des protéines, des tests in vitro analysant l’activité de la phosphatase et des expériences d’imagerie de cellules vivantes identifiant les changements dans la morphologie cellulaire.

Introduction

Les protéines tyrosine phosphatases sont une famille critique de protéines impliquées dans une pléthore d’événements de signalisation cellulaire. Il a été démontré qu’ils jouent un rôle clé dans la régulation de la prolifération, de la migration et de l’apoptose^{cellulaires 1,2,3}. Par conséquent, la dérégulation des protéines tyrosine phosphatases conduit à une variété de maladies et de troubles débilitants 4,5,6,7. ....

Protocole

1. Conception des RapR-phosphatases

1. Planification
   REMARQUE : En utilisant RapR-Shp2 comme exemple, ce protocole détaille les étapes importantes pour la création d’une tyrosine phosphatase régulée par la rapamycine. Le protocole décrit est optimisé pour Shp2 et des modifications supplémentaires peuvent être nécessaires pour s’adapter aux propriétés spécifiques des phosphatases individuelles.
   1. Pour s’assurer que l’activité catalytique de Shp2 est purement contrôlée par la rapamycine et non par des mécanismes endogènes, introduire une mutation dans la phosphatase pour la maintenir dans une conformation....

Discussion

Ce protocole fournit des étapes détaillées pour le développement, la caractérisation et l’application de phosphatases contrôlées par chimiogénétique. L’outil RapR-Shp2 repose sur un interrupteur régulé par la rapamycine inséré dans le domaine catalytique Shp2. La force de cet outil est la spécificité et le contrôle temporel serré de l’activité de la phosphatase. L’outil est applicable à d’autres phosphatases et, en combinaison avec la technologie RapR-TAP dé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690