Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatase의 개발 및 응용

요약

이 프로토콜은 rapamycin-regulated phosphatase의 설계, 생성 및 적용을 설명합니다. 이 방법은 살아있는 세포에서 인산가수분해효소 활성화에 대한 높은 특이성과 엄격한 시간적 제어를 제공합니다.

초록

티로신 인산가수분해효소(Tyrosine phosphatase)는 중요한 생리적 기능을 조절하는 중요한 효소군입니다. 그들은 종종 인간 질병에서 조절되지 않아 생물학적 연구의 주요 대상이됩니다. 인산가수분해효소 활성을 조절할 수 있는 도구는 그 기능을 해부하는 데 도움이 됩니다. 구성적으로 활성화되거나 우세한 음성 돌연변이의 과발현 또는 siRNA를 사용한 하향 조절과 같은 전통적인 접근법은 시간적 제어가 부족합니다. 인산가수분해효소 억제제는 종종 특이성이 낮으며, 연구자들이 인산가수분해효소의 억제에 의해 영향을 받는 과정만을 결정할 수 있도록 합니다.

우리는 화학유전학적 접근법인 라파마이신 조절(RapR) 시스템을 개발했으며, 이는 인산가수분해효소 활성화의 엄격한 시간적 제어를 가능하게 하는 인산가수분해효소 촉매 도메인의 알로스테릭 조절을 가능하게 합니다. RapR 시스템은 인산가수분해효소의 알로스테릭 부위에 삽입된 iFKBP 도메인으로 구성됩니다. RapR 영역의 고유한 구조 역학은 촉매 영역을 파괴하여 효소의 불활성화를 초래합니다. 라파마이신의 첨가는 iFKBP와 공동 발현된 FRB 단백질 사이의 복합체 형성을 매개하여 iFKBP를 안정화하고 인산가수분해효소의 촉매 도메인에 활성을 복원합니다.

이 시스템은 살아있는 세포에서 인산가수분해효소 활성화에 대한 높은 특이성과 엄격한 시간적 제어를 제공합니다. 이 시스템의 고유한 기능을 통해 일시적인 이벤트를 식별하고 인산가수분해효소의 다운스트림에 있는 개별 신호 경로를 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RapR-phosphatase의 개발, 생화학적 특성화, 다운스트림 신호 전달 및 세포 형태역학 조절에 미치는 영향 분석을 위한 지침을 설명합니다. 또한 단백질 엔지니어링 전략, 인산가수분해효소 활성을 분석하는 in vitro assay, 세포 형태의 변화를 식별하는 live cell imaging 실험에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

서문

단백질 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase)는 과다한 세포 신호 전달 사건에 관여하는 중요한 단백질군입니다. 그들은 세포 증식, 이동 및 세포 사멸 ^1,2,3의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 결과적으로, 단백질 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase)의 조절 장애는 쇠약하게 하는 다양한 질병 및 장애를 유발한다 4,5,6,7. 티로신 인산가수분해효소의 생리학적 기능과 이러한 병리학의 발달에 대한 그들의 역할을 연구하는 것은 역사적으로 인산가수분해효소 신호전달의 복잡성을 조사하는 데 필요한 도구의 부족으로 인해 방해를 받아왔다⁸.

전통적으로 인산가수분해효소는 원하는 특이성을 갖지 못하거나....

프로토콜

1. RapR-phosphatase의 설계

1. 계획
   참고: RapR-Shp2를 예로 들면, 이 프로토콜은 라파마이신 조절 티로신 인산가수분해효소를 생성하기 위한 중요한 단계를 자세히 설명합니다. 설명된 프로토콜은 Shp2에 최적화되어 있으며 개별 인산가수분해효소의 특정 특성에 맞게 추가 수정이 필요할 수 있습니다.
   1. Shp2의 촉매 활성이 내인성 메커니즘이 아닌 라파마이신에 의해 순전히 제어되도록 하려면 인산가수분해효소에 돌연변이를 도입하여 구성적으로 활성화된 형태로 유지합니다. Shp2의 경우 D61A 돌연변이를 도입합니다.
      참고: 특정 PTPase에 대해 활성화 돌연변이가 도입되지 않은 경우 해당 RapR 변이체는 내인성 신호 및 라파마이신에 의해 조절되는 AND 개폐 시스템으로 기능합니다.
   2. 앞서 설명한 대로 선택을 안내하기 위해 결정 구조를 사용하여 인산가수분해효소의 촉매 도메인에서 iFKBP 삽입 부위를 식별합니다¹³. 구조를 사용할 수 없는 경우 Shp2 인산가수분해효소의 촉매 도메인과 아미노산 서열 정렬을 수행하여 삽입 부위를 식별합니다(그림 2A

토론

이 프로토콜은 화학유전학적으로 제어되는 인산가수분해효소의 개발, 특성화 및 응용을 위한 자세한 단계를 제공합니다. RapR-Shp2 도구는 Shp2 촉매 도메인에 삽입된 라파마이신 조절 스위치에 의존합니다. 이 도구의 강점은 인산가수분해효소 활성의 특이성과 엄격한 시간적 제어입니다. 이 도구는 다른 인산가수분해효소에 적용할 수 있으며, 앞서 설명한 RapR-TAP 기술과 결.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690