Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatase의 개발 및 응용

요약

이 프로토콜은 rapamycin-regulated phosphatase의 설계, 생성 및 적용을 설명합니다. 이 방법은 살아있는 세포에서 인산가수분해효소 활성화에 대한 높은 특이성과 엄격한 시간적 제어를 제공합니다.

초록

티로신 인산가수분해효소(Tyrosine phosphatase)는 중요한 생리적 기능을 조절하는 중요한 효소군입니다. 그들은 종종 인간 질병에서 조절되지 않아 생물학적 연구의 주요 대상이됩니다. 인산가수분해효소 활성을 조절할 수 있는 도구는 그 기능을 해부하는 데 도움이 됩니다. 구성적으로 활성화되거나 우세한 음성 돌연변이의 과발현 또는 siRNA를 사용한 하향 조절과 같은 전통적인 접근법은 시간적 제어가 부족합니다. 인산가수분해효소 억제제는 종종 특이성이 낮으며, 연구자들이 인산가수분해효소의 억제에 의해 영향을 받는 과정만을 결정할 수 있도록 합니다.

우리는 화학유전학적 접근법인 라파마이신 조절(RapR) 시스템을 개발했으며, 이는 인산가수분해효소 활성화의 엄격한 시간적 제어를 가능하게 하는 인산가수분해효소 촉매 도메인의 알로스테릭 조절을 가능하게 합니다. RapR 시스템은 인산가수분해효소의 알로스테릭 부위에 삽입된 iFKBP 도메인으로 구성됩니다. RapR 영역의 고유한 구조 역학은 촉매 영역을 파괴하여 효소의 불활성화를 초래합니다. 라파마이신의 첨가는 iFKBP와 공동 발현된 FRB 단백질 사이의 복합체 형성을 매개하여 iFKBP를 안정화하고 인산가수분해효소의 촉매 도메인에 활성을 복원합니다.

이 시스템은 살아있는 세포에서 인산가수분해효소 활성화에 대한 높은 특이성과 엄격한 시간적 제어를 제공합니다. 이 시스템의 고유한 기능을 통해 일시적인 이벤트를 식별하고 인산가수분해효소의 다운스트림에 있는 개별 신호 경로를 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RapR-phosphatase의 개발, 생화학적 특성화, 다운스트림 신호 전달 및 세포 형태역학 조절에 미치는 영향 분석을 위한 지침을 설명합니다. 또한 단백질 엔지니어링 전략, 인산가수분해효소 활성을 분석하는 in vitro assay, 세포 형태의 변화를 식별하는 live cell imaging 실험에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

서문

단백질 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase)는 과다한 세포 신호 전달 사건에 관여하는 중요한 단백질군입니다. 그들은 세포 증식, 이동 및 세포 사멸 ^1,2,3의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 결과적으로, 단백질 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase)의 조절 장애는 쇠약하게 하는 다양한 질병 및 장애를 유발한다 4,5,6,7. 티로신 인산가수분해효소의 생리학적 기능과 이러한 병리학의 발달에 대한 그들의 역할을 연구하는 것은 역사적으로 인산가수분해효소 신호전달의 복잡성을 조사하는 데 필요한 도구의 부족으로 인해 방해를 받아왔다⁸.

전통적으로 인산가수분해효소는 원하는 특이성을 갖지 못하거나 활성에 대한 시간적 제어를 제공하지 않는 방법을 사용하여 연구됩니다. 사용 가능한 도구의 이러한 중요한 한계로 인해 신호 전달 경로에서 인산가수분해효소의 특정 역할을 분석하는 것이 어렵습니다. 구성적으로 활성화되고 우세한 음성 돌연변이의 과발현 또는 인산가수분해효소 발현의 하향조절은 특이성을 제공하지만 시간적 제어가 부족하고 종종 효소의 실제 기능을 가리는 보상 메커니즘을 유발할 수 있습니다.

약리억제제는 인산가수분해효소의 시간적 조절을 가능하게 합니다. 그러나 많은 인산가수분해효소 억제제는 티로신 인산가수분해효소(tyrosine phosphatase)에서 활성 부위의 조성이 잘 보존되어 있기 때문에 비특이적인 것으로 악명이 높다⁹. 또한, 설계 제약으로 인해 촉매 부위를 표적으로 하는 억제제는 세포막 투과성이 불량하다¹⁰. 억제제의 또 다른 한계는 인산가수분해효소 불활성화(phosphatase inactivation)의 효과에 대한 검사만을 허용한다는 점이다¹¹. 따라서, 인산가수분해효소의 특정적이고 시간적으로 조절 가능한 활성화를 가능하게 하는 도구가 필요합니다. 이러한 도구를 통해 연구자들은 인산가수분해효소 활성화의 직접적인 효과를 식별할 수 있으며, 종종 생물학적 자극에 의해 활성화되는 여러 병렬 신호 캐스케이드로부터 이를 분리할 수 있습니다. 중요한 것은, 활동의 엄격한 시간적 통제를 통해 인산가수분해효소에 의해 유도된 일시적인 사건을 식별할 수 있고 급성 및 장기간의 인산가수분해효소 활성의 영향을 분리할 수 있다는 것입니다. 시간적 조절과 돌연변이 분석을 결합하면 인산가수분해효소의 개별 영역의 특정 역할을 자세히 해부하고 그 다운스트림 신호전달을 조사할 수 있다¹².

기존 도구에서 원하는 기능의 부족을 해결하기 위해 Karginov 그룹은 Rapamycin Regulated (RapR) 시스템 13,14,15를 개발했습니다. RapR 시스템은 관심 단백질(POI)의 알로스테릭 조절을 가능하게 하는 엔지니어링된 스위치 도메인인 iFKBP를 활용합니다. POI의 촉매 부위에 알로스테릭하게 결합된 위치에 iFKBP 도메인을 삽입하면 라파마이신에 의한 조절에 취약해집니다. 라파마이신이 없는 경우, iFKBP는 본질적으로 높은 iFKBP의 높은 구조 역학으로 인해 촉매 부위를 파괴하여 POI를 비활성화합니다. 라파마이신의 첨가는 iFKBP와 동시 발현 단백질 FRB의 상호작용을 유도합니다(그림 1). 이로 인해 스위치 도메인이 안정화되어 결과적으로 POI의 촉매 도메인의 구조와 기능이 복원됩니다. 따라서 이 도구를 사용하면 POI를 구체적이고 임시로 조정할 수 있습니다.

그림 1: RapR-Shp2 라파마이신 조절 시스템의 개략도. RapR은 라파마이신을 첨가하여 관심 단백질의 알로스테릭 활성화를 가능하게 합니다. 이 그림은 Fauser et ^al.12에서 수정되었습니다. 약어: iFKBP = 삽입 가능한 FKBP12; FRB = FKBP-라파마이신 결합 도메인; R = 라파마이신; Shp2 = Src 상동성-2 도메인 함유 단백질 티로신 인산가수분해효소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

RapR 도구는 다양한 단백질군에 적용할 수 있습니다. 그것은 단백질 키나아제뿐만 아니라 phosphatases^12,14를 통제하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 Shp2 인산가수분해효소를 제어하기 위한 RapR 도구의 적용에 중점을 둡니다. Shp2는 증식, 이동, 면역 조절 및 분화와 같은 신호 전달 과정에 관여하는 유비쿼터스 방식으로 발현되는 단백질 티로신 인산가수분해효소입니다 1,16,17,18. Shp2의 조절 장애는 여러 고형암, 골수성 백혈병 및 발달 장애와 관련이 있습니다 ^5,7. 그러나 Shp2는 위에서 설명한 것과 동일한 도구 단점의 희생양이 되었습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 구체적이고 시간적으로 조절 가능한 Shp2 구조체인 RapR-Shp2가 개발되고 특성화되었다¹².

RapR-Shp2의 개발 이전에, Shp2가 세포 이동에 관여하는 것이 알려졌다 19,20,21. 그러나 이 과정과 관련된 신호에서 구체적인 역할은 알려지지 않았습니다. 또한 Shp2가 세포의 이동을 조절하는 시간 척도와 활성화의 다른 시점에서 유도하는 특정 형태 역학적 변화가 무엇인지도 알려지지 않았습니다. 또한, Shp2의 급성 및 장기간의 활성화가 다른 효과를 일으키는지 여부가 불분명했다. RapR-Shp2를 사용하여 Shp2의 급성 활성화가 일시적인 세포 확산, 돌출부 증가, 세포 분극 및 이동을 유도하는 것으로 나타났습니다. 뚜렷한 형태역학적 변화를 조절하는 Shp2의 하류에 있는 특정 경로도 확인되었다¹². 이 프로토콜은 RapR-Shp2의 설계 및 특성화에 대한 세부 정보를 제공하며, 이는 다른 RapR 인산가수분해효소의 개발 및 응용을 안내하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. RapR-phosphatase의 설계

1. 계획
   참고: RapR-Shp2를 예로 들면, 이 프로토콜은 라파마이신 조절 티로신 인산가수분해효소를 생성하기 위한 중요한 단계를 자세히 설명합니다. 설명된 프로토콜은 Shp2에 최적화되어 있으며 개별 인산가수분해효소의 특정 특성에 맞게 추가 수정이 필요할 수 있습니다.
   1. Shp2의 촉매 활성이 내인성 메커니즘이 아닌 라파마이신에 의해 순전히 제어되도록 하려면 인산가수분해효소에 돌연변이를 도입하여 구성적으로 활성화된 형태로 유지합니다. Shp2의 경우 D61A 돌연변이를 도입합니다.
      참고: 특정 PTPase에 대해 활성화 돌연변이가 도입되지 않은 경우 해당 RapR 변이체는 내인성 신호 및 라파마이신에 의해 조절되는 AND 개폐 시스템으로 기능합니다.
   2. 앞서 설명한 대로 선택을 안내하기 위해 결정 구조를 사용하여 인산가수분해효소의 촉매 도메인에서 iFKBP 삽입 부위를 식별합니다¹³. 구조를 사용할 수 없는 경우 Shp2 인산가수분해효소의 촉매 도메인과 아미노산 서열 정렬을 수행하여 삽입 부위를 식별합니다(그림 2A). 삽입 부위가 촉매 포켓에 구조적으로 결합되지만 iFKBP에 의한 기판 결합의 입체 장애를 방지하기 위해 포켓에서 멀리 떨어진 유연한 루프에 위치하는지 확인합니다.
      참고: 삽입에 대한 자세한 내용은 토론에서 설명합니다.
   3. 삽입된 iFKBP 도메인과 관심 인산가수분해효소 사이에 사용할 링커 서열의 유형을 고려합니다. 최적의 링커 시퀀스를 선택하는 것은 RapR 도구의 성공에 매우 중요하며 논의에서 자세히 논의됩니다(그림 2B).

그림 2: RapR-phosphatase 설계 시 고려 사항 개략도. (A) Shp2(보라색), PTP1B(녹색) 및 PTP-PEST(분홍색)를 보존된 삽입 부위와 정렬한 모습. (B) Shp2와 iFKBP 사이의 링커 삽입 표현. (C) 삽입 부위가 파란색으로 표시된 베이지색의 Shp2의 인산가수분해효소 도메인. 이 그림은 Fauser et ^al.12에서 수정되었습니다. 약어 : Shp2 = Src homology-2 도메인 함유 단백질 티로신 인산 가수분해 효소; iFKBP = 삽입 가능한 FKBP12; PTP = 단백질 티로신 인산가수분해효소; RapR = 라파마이신 조절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. RapR-phosphatase의 생성

1. 변형된 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 관심 인산가수분해효소에 iFKBP 삽입
   1. PCR을 통해 iFKBP 인코딩 "메가프라이머"를 생성합니다.
      1. iFKPB의 5' 또는 3' 말단에 어닐링하는 20-25개의 뉴클레오티드, iFKPB를 관심 인산가수분해효소에 연결하는 링커 서열, 삽입 부위에 해당하는 28-32개의 뉴클레오티드를 포함하는 "메가프라이머" 합성을 위한 입문서를 설계합니다(그림 3). 생성된 제품에 관심 인산가수분해효소의 삽입 부위 전후에 어닐링되는 단편이 측면에 있는 iFKPB가 포함되어 있는지 확인합니다.
      2. PCR을 통해 "메가프라이머"를 함유한 iFKBP를 합성합니다(5x 중합효소 완충액 10μL, iFKBP를 함유한 50ng/μL 템플릿 DNA 1μL, 10mM dNTP 2μL, 각 "메가프라이머" 프라이머[정방향 및 역방향], 물 35μL, DNA 중합효소 1μL)의 100μM 스톡 0.5μL). PCR을 실행하기 전에 이 PCR 반응을 2개의 개별 25μL 반응으로 분할합니다. DNA 중합효소 제조업체의 권장 사항 또는 다음 표준 PCR 주기에 따라 PCR 주기를 실행합니다: (i) 2분 동안 98°C, (ii) 30초 동안 98°C, (iii) 30초 동안 55-70°C, (iv) 30초 동안 72°C, (v) 2분 동안 ii-iv 25x, (vi) 72°C 단계를 반복합니다.
      3. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 "메가프라이머"를 정제합니다. 이전 단계의 PCR 내용물을 1% 아가로스 겔에 로드하고 약 30분 동안 120V를 적용합니다. 겔에서 400개의 뉴클레오티드 길이의 "메가프라이머"를 찾아 단편을 절제하고 겔 추출 키트를 사용하여 정제합니다( 재료 표 참조).
         참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   2. 변형된 부위 지정 돌연변이 유발
      1. 관심 인산가수분해효소의 유전자를 템플릿으로 포함하는 플라스미드를 사용하여 변형된 부위 지정 돌연변이 유발 반응을 준비합니다(5x 중합효소 완충액 5μL, 50ng/μL 템플릿 2μL, 10mM dNTP 2μL, 추출된 "메가프라이머" 10μL, 물 2.5μL, DMSO 2.5μL, DNA 중합효소 1μL).
         참고: 반응 혼합물에 DMSO를 첨가하면 어닐링 온도(²²)가 낮아집니다.
      2. 98°C에서 3분 동안 초기 변성 단계를 실행한 후 98°C에서 30초 동안, 65°C에서 20초 동안, 60°C에서 20초 동안, 55°C에서 20초 동안, 50°C에서 20초 동안, 72°C에서 18분 동안 18 사이클의 연속 배양 단계를 실행합니다. 밤새 사이클을 실행하십시오(사이클 시간은 7시간). 사이클이 완료되면 PCR 반응을 4°C에서 보관합니다.
         참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
      3. 주기 완료 후 1μL의 DpnI 효소를 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
         참고: DpnI 는 잔류 템플릿을 소화하여 새로 합성된 제품의 수율을 증가시킵니다.
      4. 제조사의 지침에 따라 분해된 산물을 DH5α 유능한 세포로 변환하십시오. 선택을 위한 적절한 항생제(pcDNA RapR-Shp2 구조체의 경우 카베니실린)로 LB 한천 플레이트의 형질전환을 플레이트화합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 콜로니가 성장하면 LB 플레이트를 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
         참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
2. RapR-phosphatase를 함유하는 원하는 DNA 구조체의 분리
   1. 세균 집락의 PCR 스크리닝 수행²³. LB 플레이트에서 성장한 모든 콜로니가 원하는 플라스미드를 포함하는 것은 아니므로 플라스미드 DNA를 분리하기 전에 스크리닝해야 합니다.
      참고: 템플릿과 iFKBP 유전자에 어닐링할 스크린에 프라이머를 사용하십시오. 스크리닝은 Taq 중합효소 마스터믹스를 사용하여 수행할 수 있습니다(재료 표 참조).
   2. 양성 콜로니가 확인되면 적절한 항생제를 포함한 LB 육수 3mL에 양성 콜로니 하나를 접종하고 배양한 후 37°C에서 밤새 흔들어 줍니다.
   3. plasmid DNA extraction kit에 대한 제조업체의 지침에 따라 액체 배양액에서 plasmid DNA를 추출합니다( 재료 표 참조).
      참고: in vitro 평가를 계속하기 전에 새로 생성된 RapR PTPase 구조체의 염기서열을 분석하는 것이 권장됩니다.

그림 3: primer design 및 modified site-directed mutagenesis cloning 전략의 개략도. 1단계는 "끈적끈적한 말단"이 있는 "메가프라이머"를 함유하는 iFKBP를 관심 인산가수분해효소의 삽입 부위에 어닐링하는 것이고, 2단계는 "메가프라이머"를 관심 인산가수분해효소에 삽입하는 것입니다. 이 그림은 Karginov et ^al.13에서 수정되었습니다. 약어: iFKBP = 삽입 가능한 FKBP12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. in vitro activity assay에 의한 RapR-PTPase 평가

참고: 이 프로토콜은 엔지니어링된 RapR-PTPase의 활동 조절을 평가하는 데 사용됩니다. 아래는 팍실린의 인산화된 N-말단 단편을 기질로 사용하여 면역침전된 Shp2의 분석을 설명합니다. 관심있는 특정 PTPase에 대해 다른 기판을 선택해야 할 수 있습니다.

1. 1일차
   1. L-글루타민 보충제(최종 농도 2mM) 및 부피 기준 10% FBS가 보충된 DMEM 배지의 6웰 조직 배양 플레이트에서 800,000 HEK293T 세포/웰을 플레이트합니다. 37 °C 및 5 % CO₂ 인큐베이터에 밤새 넣습니다.
2. 2일차
   1. 세포가 ~60–80% 합류하면 선호하는 transfection regent 제조업체의 프로토콜에 따라 세포를 transfection합니다( 재료 표 참조).
      1. transfection 프로토콜의 예: 200 μL의 무혈청 DMEM 및 6 μL의 transfection 시약에 1 μg의 plasmid DNA(pcDNA-mCherry-FRB 및 pcDNA-flag-RapR-Shp2)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 세포 웰당 100μL의 transfection 혼합물을 추가합니다. 구성적으로 활성화되고 우세한 음성 Shp2 구조체로 transfection된 샘플을 대조군으로 포함합니다. 37 °C 및 5%_CO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
3. 3일차
   1. Protein-G 세파로스의 제조
      알림: Sepharose를 취급하기 전에 절단된 피펫 팁을 준비하십시오. 절단 팁은 Sepharose를 취급하는 모든 단계에서 사용해야 합니다. Sepharose는 피펫팅 전에 모든 단계에서 철저하게 재현탁되어야 합니다.
      1. 재현탁하여 적당량의 Protein-G Sepharose를 1.5mL 튜브에 넣습니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 대해 10μL의 Protein-G Sepharose를 사용합니다. 전체 6웰 플레이트의 경우 60μL의 세파로스를 사용합니다.
      2. 1mL의 용해 완충액으로 세파로스를 세척합니다( 재료 표 참조). 2,000 × g 에서 1분 동안 마이크로 원심분리기를 하고 용해 완충액을 조심스럽게 제거합니다. 2회 반복합니다.
      3. 380 μL의 용해 완충액에 세파로스를 재현탁시킵니다. 최종 농도에 BSA 1 mg/mL 및 항체(각 IP 샘플당 0.5 μL, anti-Flag 항체[ 재료 표 참조])를 추가합니다. 4°C에서 1.5시간 동안 로테이터를 반전시킵니다.
         참고: 항체의 최적 양은 사용된 각 항체에 대해 실험적으로 결정해야 합니다.
   2. 면역침전을 위해 세포를 준비합니다.
      1. 최종 농도 1μM에 적절한 양의 라파마이신(에탄올 내 1mM 원액)을 추가하거나 동일한 부피의 에탄올(음성 대조군)을 샘플에 추가합니다. 37 °C 및 5%_CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
      2. 세포가 있는 6웰 플레이트를 얼음 위에 놓고 3mL의 차가운 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. PBS를 흡입하고 300μL의 Lysis Buffer(활성 인산가수분해효소 샘플의 경우 1μM rapamycin 또는 음성 대조군 샘플의 경우 동등한 용량의 에탄올 포함)를 추가하고 세포 스크레이퍼로 긁어냅니다. 시료를 1.5mL 튜브로 옮기고 4°C에서 1,000× g 으로 10분 동안 마이크로 원심분리기를 사용합니다.
      3. 상층액 20μL를 새 1.5mL 튜브에 전달하여 발현 수준을 확인합니다. 발현을 확인하는 데 사용할 각 튜브에 5% β-메르캅토에탄올이 함유된 2x Laemmli 완충액 20μL를 추가하고 95–100°C에서 5분 동안 배양합니다. 3.3.3.3단계에서 면역침전을 위해 나머지 상층액을 사용합니다.
   3. RapR-Shp2의 면역침전
      1. 3.3.1.3 단계에서 Protein-G Sepharose를 세척합니다. 1mL의 용해 완충액으로. 매번 4°C에서 2,000× g 에서 1분 동안 미세 원심분리하고 용해 버퍼를 조심스럽게 흡입합니다. 이 단계를 2번 반복합니다.
      2. 절단 팁을 사용하여 Sepharose를 Lysis Buffer에 재현탁시킵니다(샘플당 50μL, 6웰 플레이트의 경우 300μL의 Lysis Buffer에 재현탁). 현탁액 세파로스 혼합물 50μL를 각 샘플에 대해 별도의 새 1.5mL 튜브에 피펫팅합니다.
         참고: Lysis Buffer 용액에는 Sepharose의 부피로 인해 잔류된 Sepharose가 있습니다.
      3. 3.3.2.3단계에서 준비된 세포의 나머지 상층액을 Sepharose의 각 튜브에 추가합니다. 4°C에서 1.5–2시간 동안 회전합니다.
   4. 인산가수분해효소 활성 분석
      참고: Shp2 기질은 앞서 설명한 키나아제 반응 프로토콜¹²에 따라 구성적으로 활성화된 Src 키나아제를 사용하여 팍실린의 정제된 N-말단 단편을 인산화하여 제조해야 합니다.
      1. 3.3.3.3 단계가 끝날 무렵 phospho-paxillin 용액을 준비합니다. 샘플당 포스포-팍실린 용액(최종 농도 3μg/mL)을 총 이미다졸 완충액 40μL에 추가합니다(재료 표 참조). 활성 RapR-Shp2 샘플에 대한 포스포-팍실린 용액의 부분 표본에 1μM의 최종 농도로 라파마이신을 추가하고 비활성화 샘플에 대한 용액에 등가량의 에탄올을 추가합니다.
      2. 가열 셰이커를 32 °C로 설정합니다.
         알림: 다른 인산가수분해효소는 최적의 활성을 위해 다른 온도가 필요할 수 있습니다.
      3. 3.3.3.3 2x 단계의 샘플과 함께 Sepharose를 0.5mL의 용해 완충액으로 세척합니다(재료 표 참조). 0.5mL의 세척 완충액으로 시료를 2회 세척합니다. 각 완충액에는 활성 샘플의 경우 1μM의 라파마이신이 있어야 하며, 비활성 샘플의 경우 동일한 부피의 에탄올이 있어야 합니다. 최종 세척 후 가능한 한 많은 버퍼를 제거하십시오.
         알림: 이 단계에 도달하면 피펫을 사용하여 최종 완충액의 양을 천천히 조심스럽게 제거하여 Sepharose가 흡입되지 않도록 하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 남은 완충액은 phospho-paxillin의 농도에 영향을 미치고 부정확한 판독으로 이어질 수 있습니다.
      4. 준비된 phospho-paxillin Imidazole Buffer 혼합물 40μL를 라파마이신(rapamycin)과 함께 또는 포함하지 않고 각 샘플에 추가합니다(샘플 따라 다름). 아주 부드럽게 튕겨 섞은 후 즉시 가열 셰이커에 넣고 32°C에서 40분 동안 배양합니다. 가열 셰이커를 최소 1,000rpm으로 설정하여 샘플이 배양 기간 동안 완전히 교반되도록 합니다.
      5. 각 샘플에 40μL의 2x Laemmli Buffer를 첨가하여 반응을 중지합니다. 95–100 °C에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 샘플을 식히십시오.
      6. 각 샘플의 15μL(3.3.2.3단계의 용해물 샘플 포함)를 4–15% 그래디언트 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로드하고 PVDF 멤브레인을 사용하여 표준 웨스턴 블롯 프로토콜을 실행합니다.
      7. 항-플래그 항체를 사용하여 RapR-Shp2 구조를 검출하고, 항-mCherry를 사용하여 mCherry-FRB를 검출하고, 항-pY118 또는 항-pY31 팍실린을 사용하여 팍실린 인산화를 검출합니다.
         참고: 결과 웨스턴 블롯은 그림 4와 유사해야 합니다.

4. 살아있는 세포의 RapR-Shp2 활성 분석

참고: 이 프로토콜은 RapR-Shp2가 내인성 기판을 탈인산화하고 다운스트림 신호 처리를 유도하는 능력을 결정하는 데 사용됩니다. 다른 RapR-PTPase는 특정 기질 및 경로에 대한 분석이 필요합니다.

1. 1일차
   1. 198,000% FBS 및 L-글루타민(최종 농도 2mM)이 보충된 DMEM 배지의 6웰 조직 배양 플레이트에 있는 10개의 A431 세포/웰을 플레이트합니다. 37 °C 및 5 % CO₂ 인큐베이터에 밤새 넣습니다.
2. 2일차
   1. RapR-Shp2 및 FRB를 발현하는 아데노바이러스 구조체로 세포를 감염시켜 아데노바이러스를 이미 접시에 있는 배지에 직접 첨가합니다. 아데노바이러스를 37°C와 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 그대로 두십시오. FRB에 감염된 세포는 음성 대조군으로만 사용하십시오.
      참고: 아데노바이러스의 양은 역가에 따라 사례별로 결정해야 합니다.
3. 3일차
   1. 실험 전에 431 시간 동안 0.5 % FBS로 DMEM에서 배양하여 A431 세포를 굶깁니다.
   2. 라파마이신을 최종 농도 1μM 또는 동일한 부피의 에탄올(음성 대조군)을 2-4시간 동안 세포에 첨가합니다.
      참고: 배양은 다른 인산가수분해효소에 따라 다를 수 있습니다.
   3. 세포가 있는 6웰 플레이트를 얼음 위에 놓고 3mL의 차가운 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. PBS를 흡입하고 300μL의 용해 완충액( 재료 표 참조)을 추가한 다음 셀 스크레이퍼로 세게 긁어냅니다. 시료를 1.5mL 튜브로 옮기고 4°C에서 2,000× g 으로 5분 동안 마이크로 원심분리기를 사용합니다.
   4. 각 샘플의 250 μL를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 250 μL의 2x Laemmli 완충액에 5% β메르캅토에탄올을 넣고 95–100°C에서 5분 동안 배양합니다.
   5. 각 샘플의 25 μL를 4–15% 그래디언트 SDS-PAGE 겔에 로드하고 PVDF 멤브레인을 사용하여 표준 웨스턴 블롯 프로토콜을 실행합니다.
   6. 항-pY992 EGFR 및 항-pY783 PLCγ 항체를 사용하여 EGFR 및 PLCγ의 RapR-Shp2 매개 탈인산화를 평가합니다. pT202/pY204 잔기에 대한 인산화를 평가하여 MAP kinase Erk1/2의 다운스트림 활성화를 평가합니다.
      참고: 결과 웨스턴 블롯은 그림 5와 유사해야 합니다.

5. 살아있는 세포 이미징을 사용하여 HeLa 세포에서 RapR-Shp2 활성화에 의해 유도된 형태역학적 변화 분석

참고: 이 프로토콜은 세포 돌출 형성, 세포 확산 및 이동에 대한 RapR-Shp2 활성화의 효과를 결정하는 데 사용됩니다.

1. 1일차
   1. 700,000개의 HeLa 세포를 35mm 세포 배양 접시에 담고 37°C 및 5%_CO2 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 접시에 달라붙도록 합니다(~2–3시간).
   2. 선호하는 transfection 시약 제조업체의 프로토콜에 따라 세포를 transfection합니다( 재료 표 참조).
      1. transfection 프로토콜의 예: 100 μL의 무혈청 DMEM 및 6 μL의 transfection 시약에 0.5 μg의 DNA(pcDNA-mCherry-FRB 및 pcDNA-Venus-RapR-Shp2 플라스미드)를 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다. transfection 혼합물을 세포에 추가하고 37°C 및 5%_CO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. pcDNA-mCherry-FRB로 transfection된 세포는 음성 대조군으로만 사용하십시오.
   3. 37°C에서 1시간 동안 배양하여 라이브 이미징 #1.5 25mm 원형 유리 커버슬립을 피브로넥틴(5mg/L)으로 코팅합니다.
2. 2일차
   1. 코팅된 유리 커버슬립을 PBS로 세척하십시오.
   2. 10% FBS 및 L-글루타민(최종 농도 2mM)이 보충된 DMEM 미디어의 코팅된 유리 커버슬립에 형질주입된 HeLa 세포를 플레이트하여 이미징 4시간 전에 30% 밀도를 달성합니다.
   3. 플레이팅 2시간 후, 플레이트의 배지를 예열된 무혈청 Leibovitz L-15 배지로 2시간 동안 부드럽게 전환합니다.
   4. 제조업체의 프로토콜에 따라 CellMask Deep Red 플라즈마 멤브레인 염색으로 세포를 염색합니다.
   5. 커버슬립을 깨끗한 이미징 셀 챔버에 넣습니다( 재료 표 참조). 예열된 L-15 배지 1mL를 넣고 예열된 미네랄 오일 1mL로 덮어 증발을 방지합니다. 이미징할 때까지 챔버를 37°C로 유지하십시오.
   6. 가열된 스테이지를 사용하여 37°C에서 세포를 이미지화합니다.
      1. RapR 구조체의 이미징을 위한 적절한 채널과 에피형광 이미징을 위한 CellMask를 선택합니다. 이 프로토콜을 따르려면 참조된 40x 대물렌즈( 재료 표 참조)와 다음 필터 세트를 사용하십시오: Venus-RapR-Shp2 이미징용 514/10 여기 및 540/21 방출 필터, mCherry-FRB 이미징용 561/10 여기 및 595/40 방출 필터, CellMask Deep Red 이미징용 640/20 여기 및 655LP 방출 필터. 모든 형광 채널에 대해 multiband polychroic mirror를 사용하십시오( 재료 표 참조).
      2. 4-4.5시간 동안 2분마다 이미지를 캡처합니다.
         참고: 더 빠른 형태역학적 변화는 더 빈번한 수집이 필요합니다.
      3. 이미징 1시간 후 라파마이신을 최종 농도 1μM에 첨가하여 RapR-Shp2를 자극합니다.

6. 이미지 분석

참고: 이 프로토콜은 를 기반으로 하는 셀 마스크 생성에 대해 설명합니다. 실시간 이미징 실험에서 수집된 TIF 스택 파일. 그런 다음 ImageJ에서 매크로를 만들어 마스크를 분석하는 방법을 설명하며, 그 결과 셀 영역의 스프레드시트가 생성되어 시간 경과에 따른 변경 사항을 분석합니다. 마지막으로, Metamorph를 사용하여 세포 돌출 및 수축 활성을 분석합니다.

1. CellGeo 소프트웨어 패키지²⁴의 MovThresh 함수를 사용하여 CellMask 이미지의 이진 마스크를 생성합니다.
2. MovThresh 폴더를 이미지 분석 폴더에 복사합니다.
3. CellMask 또는 기타 멤브레인 마커 채널 이미지를 MovThresh 폴더에 복사합니다.
   1. 단일 위치에서 여러 셀을 이미지화한 경우 MatLab에서 마스크를 만들기 전에 이미지를 잘라 단일 셀만 포함된 파일을 생성하십시오.
4. 디렉터리가 MatLab의 MovThresh 폴더로 올바르게 설정되었는지 확인합니다.
5. MovThresh를 실행합니다.
6. 이미지 스택을 한 번에 하나씩 가져옵니다.
7. Smoothed Curve를 선택한 다음 Rethreshold를 실행합니다.
8. Masks라는 새 폴더에 Mask_Image 번호로 저장합니다.
9. 모든 이미지 스택이 마스크로 변환되면 ImageJ 소프트웨어에서 이미지 스택을 엽니다.²⁵.
   1. ImageJ의 세포 면적 분석
      1. ImageJ에서 모든 마스크 이미지 스택을 엽니다.
      2. Set Measurements(영역 설정)를 조정합니다.
      3. 딸깍 하는 소리 플러그인 | 매크로 | 기록.
      4. 프로세스 | 바이너리 | 이진수로 만듭니다.
         1. 기본 옵션을 선택합니다.
            참고: 매크로를 기록하는 동안 추가 항목을 클릭하지 마십시오. 추가 단계가 포함된 경우 6.9.1.3단계부터 다시 시작하는 것이 좋습니다.
      5. Analyze(분석) | 입자를 분석합니다.
         1. Summary를 제외한 모든 상자를 선택 취소 합니다.
      6. 녹음을 마치고 매크로 만들기 를 클릭합니다.
      7. 각 이미지 스택을 선택한 후 Run for each image stack(각 이미지 스택에 대해 실행 )을 누르고 각 이미지 스택에 대한 결과 테이블을 저장합니다. 기본 옵션은 csv 파일로 저장됩니다.
      8. 매크로를 저장하고 향후 분석에 다시 사용할 수 있습니다(선택 사항).
   2. 스프레드시트에서 영역 데이터 처리
      1. 분석된 각 세포에 대해 rapamycin으로 활성화하기 전에 촬영한 이미지에서 세포 면적을 평균화합니다.
      2. 모든 면적 값을 라파마이신 첨가 전 세포의 평균 면적으로 나눕니다.
      3. 이미징된 모든 셀에 대한 각 시점의 평균값을 계산하고 90% 신뢰 구간을 결정합니다. 데이터를 플로팅합니다.
   3. 세포 돌출 활성 분석
      1. ProActive 폴더를 이미지 분석 폴더에 복사합니다.
      2. MovThresh의 마스킹된 이미지 스택을 새로 생성된 ProActive 폴더로 복사합니다.
      3. MatLab을 열고 디렉터리를 ProActive 폴더로 설정합니다.
      4. ProActive를 실행합니다.
      5. 마스킹된 셀 이미지 스택 파일을 ProActive GUI로 가져옵니다.
      6. 활동 유형을 정의합니다. 돌출 활동 분석은 얻은 영역 데이터를 생성합니다. 후퇴 활동 분석은 면적 손실 데이터를 생성합니다. 총 활동은 전체 면적 변화 데이터(손실 및 이득 모두)를 생성합니다.
      7. 영역을 Define Normalization으로 설정합니다.
      8. 제안된 임계값을 사용하거나 평균을 사용하여 각 시점을 다시 임계값으로 설정하는 부드러운 곡선입니다. 이는 특정 창에 대한 임계값의 평균을 구하여 시점 간 임계값 설정의 불일치를 최소화합니다.
      9. 파일 | 다른 이름으로 저장 | 결과(.mat)
         1. 세 가지 유형의 영역 활동을 모두 처리하는 경우 처리된 데이터 파일의 이름을 ProResultData #, RetResultData # 또는 ResultData #으로 지정합니다.
            참고: 숫자 앞에 공백을 포함하고 1부터 시작하는 데이터에 번호를 매깁니다.
      10. 6.9.3.6단계부터 반복합니다. 가져온 모든 마스킹된 이미지 스택에 대해.
      11. 모든 셀이 처리되면 ProActive GUI를 닫습니다.
      12. Matlab 편집기에서 DataToFileTotalArea 를 열어 총 활동 "ResultData" 파일을 처리합니다.
      13. 생성된 결과 파일 수와 일치하도록 셀 수를 변경합니다. 6.9.3.5–6.9.3.10단계에서 7개의 셀이 처리된 경우 스크립트의 처음 세 줄이 다음과 같은지 확인합니다.
          filename='결과 데이터';
          세포=1:7;
          지연=1;
      14. 실행을 누르고 DataToFileProtArea 및 DataToFileRetArea에 대해 이 작업을 반복하여 각각 돌출 데이터와 철회 데이터를 처리합니다. 이 분석은 "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" 및 "AllCellsRet.txt"라는 세 개의 텍스트 파일을 생성합니다.
      15. 스프레드시트에서 .txt 파일을 열고 섹션 6.9.2와 같이 정규화합니다. 이미징된 모든 셀에 대한 각 시점의 평균값을 계산하고 90% 신뢰 구간을 결정합니다. 데이터를 플로팅합니다.
          참고: 위 단계의 결과 플롯은 그림 6과 유사해야 합니다.

결과

그림 4는 팍실린 기반 인산가수분해효소 활성 분석에서 기대할 수 있는 결과를 보여줍니다. 이 실험에서, 구성적으로 활성화되고 우세한 음성 Shp2 인산가수분해효소 활성을 포스포-팍실린을 판독값으로 사용하여 활성 및 비활성 RapR-Shp2의 활성과 비교하였다. Shp2 작제물을 면역침전시키고, 프로토콜에 기술된 바와 같이 활성 분석을 실시하였다. 구?...

토론

이 프로토콜은 화학유전학적으로 제어되는 인산가수분해효소의 개발, 특성화 및 응용을 위한 자세한 단계를 제공합니다. RapR-Shp2 도구는 Shp2 촉매 도메인에 삽입된 라파마이신 조절 스위치에 의존합니다. 이 도구의 강점은 인산가수분해효소 활성의 특이성과 엄격한 시간적 제어입니다. 이 도구는 다른 인산가수분해효소에 적용할 수 있으며, 앞서 설명한 RapR-TAP 기술과 결...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690