Sviluppo e applicazione di tirosin-fosfatasi regolate dalla rapamicina

Riepilogo

Questo protocollo descrive la progettazione, la creazione e l'applicazione delle fosfatasi regolate dalla rapamicina. Questo metodo fornisce un'elevata specificità e uno stretto controllo temporale dell'attivazione della fosfatasi nelle cellule viventi.

Abstract

Le tirosin-fosfatasi sono un'importante famiglia di enzimi che regolano funzioni fisiologiche critiche. Sono spesso disregolati nelle malattie umane, il che li rende obiettivi chiave degli studi biologici. Gli strumenti che consentono la regolazione dell'attività della fosfatasi sono strumentali alla dissezione della loro funzione. Gli approcci tradizionali, come la sovraespressione di mutanti negativi costitutivamente attivi o dominanti, o la sottoregolazione con siRNA, mancano di controllo temporale. Gli inibitori della fosfatasi hanno spesso una scarsa specificità e consentono solo ai ricercatori di determinare quali processi sono influenzati dall'inibizione della fosfatasi.

Abbiamo sviluppato un approccio chemiogenetico, il sistema regolato dalla rapamicina (RapR), che consente la regolazione allosterica di un dominio catalitico della fosfatasi che consente uno stretto controllo temporale dell'attivazione della fosfatasi. Il sistema RapR è costituito da un dominio iFKBP inserito in un sito allosterico nella fosfatasi. La dinamica strutturale intrinseca del dominio RapR interrompe il dominio catalitico, portando all'inattivazione dell'enzima. L'aggiunta di rapamicina media la formazione di un complesso tra iFKBP e una proteina FRB co-espressa, che stabilizza iFKBP e ripristina l'attività del dominio catalitico della fosfatasi.

Questo sistema fornisce un'elevata specificità e uno stretto controllo temporale dell'attivazione della fosfatasi nelle cellule viventi. Le capacità uniche di questo sistema consentono l'identificazione di eventi transitori e l'interrogazione di singole vie di segnalazione a valle di una fosfatasi. Questo protocollo descrive le linee guida per lo sviluppo di una RapR-fosfatasi, la sua caratterizzazione biochimica e l'analisi dei suoi effetti sulla segnalazione a valle e sulla regolazione della morfodinamica cellulare. Fornisce inoltre una descrizione dettagliata di una strategia di ingegneria proteica, saggi in vitro che analizzano l'attività della fosfatasi ed esperimenti di imaging su cellule vive che identificano i cambiamenti nella morfologia cellulare.

Introduzione

Le proteine tirosina fosfatasi sono una famiglia critica di proteine coinvolte in una pletora di eventi di segnalazione cellulare. È stato dimostrato che svolgono un ruolo chiave nella regolazione della proliferazione cellulare, della migrazione e dell'apoptosi ^1,2,3. Di conseguenza, la disregolazione delle proteine tirosin-fosfatasi porta a una varietà di malattie e disturbi debilitanti 4,5,6,7. Lo studio della funzione fisiologica delle tirosin-fosfatasi e del loro ruolo nello sviluppo di queste patologie è stato storicamente ostacolato dalla mancanza di strumenti necessari per sondare le complessità del segnale della fosfatasi⁸.

Tradizionalmente, le fosfatasi vengono studiate utilizzando metodi che non hanno la specificità desiderata e/o non forniscono un controllo temporale della loro attività. Queste limitazioni critiche degli strumenti disponibili rendono difficile sezionare ruoli specifici delle fosfatasi nelle vie di segnalazione. La sovraespressione di mutanti negativi costitutivamente attivi e dominanti o la sottoregolazione dell'espressione della fosfatasi forniscono specificità ma mancano di controllo temporale e spesso possono innescare meccanismi compensatori che mascherano la vera funzione dell'enzima.

Gli inibitori farmacologici consentono la regolazione temporale delle fosfatasi. Tuttavia, molti inibitori della fosfatasi sono notoriamente aspecifici a causa della composizione ben conservata del sito attivo nelle tirosin-fosfatasi⁹. Inoltre, a causa di vincoli di progettazione, gli inibitori che prendono di mira il sito catalitico mostrano una scarsa permeabilità della membrana cellulare¹⁰. Un'altra limitazione degli inibitori è che consentono solo l'esame degli effetti dell'inattivazione della fosfatasi¹¹. Pertanto, c'è bisogno di strumenti che consentano l'attivazione specifica e temporalmente regolabile delle fosfatasi. Questi strumenti consentiranno ai ricercatori di identificare gli effetti diretti dell'attivazione della fosfatasi, separandoli da molteplici cascate di segnalazione parallele spesso attivate da stimoli biologici. È importante sottolineare che uno stretto controllo temporale dell'attività consente l'identificazione di eventi transitori indotti da una fosfatasi e separa gli effetti dell'attività fosfatasi acuta e prolungata. La combinazione della regolazione temporale con l'analisi mutazionale consentirà una dissezione dettagliata dei ruoli specifici dei singoli domini della fosfatasi e l'interrogazione del suo segnale a valle¹².

Per affrontare la mancanza di capacità desiderate negli strumenti esistenti, il gruppo Karginov ha sviluppato il sistema regolato dalla rapamicina (RapR) 13,14,15. Il sistema RapR utilizza un dominio switch ingegnerizzato, iFKBP, che consente la regolazione allosterica della proteina di interesse (POI). L'inserimento del dominio iFKBP in una posizione allostericamente accoppiata al sito catalitico del POI lo rende suscettibile alla regolazione da parte della rapamicina. In assenza di rapamicina, iFKBP interrompe il sito catalitico a causa della dinamica strutturale intrinsecamente elevata di iFKBP e quindi inattiva il POI. L'aggiunta di rapamicina induce l'interazione di iFKBP con la proteina FRB co-espressa (Figura 1). Ciò provoca la stabilizzazione del dominio di commutazione, che di conseguenza ripristina la struttura e la funzione del dominio catalitico del POI. In quanto tale, lo strumento consente un'attivazione specifica e temporalmente regolabile del POI.

Figura 1: Schema del sistema regolato dalla rapamicina RapR-Shp2. RapR consente l'attivazione allosterica della proteina di interesse con l'aggiunta di rapamicina. Questa cifra è stata modificata da Fauser et ^al.12. Abbreviazioni: iFKBP = inseribile FKBP12; FRB = dominio di legame FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Proteina tirosina fosfatasi contenente il dominio Src omologia-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Lo strumento RapR può essere applicato a diverse famiglie di proteine. Può essere utilizzato per regolare le protein chinasi e le fosfatasi^12,14. Questo protocollo si concentrerà sull'applicazione dello strumento RapR per il controllo della fosfatasi Shp2. Shp2 è una proteina tirosina fosfatasi espressa in modo ubiquitario che è coinvolta in processi di segnalazione come la proliferazione, la migrazione, l'immunomodulazione e la differenziazione 1,16,17,18. La disregolazione di Shp2 è stata associata a una serie di tumori solidi, leucemia mieloide e disturbi dello sviluppo ^5,7. Tuttavia, Shp2 è caduto vittima delle stesse carenze degli strumenti descritte sopra. Per combattere queste limitazioni, è stato sviluppato^{e caratterizzato} RapR-Shp2, un costrutto Shp2 specificamente e temporalmente regolabile.

Prima dello sviluppo di RapR-Shp2, era noto che Shp2 era coinvolto nella migrazione cellulare 19,20,21. Tuttavia, il suo ruolo specifico nella segnalazione coinvolta in questo processo era sconosciuto. Non si sapeva nemmeno su quale scala temporale Shp2 regoli la migrazione delle cellule e quali specifici cambiamenti morfodinamici induca nei diversi momenti della sua attivazione. Inoltre, non era chiaro se l'attivazione acuta e prolungata di Shp2 causerà effetti diversi. Utilizzando RapR-Shp2, è stato riscontrato che l'attivazione acuta di Shp2 induce una diffusione cellulare transitoria, un aumento delle sporgenze, la polarizzazione cellulare e la migrazione. Sono stati identificati anche percorsi specifici a valle di Shp2 che regolano distinti cambiamenti morfodinamici¹². Questo protocollo fornisce dettagli per la progettazione e la caratterizzazione di RapR-Shp2, che possono essere utilizzati per guidare lo sviluppo e l'applicazione di altre fosfatasi RapR.

Protocollo

1. Progettazione delle fosfatasi RapR

1. Pianificazione
   NOTA: Utilizzando RapR-Shp2 come esempio, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi importanti per la creazione di una tirosin-fosfatasi regolata dalla rapamicina. Il protocollo descritto è ottimizzato per Shp2 e potrebbero essere necessarie ulteriori modifiche per adattarsi alle proprietà specifiche delle singole fosfatasi.
   1. Per garantire che l'attività catalitica di Shp2 sia controllata esclusivamente dalla rapamicina e non da meccanismi endogeni, introdurre una mutazione nella fosfatasi per mantenerla in una conformazione costitutivamente attiva. Nel caso di Shp2, introdurre la mutazione D61A.
      NOTA: Se non viene introdotta una mutazione attivante per una specifica PTPasi, la sua variante RapR funzionerà come un sistema AND-dipendente regolato da segnali endogeni e rapamicina.
   2. Identificare i siti di inserzione di iFKBP nel dominio catalitico della fosfatasi utilizzando la struttura cristallina per guidare la selezione come precedentemente descritto¹³. Se una struttura non è disponibile, eseguire l'allineamento della sequenza di amminoacidi con il dominio catalitico della fosfatasi Shp2 per identificare i siti di inserzione (Figura 2A). Assicurarsi che il sito di inserimento si trovi in un anello flessibile strutturalmente accoppiato alla tasca catalitica ma posizionato lontano dalla tasca per evitare l'ostacolo sterico del legame del substrato da parte di iFKBP.
      NOTA: Ulteriori dettagli sull'inserimento sono discussi nella Discussione.
   3. Considerare il tipo di sequenza di linker da utilizzare tra il dominio iFKBP inserito e la fosfatasi di interesse. La scelta della sequenza di linker ottimale è estremamente importante per il successo dello strumento RapR ed è discussa ulteriormente nella discussione (Figura 2B).

Figura 2: Schema delle considerazioni durante la progettazione della RapR-fosfatasi. (A) Allineamento di Shp2 (viola), PTP1B (verde) e PTP-PEST (rosa) con i siti di inserzione conservati evidenziati. (B) Rappresentazione dell'inserzione del linker tra Shp2 e iFKBP. (C) Dominio fosfatasico di Shp2 in beige con siti di inserzione indicati in blu. Questa cifra è stata modificata da Fauser et ^al.12. Abbreviazioni: Shp2 = Proteina tirosina fosfatasi contenente il dominio Src omologia-2; iFKBP = inseribile FKBP12; PTP = proteina tirosina fosfatasi; RapR = Regolato dalla rapamicina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Creazione della RapR-fosfatasi

1. Inserimento di iFKBP nella fosfatasi di interesse mediante mutagenesi sito-specifica modificata
   1. Generare un "megaprimer" con codifica iFKBP tramite PCR.
      1. Progettare primer per la sintesi di "megaprimer" che contengano 20-25 nucleotidi che rianneriscono, all'estremità 5' o 3' di iFKPB, una sequenza linker che collegherà iFKPB alla fosfatasi di interesse e 28-32 nucleotidi corrispondenti al sito di inserzione (Figura 3). Confermare che il prodotto risultante contenga l'iFKPB affiancato da frammenti di ricottura prima e dopo il sito di inserimento nella fosfatasi di interesse.
      2. Sintetizzare l'iFKBP contenente "megaprimer" tramite PCR (10 μL di tampone polimerasi 5x, 1 μL di DNA stampo da 50 ng/μL contenente iFKBP, 2 μL di dNTP da 10 mM, 0,5 μL di uno stock da 100 μM di ciascun primer "megaprimer" [avanti e indietro], 35 μL di acqua, 1 μL di DNA polimerasi). Suddividere questa reazione PCR in 2 reazioni separate da 25 μL prima di eseguire la PCR. Eseguire il ciclo di PCR secondo le raccomandazioni del produttore della DNA polimerasi o il seguente ciclo di PCR standard: (i) 98 °C per 2 minuti, (ii) 98 °C per 30 secondi, (iii) 55-70 °C per 30 secondi, (iv) 72 °C per 30 secondi, (v) ripetere i passaggi ii-iv 25 volte, (vi) 72 °C per 2 minuti.
      3. Purificare il "megaprimer" utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio. Caricare il contenuto della PCR del passaggio precedente in un gel di agarosio all'1% e applicare 120 V per circa 30 minuti. Cerca il "megaprimer" lungo 400 nucleotidi nel gel, asporta il frammento e purifica utilizzando un kit di estrazione del gel (vedi Tabella dei materiali).
         NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   2. Mutagenesi sito-specifica modificata
      1. Preparare la reazione di mutagenesi sito-specifica modificata utilizzando un plasmide contenente come stampo il gene della fosfatasi di interesse (5 μL di tampone polimerasi 5x, 2 μL di stampo 50 ng/μL, 2 μL di dNTP 10 mM, 10 μL di "megaprimer" estratto, 2,5 μL di acqua, 2,5 μL di DMSO, 1 μL di DNA polimerasi).
         NOTA: L'aggiunta di DMSO nella miscela di reazione abbassa la temperatura di ricottura²².
      2. Eseguire il seguente ciclo di PCR: fase iniziale di denaturazione a 98 °C per 3 minuti, seguita da 18 cicli di fasi consecutive di incubazione a 98 °C per 30 s, 65 °C per 20 s, 60 °C per 20 s, 55 °C per 20 s, 50 °C per 20 s, 72 °C per 18 min. Eseguire il ciclo durante la notte (il tempo di ciclo è di 7 ore). Una volta completato il ciclo, conservare la reazione PCR a 4 °C.
         NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
      3. Al termine del ciclo, aggiungere 1 μL di enzima DpnI e incubare a 37 °C per 1 ora.
         NOTA: DpnI digerirà il modello residuo, aumentando la resa del prodotto appena sintetizzato.
      4. Trasformare il prodotto digerito in DH5α cellule competenti seguendo le istruzioni del produttore. Piastra la trasformazione su piastre di agar LB con l'antibiotico appropriato per la selezione (carbenicillina per il costrutto pcDNA RapR-Shp2). Incubare a 37 °C per una notte. Una volta che le colonie sono cresciute, conservare le piastre LB a 4 °C per un massimo di 1 mese.
         NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Isolamento del costrutto di DNA desiderato contenente RapR-fosfatasi
   1. Eseguire uno screening PCR delle colonie batteriche²³. Poiché non tutte le colonie coltivate su una piastra LB conterranno il plasmide desiderato, assicurarsi di eseguire lo screening prima dell'isolamento del DNA plasmidico.
      NOTA: Utilizzare primer per lo schermo che si ridurranno al modello e nel gene iFKBP. Lo screening può essere eseguito utilizzando la mastermix di polimerasi Taq (vedi Tabella dei materiali).
   2. Una volta identificate le colonie positive, inoculare una colonia positiva in 3 ml di brodo LB incluso l'antibiotico appropriato, incubare e agitare a 37 °C per una notte.
   3. Estrarre il DNA plasmidico dalla coltura liquida seguendo le istruzioni del produttore per il kit di estrazione del DNA plasmidico (vedere la Tabella dei materiali)
      NOTA: Si raccomanda di sequenziare il costrutto RapR PTPasi appena creato prima di continuare con la valutazione in vitro .

Figura 3: Schema del design del primer e della strategia di clonazione della mutagenesi sito-specifica modificata. La fase 1 è la sintesi dell'iFKBP contenente "megaprimer" con ricottura di "estremità appiccicose" nel sito di inserzione della fosfatasi di interesse, e la fase 2 è l'inserimento del "megaprimer" nella fosfatasi di interesse. Questa cifra è stata modificata da Karginov et ^al.13. Abbreviazione: iFKBP = inseribile FKBP12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione della RapR-PTPasi mediante saggio di attività in vitro

NOTA: Questo protocollo viene utilizzato per valutare la regolazione dell'attività della RapR-PTPasi ingegnerizzata. Di seguito viene descritta l'analisi di Shp2 immunoprecipitata utilizzando come substrato un frammento N-terminale fosforilato di paxillina. Potrebbe essere necessario selezionare un substrato diverso per una specifica PTPasi di interesse.

1. Giorno 1
   1. Piastra 800.000 HEK293T cellule/pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti in terreno DMEM integrata con integratore di L-glutammina (concentrazione finale di 2 mM) e 10% FBS in volume. Trasferire in un incubatore a 37 °C e 5% CO₂ per una notte.
2. Giorno 2
   1. Una volta che le cellule sono confluenti ~60-80%, trasfettarle secondo il protocollo del produttore del reggente di trasfezione preferito (vedi Tabella dei materiali).
      1. Esempio di protocollo di trasfezione: aggiungere 1 μg di DNA plasmidico (pcDNA-mCherry-FRB e pcDNA-flag-RapR-Shp2, ciascuno) a 200 μL di DMEM privo di siero e 6 μL di reagente di trasfezione e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere 100 μl di miscela di trasfezione per pozzetto di cellule. Includere come controlli campioni trasfettati con costrutti Shp2 costitutivamente attivi e dominanti negativi. Incubare per una notte in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ .
3. Giorno 3
   1. Preparazione della proteina-G sefarosio
      NOTA: Preparare i puntali delle pipette tagliati prima di maneggiare il sefarosio. Le punte tagliate devono essere utilizzate in ogni fase in cui viene maneggiato il Sepharosio. Il sefarosio deve essere accuratamente risospeso in ogni fase prima del pipettaggio.
      1. Risospendere e assumere la quantità appropriata di proteina-G sefarosio in una provetta da 1,5 mL. Per ogni pozzetto in una piastra a 6 pozzetti, utilizzare 10 μL di proteina-G Sefarosio. Per una piastra completa a 6 pozzetti, utilizzare 60 μl di sefarosio.
      2. Lavare il sefarosio con 1 mL di tampone di lisi (vedere la Tabella dei materiali). Microcentrifugare per 1 minuto a 2.000 × g e rimuovere con cura il tampone di lisi. Ripeti 2 volte.
      3. Risospendere il sefarosio in 380 μl di tampone di lisi. Aggiungere BSA a una concentrazione finale di 1 mg/mL e anticorpo (0,5 μL per ciascun campione IP, anticorpo anti-Flag [vedi Tabella dei materiali]). Capovolgere su un rotatore a 4 °C per 1,5 h.
         NOTA: La quantità ottimale di anticorpi deve essere determinata sperimentalmente per ciascun anticorpo utilizzato.
   2. Preparare le cellule per l'immunoprecipitazione.
      1. Aggiungere una quantità appropriata di rapamicina (1 mM di soluzione madre in etanolo) a una concentrazione finale di 1 μM o aggiungere lo stesso volume di etanolo (controllo negativo) ai campioni. Incubare per 1 ora in un incubatore a 37 °C e CO₂ al 5%.
      2. Posizionare la piastra a 6 pozzetti con le cellule sul ghiaccio e lavare delicatamente le cellule con 3 ml di PBS freddo. Aspirare il PBS e aggiungere 300 μL di tampone di lisi (con 1 μM di rapamicina per il campione di fosfatasi attivata o un volume equivalente di etanolo nel campione di controllo negativo) e raschiare con un raschietto cellulare. Trasferire i campioni in provette da 1,5 mL e microcentrifugare per 10 minuti a 1.000 × g a 4 °C.
      3. Trasferire 20 μl di surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL per verificare i livelli di espressione. Aggiungere 20 μl di tampone Laemmli 2x con il 5% di β-mercaptoetanolo in ciascuna provetta da utilizzare per controllare l'espressione e incubare a 95-100 °C per 5 minuti. Utilizzare il surnatante rimanente per l'immunoprecipitazione al punto 3.3.3.3.
   3. Immunoprecipitazione di RapR-Shp2
      1. Lavare la proteina G Sepharose dal passaggio 3.3.1.3. con 1 mL di tampone di lisi. Microcentrifugare per 1 minuto a 2.000 × g a 4 °C ogni volta e aspirare accuratamente il tampone di lisi. Ripetere questo passaggio 2 volte.
      2. Utilizzando le punte tagliate, risospendere il sefarosio nel tampone di lisi (50 μl per campione, quindi per una piastra a 6 pozzetti, risospendere in 300 μl di tampone di lisi). Pipettare 50 μl della miscela di sefarosio in sospensione in una nuova provetta da 1,5 mL separata per ciascun campione.
         NOTA: Ci sarà sefarosio risospeso nella soluzione tampone di lisi rimasta a causa del volume del sefarosio.
      3. Aggiungere il surnatante rimanente dalle cellule preparate dal passaggio 3.3.2.3 in ciascuna provetta di Sepharose. Ruotare a 4 °C per 1,5-2 ore.
   4. Saggio dell'attività della fosfatasi
      NOTA: Il substrato Shp2 deve essere preparato fosforilando il frammento N-terminale purificato di paxillina utilizzando la chinasi Src costitutivamente attiva seguendo il protocollo di reazione chinasica¹² precedentemente descritto.
      1. Verso la fine del passaggio 3.3.3.3, preparare la soluzione di fosfo-paxillina. Per campione, aggiungere una soluzione di fosfo-paxillina (concentrazione finale di 3 μg/mL) a 40 μL di tampone imidazolo totale (vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere rapamicina alla concentrazione finale di 1 μM all'aliquota della soluzione di fosfo-paxillina per campioni di RapR-Shp2 attivati e un volume equivalente di etanolo alla soluzione per campioni non attivati.
      2. Impostare l'agitatore di riscaldamento a 32 °C.
         NOTA: Altre fosfatasi potrebbero richiedere una temperatura diversa per un'attività ottimale.
      3. Lavare 2 volte il sefarosio con i campioni del passaggio 3.3.3.3 con 0,5 mL di tampone di lisi (vedere la tabella dei materiali). Lavare i campioni 2 volte con 0,5 mL di tampone di lavaggio. Ogni tampone deve contenere rapamicina a 1 μM per i campioni attivati o un volume equivalente di etanolo per i campioni non attivati. Rimuovere quanto più tampone possibile dopo il lavaggio finale.
         NOTA: Una volta raggiunto questo passaggio, può essere utile utilizzare una pipetta per rimuovere le quantità finali di tampone lentamente e con attenzione per assicurarsi che il Sepharose non venga aspirato. Qualsiasi tampone residuo influenzerà la concentrazione di fosfo-paxillina e porterà a una lettura imprecisa.
      4. Aggiungere 40 μl della miscela preparata di tampone fosfo-paxillina imidazolo a ciascun campione, con o senza rapamicina (dipendente dal campione). Agitare molto delicatamente per mescolare e mettere immediatamente nell'agitatore riscaldante e incubare per 40 minuti a 32 °C. Impostare l'agitatore di riscaldamento su un minimo di 1.000 giri/min per garantire che il campione sia completamente agitato per tutta la durata dell'incubazione.
      5. Arrestare la reazione aggiungendo 40 μl di tampone Laemmli 2x a ciascun campione. Incubare i campioni a 95-100 °C per 5 minuti. Raffreddare i campioni.
      6. Caricare 15 μl di ciascun campione (compresi i campioni di lisato del passaggio 3.3.2.3.) su un gel di poliacrilammide SDS con gradiente 4-15% ed eseguire un protocollo western blot standard utilizzando membrane PVDF.
      7. Tamponare utilizzando un anticorpo anti-Flag per rilevare il costrutto RapR-Shp2, anti-mCherry per rilevare mCherry-FRB e anti-pY118 o anti-pY31 paxillina per rilevare la fosforilazione della paxillina.
         NOTA: Le macchie occidentali risultanti dovrebbero essere simili alla Figura 4.

4. Analisi dell'attività di RapR-Shp2 in cellule viventi

NOTA: Questo protocollo viene utilizzato per determinare la capacità di RapR-Shp2 di defosforilare substrati endogeni e indurre la segnalazione a valle. Altre RapR-PTPasi richiederanno l'analisi dei loro substrati e percorsi specifici.

1. Giorno 1
   1. Piastra 198.000 cellule/pozzetto A431 in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti in terreno DMEM integrata con il 10% di FBS e L-glutammina (concentrazione finale di 2 mM). Trasferire in un incubatore a 37 °C e 5% CO₂ per una notte.
2. Giorno 2
   1. Infettare le cellule con costrutti adenovirali che esprimono RapR-Shp2 e FRB aggiungendo l'adenovirus direttamente al terreno già presente nella piastra. Lasciare l'adenovirus sulle cellule in un incubatore a 37 °C e CO₂ al 5% per una notte. Utilizzare le cellule infettate da FRB solo come controllo negativo.
      NOTA: Le quantità di adenovirus dovranno essere determinate caso per caso a seconda del titolo.
3. Giorno 3
   1. Affamare le cellule A431 incubandole in DMEM con FBS allo 0,5% per 4 ore prima dell'esperimento.
   2. Aggiungere rapamicina a una concentrazione finale di 1 μM o allo stesso volume di etanolo (controllo negativo) alle cellule per 2-4 ore.
      NOTA: L'incubazione potrebbe essere diversa per altre fosfatasi.
   3. Posizionare la piastra a 6 pozzetti con le cellule sul ghiaccio e lavare delicatamente le cellule con 3 ml di PBS freddo. Aspirare il PBS, aggiungere 300 μl di tampone di lisi (vedere la tabella dei materiali) e raschiare energicamente con un raschietto cellulare. Trasferire i campioni in provette da 1,5 mL e microcentrifugare per 5 minuti a 2.000 × g a 4 °C.
   4. Trasferire 250 μl di ciascun campione in una nuova provetta da 1,5 mL. Aggiungere 250 μl di tampone Laemmli 2x con il 5% di β-mercaptoetanolo e incubare a 95-100 °C per 5 minuti.
   5. Caricare 25 μl di ciascun campione su un gel SDS-PAGE con gradiente 4-15% ed eseguire un protocollo western blot standard utilizzando membrane PVDF.
   6. Valutare la defosforilazione mediata da RapR-Shp2 di EGFR e PLCγ utilizzando anticorpi anti-pY992 EGFR e anti-pY783 PLCγ. Valutare l'attivazione a valle della MAP chinasi Erk1/2 valutando la sua fosforilazione sui residui pT202/pY204.
      NOTA: Le macchie occidentali risultanti dovrebbero essere simili alla Figura 5.

5. Analisi dei cambiamenti morfodinamici indotti dall'attivazione di RapR-Shp2 in cellule HeLa utilizzando l'imaging di cellule vive

NOTA: Questo protocollo viene utilizzato per determinare l'effetto dell'attivazione di RapR-Shp2 sulla formazione di protrusioni cellulari, sulla diffusione cellulare e sulla migrazione.

1. Giorno 1
   1. Piastra 700.000 cellule HeLa in una piastra per coltura cellulare da 35 mm e posizionale in un incubatore a 37 °C e CO₂ al 5%. Lasciare che le cellule aderiscano alla piastra (~2–3 h).
   2. Trasfettare le cellule secondo il protocollo del produttore del reagente di trasfezione preferito (vedere la Tabella dei materiali).
      1. Esempio di protocollo di trasfezione: aggiungere 0,5 μg di DNA (plasmidi pcDNA-mCherry-FRB e pcDNA-Venus-RapR-Shp2, ciascuno) a 100 μL di DMEM privo di siero e 6 μL di reagente di trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule e incubare per una notte in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ . Utilizzare cellule trasfettate con pcDNA-mCherry-FRB solo come controllo negativo.
   3. Rivestire un vetrino coprioggetto rotondo da 25 mm con fibronectina (5 mg/L) per imaging dal vivo #1.5 incubando per 1 ora a 37 °C.
2. Giorno 2
   1. Lavare il vetrino coprioggetto rivestito con PBS.
   2. Piastra delle cellule HeLa trasfettate sul vetrino coprioggetto rivestito in terreno DMEM integrato con FBS al 10% e L-glutammina (concentrazione finale di 2 mM) per ottenere una confluenza del 30% 4 ore prima dell'imaging.
   3. Due ore dopo la piastratura, passare delicatamente il terreno nella piastra al terreno Leibovitz L-15 preriscaldato senza siero per 2 ore.
   4. Colorare le cellule con la colorazione della membrana plasmatica CellMask Deep Red secondo il protocollo del produttore.
   5. Posizionare il vetrino coprioggetti in una camera di imaging pulita (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 1 mL di terreno L-15 preriscaldato e coprire con 1 mL di olio minerale preriscaldato per evitare l'evaporazione. Mantenere la camera a 37 °C fino all'imaging.
   6. Immagine delle celle a 37 °C utilizzando un tavolino riscaldato.
      1. Selezionare i canali appropriati per l'imaging del costrutto RapR e CellMask per l'imaging in epifluorescenza. Per seguire questo protocollo, utilizzare l'obiettivo 40x di riferimento (vedere la Tabella dei materiali) e i seguenti set di filtri: 514/10 di eccitazione e 540/21 per l'imaging Venus-RapR-Shp2, 561/10 di eccitazione e 595/40 per l'imaging mCherry-FRB e 640/20 di eccitazione e 655LP per l'imaging CellMask Deep Red. Utilizzare uno specchio policroico multibanda per tutti i canali fluorescenti (vedi Tabella dei materiali).
      2. Acquisisci immagini ogni 2 minuti per 4-4,5 ore.
         NOTA: I cambiamenti morfodinamici più rapidi richiederanno un'acquisizione più frequente.
      3. Dopo 1 ora di imaging, aggiungere rapamicina a una concentrazione finale di 1 μM per stimolare RapR-Shp2.

6. Analisi delle immagini

NOTA: Questo protocollo descriverà la creazione di maschere cellulari basate su . File stack TIF raccolti da esperimenti di imaging dal vivo. Descriverà quindi come creare una macro in ImageJ per analizzare le maschere, il che si tradurrà in un foglio di calcolo dell'area della cella che viene quindi analizzato per le modifiche nel tempo. Infine, l'attività protrusiva e retrattiva cellulare sarà analizzata utilizzando Metamorph.

1. Genera una maschera binaria di immagini CellMask utilizzando la funzione MovThresh dal pacchetto software^{CellGeo 24}.
2. Copiare la cartella MovThresh nella cartella di analisi delle immagini.
3. Copiate la CellMask o altre immagini del canale del marcatore di membrana nella cartella MovThresh.
   1. Se sono state acquisite più celle in un'unica posizione, ritaglia le immagini per generare file contenenti solo una singola cella prima di creare la maschera in MatLab.
4. Assicurarsi che la directory sia impostata correttamente sulla cartella MovThresh in MatLab.
5. Esegui MovThresh.
6. Importa le pile di immagini una alla volta.
7. Selezionare Curva levigata e quindi eseguire Rethreshold.
8. Salva come numero Mask_Image in una nuova cartella denominata Maschere.
9. Una volta che tutte le pile di immagini sono state convertite in maschere, apritele nel software ImageJ²⁵.
   1. Analisi dell'area cellulare in ImageJ
      1. Aprire tutte le pile di immagini Maschera in ImageJ.
      2. Regolare le misure impostate in base all'area.
      3. Fai clic su Plugin | Macro | Registrazione.
      4. Fare clic su Elabora | Binario | Crea binario.
         1. Selezionare l'opzione predefinita .
            NOTA: Non fare clic su nulla in più durante la registrazione della macro. Se sono inclusi passaggi aggiuntivi, si consiglia di riavviare dal passaggio 6.9.1.3.
      5. Fare clic su Analizza | Analizza le particelle.
         1. Deseleziona tutte le caselle tranne Riepilogo.
      6. Termina la registrazione e fai clic su Crea per creare la macro.
      7. Premi Esegui per ogni pila di immagini dopo averla selezionata e salva la tabella dei risultati per ogni pila di immagini. L'opzione predefinita verrà salvata come file csv.
      8. Salvare la macro e riutilizzarla per analisi future (opzionale).
   2. Elaborazione dei dati dell'area in un foglio di calcolo
      1. Per ogni cellula analizzata, calcolare la media dell'area della cellula dalle immagini scattate prima dell'attivazione con rapamicina.
      2. Dividere tutti i valori dell'area per l'area media della cella prima dell'aggiunta della rapamicina.
      3. Calcola il valore medio per ogni punto temporale per tutte le celle visualizzate e determina gli intervalli di confidenza del 90%. Traccia i dati.
   3. Analisi dell'attività protrusiva cellulare
      1. Copiare la cartella ProActive nella cartella di analisi delle immagini.
      2. Copia le pile di immagini mascherate da MovThresh nella cartella ProActive appena creata.
      3. Aprire MatLab e impostare la directory sulla cartella ProActive.
      4. Eseguire ProActive.
      5. Importare i file dello stack di immagini delle celle mascherate nell'interfaccia utente di ProActive.
      6. Definire il tipo di attività. L'analisi dell'attività protrusiva genererà dati sull'area guadagnata ; l'analisi dell'attività retrattile genererà dati persi nell'area ; e l'attività totale genereranno dati complessivi sui cambiamenti di area (sia persi che guadagnati).
      7. Impostare l'area su Definisci normalizzazione.
      8. Curva smussata utilizzando i valori di soglia suggeriti o utilizzando la media per ridefinire la soglia di ogni punto temporale. In questo modo si calcola la media delle soglie in una finestra specifica, riducendo al minimo le incoerenze nella soglia tra i punti temporali.
      9. Fare clic su File | Salva con nome | Risultati (.mat)
         1. Se si elaborano tutti e tre i tipi di attività area, denominare i file di dati elaborati come segue: ProResultData #, RetResultData # o ResultData #.
            NOTA: Includere lo spazio prima del numero e numerare i dati a partire da 1.
      10. Ripetere dal passaggio 6.9.3.6. per tutte le pile di immagini mascherate importate.
      11. Una volta elaborate tutte le celle, chiudere l'interfaccia grafica di ProActive.
      12. Apri DataToFileTotalArea nell'editor Matlab per elaborare i file "ResultData" dell'attività totale.
      13. Modificare il numero di celle in modo che corrisponda al numero di file di risultati generati. Se nei passaggi da 6.9.3.5 a 6.9.3.10 sono state elaborate 7 celle, assicurarsi che le prime tre righe dello script siano le seguenti:
          filename='Dati dei risultati ';
          celle=1:7;
          ritardo=1;
      14. Premi Esegui e ripeti l'operazione per DataToFileProtArea e DataToFileRetArea per elaborare rispettivamente i dati protrusivi e retrattili. Questa analisi produrrà tre file di testo "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" e "AllCellsRet.txt"
      15. Apri i file .txt in un foglio di calcolo e normalizza come nella sezione 6.9.2. Calcola il valore medio per ogni punto temporale per tutte le celle visualizzate e determina gli intervalli di confidenza del 90%. Traccia i dati.
          NOTA: I grafici risultanti dai passaggi precedenti dovrebbero essere simili alla Figura 6.

Risultati

La Figura 4 mostra i risultati che ci si può aspettare dal saggio di attività della fosfatasi a base di paxillina. In questo esperimento, l'attività costitutivamente attiva e dominante della fosfatasi negativa di Shp2 è stata confrontata con quella di RapR-Shp2 attiva e inattiva utilizzando la fosfo-paxillina come lettura. I costrutti Shp2 sono stati immunoprecipitati e sottoposti al test di attività come descritto nel protocollo. Le letture della fosfo...

Discussione

Questo protocollo fornisce passaggi dettagliati per lo sviluppo, la caratterizzazione e l'applicazione di fosfatasi chemiogeneticamente controllate. Lo strumento RapR-Shp2 si basa su un interruttore regolato dalla rapamicina inserito nel dominio catalitico Shp2. Il punto di forza di questo strumento è la specificità e lo stretto controllo temporale dell'attività della fosfatasi. Lo strumento è applicabile ad altre fosfatasi e, in combinazione con la tecnologia RapR-TAP precedentement...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690