Sviluppo e applicazione di tirosin-fosfatasi regolate dalla rapamicina

Riepilogo

Questo protocollo descrive la progettazione, la creazione e l'applicazione delle fosfatasi regolate dalla rapamicina. Questo metodo fornisce un'elevata specificità e uno stretto controllo temporale dell'attivazione della fosfatasi nelle cellule viventi.

Abstract

Le tirosin-fosfatasi sono un'importante famiglia di enzimi che regolano funzioni fisiologiche critiche. Sono spesso disregolati nelle malattie umane, il che li rende obiettivi chiave degli studi biologici. Gli strumenti che consentono la regolazione dell'attività della fosfatasi sono strumentali alla dissezione della loro funzione. Gli approcci tradizionali, come la sovraespressione di mutanti negativi costitutivamente attivi o dominanti, o la sottoregolazione con siRNA, mancano di controllo temporale. Gli inibitori della fosfatasi hanno spesso una scarsa specificità e consentono solo ai ricercatori di determinare quali processi sono influenzati dall'inibizione della fosfatasi.

Abbiamo sviluppato un approccio chemiogenetico, il sistema regolato dalla rapamicina (RapR), che consente la regolazione allosterica di un dominio catalitico della fosfatasi che consente uno stretto controllo temporale dell'attivazione della fosfatasi. Il sistema RapR è costituito da un dominio iFKBP inserito in un sito allosterico nella fosfatasi. La dinamica strutturale intrinseca del dominio RapR interrompe il dominio catalitico, portando all'inattivazione dell'enzima. L'aggiunta di rapamicina media la formazione di un complesso tra iFKBP e una proteina FRB co-espressa, che stabilizza iFKBP e ripristina l'attività del dominio catalitico della fosfatasi.

Questo sistema fornisce un'elevata specificità e uno stretto controllo temporale dell'attivazione della fosfatasi nelle cellule viventi. Le capacità uniche di questo sistema consentono l'identificazione di eventi transitori e l'interrogazione di singole vie di segnalazione a valle di una fosfatasi. Questo protocollo descrive le linee guida per lo sviluppo di una RapR-fosfatasi, la sua caratterizzazione biochimica e l'analisi dei suoi effetti sulla segnalazione a valle e sulla regolazione della morfodinamica cellulare. Fornisce inoltre una descrizione dettagliata di una strategia di ingegneria proteica, saggi in vitro che analizzano l'attività della fosfatasi ed esperimenti di imaging su cellule vive che identificano i cambiamenti nella morfologia cellulare.

Introduzione

Le proteine tirosina fosfatasi sono una famiglia critica di proteine coinvolte in una pletora di eventi di segnalazione cellulare. È stato dimostrato che svolgono un ruolo chiave nella regolazione della proliferazione cellulare, della migrazione e dell'apoptosi ^1,2,3. Di conseguenza, la disregolazione delle proteine tirosin-fosfatasi porta a una varietà di malattie e disturbi debilitanti 4,5,6,7. Lo studio della fun....

Protocollo

1. Progettazione delle fosfatasi RapR

1. Pianificazione
   NOTA: Utilizzando RapR-Shp2 come esempio, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi importanti per la creazione di una tirosin-fosfatasi regolata dalla rapamicina. Il protocollo descritto è ottimizzato per Shp2 e potrebbero essere necessarie ulteriori modifiche per adattarsi alle proprietà specifiche delle singole fosfatasi.
   1. Per garantire che l'attività catalitica di Shp2 sia controllata esclusivamente dalla rapamicina e non da meccanismi endogeni, introdurre una mutazione nella fosfatasi per mantenerla in una conformazione costitutivame....

Discussione

Questo protocollo fornisce passaggi dettagliati per lo sviluppo, la caratterizzazione e l'applicazione di fosfatasi chemiogeneticamente controllate. Lo strumento RapR-Shp2 si basa su un interruttore regolato dalla rapamicina inserito nel dominio catalitico Shp2. Il punto di forza di questo strumento è la specificità e lo stretto controllo temporale dell'attività della fosfatasi. Lo strumento è applicabile ad altre fosfatasi e, in combinazione con la tecnologia RapR-TAP precedentement.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690