Entwicklung und Anwendung von Rapamycin-regulierten Tyrosinphosphatasen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Design, die Herstellung und die Anwendung von Rapamycin-regulierten Phosphatasen. Diese Methode bietet eine hohe Spezifität und eine enge zeitliche Kontrolle der Phosphataseaktivierung in lebenden Zellen.

Zusammenfassung

Tyrosinphosphatasen sind eine wichtige Familie von Enzymen, die kritische physiologische Funktionen regulieren. Sie sind bei menschlichen Krankheiten oft fehlreguliert, was sie zu wichtigen Zielen biologischer Studien macht. Werkzeuge, die die Regulation der Phosphataseaktivität ermöglichen, sind entscheidend für die Aufschlüsselung ihrer Funktion. Traditionellen Ansätzen, wie z.B. der Überexpression konstitutiv aktiver oder dominanter negativer Mutanten oder der Herunterregulierung mittels siRNA, fehlt es an zeitlicher Kontrolle. Phosphatase-Hemmer haben oft eine schlechte Spezifität und erlauben es den Forschern nur zu bestimmen, welche Prozesse durch die Hemmung der Phosphatase beeinflusst werden.

Wir haben einen chemogenetischen Ansatz entwickelt, das Rapamycin-regulierte (RapR) System, das eine allosterische Regulation einer katalytischen Phosphatasedomäne ermöglicht, die eine enge zeitliche Kontrolle der Phosphataseaktivierung ermöglicht. Das RapR-System besteht aus einer iFKBP-Domäne, die in eine allosterische Stelle in der Phosphatase eingefügt wird. Die intrinsische Strukturdynamik der RapR-Domäne stört die katalytische Domäne, was zur Inaktivierung des Enzyms führt. Die Zugabe von Rapamycin vermittelt die Bildung eines Komplexes zwischen iFKBP und einem co-exprimierten FRB-Protein, der iFKBP stabilisiert und die Aktivität der katalytischen Domäne der Phosphatase wiederherstellt.

Dieses System bietet eine hohe Spezifität und eine enge zeitliche Kontrolle der Phosphatase-Aktivierung in lebenden Zellen. Die einzigartigen Fähigkeiten dieses Systems ermöglichen die Identifizierung transienter Ereignisse und die Abfrage einzelner Signalwege stromabwärts einer Phosphatase. Dieses Protokoll beschreibt Richtlinien für die Entwicklung einer RapR-Phosphatase, ihre biochemische Charakterisierung und die Analyse ihrer Auswirkungen auf die nachgeschaltete Signalübertragung und Regulation der Zellmorphodynamik. Es bietet auch eine detaillierte Beschreibung einer Protein-Engineering-Strategie, In-vitro-Assays zur Analyse der Phosphataseaktivität und Lebendzell-Imaging-Experimente zur Identifizierung von Veränderungen in der Zellmorphologie.

Einleitung

Protein-Tyrosin-Phosphatasen sind eine wichtige Familie von Proteinen, die an einer Vielzahl von zellulären Signalereignissen beteiligt sind. Es wurde gezeigt, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Zellproliferation, -migration und -apoptose spielen ^1,2,3. Folglich führt die Dysregulation von Protein-Tyrosin-Phosphatasen zu einer Vielzahl von schwächenden Krankheiten und Störungen 4,5,6,7. Die Untersuc....

Protokoll

1. Design von RapR-Phosphatasen

1. Planung
   HINWEIS: Am Beispiel von RapR-Shp2 beschreibt dieses Protokoll die wichtigen Schritte zur Erstellung einer Rapamycin-regulierten Tyrosinphosphatase. Das beschriebene Protokoll ist für Shp2 optimiert und es könnten zusätzliche Modifikationen erforderlich sein, um spezifische Eigenschaften einzelner Phosphatasen anzupassen.
   1. Um sicherzustellen, dass die katalytische Aktivität von Shp2 ausschließlich durch Rapamycin und nicht durch endogene Mechanismen gesteuert wird, führen Sie eine Mutation in die Phosphatase ein, um sie in einer konstitutiv aktiven Konformatio....

Diskussion

Dieses Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung chemogenetisch kontrollierter Phosphatasen. Das RapR-Shp2-Tool basiert auf einem Rapamycin-regulierten Schalter, der in die katalytische Shp2-Domäne eingefügt ist. Die Stärke dieses Werkzeugs liegt in der Spezifität und engen zeitlichen Kontrolle der Phosphatase-Aktivität. Das Werkzeug ist auf andere Phosphatasen anwendbar und ermöglicht in Kombination mit der zuvor beschriebenen R.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690