Entwicklung und Anwendung von Rapamycin-regulierten Tyrosinphosphatasen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Design, die Herstellung und die Anwendung von Rapamycin-regulierten Phosphatasen. Diese Methode bietet eine hohe Spezifität und eine enge zeitliche Kontrolle der Phosphataseaktivierung in lebenden Zellen.

Zusammenfassung

Tyrosinphosphatasen sind eine wichtige Familie von Enzymen, die kritische physiologische Funktionen regulieren. Sie sind bei menschlichen Krankheiten oft fehlreguliert, was sie zu wichtigen Zielen biologischer Studien macht. Werkzeuge, die die Regulation der Phosphataseaktivität ermöglichen, sind entscheidend für die Aufschlüsselung ihrer Funktion. Traditionellen Ansätzen, wie z.B. der Überexpression konstitutiv aktiver oder dominanter negativer Mutanten oder der Herunterregulierung mittels siRNA, fehlt es an zeitlicher Kontrolle. Phosphatase-Hemmer haben oft eine schlechte Spezifität und erlauben es den Forschern nur zu bestimmen, welche Prozesse durch die Hemmung der Phosphatase beeinflusst werden.

Wir haben einen chemogenetischen Ansatz entwickelt, das Rapamycin-regulierte (RapR) System, das eine allosterische Regulation einer katalytischen Phosphatasedomäne ermöglicht, die eine enge zeitliche Kontrolle der Phosphataseaktivierung ermöglicht. Das RapR-System besteht aus einer iFKBP-Domäne, die in eine allosterische Stelle in der Phosphatase eingefügt wird. Die intrinsische Strukturdynamik der RapR-Domäne stört die katalytische Domäne, was zur Inaktivierung des Enzyms führt. Die Zugabe von Rapamycin vermittelt die Bildung eines Komplexes zwischen iFKBP und einem co-exprimierten FRB-Protein, der iFKBP stabilisiert und die Aktivität der katalytischen Domäne der Phosphatase wiederherstellt.

Dieses System bietet eine hohe Spezifität und eine enge zeitliche Kontrolle der Phosphatase-Aktivierung in lebenden Zellen. Die einzigartigen Fähigkeiten dieses Systems ermöglichen die Identifizierung transienter Ereignisse und die Abfrage einzelner Signalwege stromabwärts einer Phosphatase. Dieses Protokoll beschreibt Richtlinien für die Entwicklung einer RapR-Phosphatase, ihre biochemische Charakterisierung und die Analyse ihrer Auswirkungen auf die nachgeschaltete Signalübertragung und Regulation der Zellmorphodynamik. Es bietet auch eine detaillierte Beschreibung einer Protein-Engineering-Strategie, In-vitro-Assays zur Analyse der Phosphataseaktivität und Lebendzell-Imaging-Experimente zur Identifizierung von Veränderungen in der Zellmorphologie.

Einleitung

Protein-Tyrosin-Phosphatasen sind eine wichtige Familie von Proteinen, die an einer Vielzahl von zellulären Signalereignissen beteiligt sind. Es wurde gezeigt, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Zellproliferation, -migration und -apoptose spielen ^1,2,3. Folglich führt die Dysregulation von Protein-Tyrosin-Phosphatasen zu einer Vielzahl von schwächenden Krankheiten und Störungen 4,5,6,7. Die Untersuchung der physiologischen Funktion von Tyrosinphosphatasen und ihrer Rolle bei der Entwicklung dieser Pathologien wurde in der Vergangenheit durch einen Mangel an Instrumenten behindert, die für die Untersuchung der Feinheiten der Phosphatase-Signalübertragung erforderlich sind⁸.

Traditionell werden Phosphatasen mit Methoden untersucht, die nicht die gewünschte Spezifität aufweisen und/oder keine zeitliche Kontrolle ihrer Aktivität bieten. Diese kritischen Einschränkungen der verfügbaren Werkzeuge machen es schwierig, die spezifische Rolle von Phosphatasen in Signalwegen zu untersuchen. Die Überexpression konstitutiv aktiver und dominanter negativer Mutanten oder die Herunterregulierung der Expression der Phosphatase sorgen für Spezifität, haben aber keine zeitliche Kontrolle und können oft kompensatorische Mechanismen auslösen, die die wahre Funktion des Enzyms verschleiern.

Pharmakologische Inhibitoren ermöglichen die zeitliche Regulation von Phosphatasen. Viele Phosphatasehemmer sind jedoch aufgrund der gut konservierten Zusammensetzung des aktiven Zentrums in Tyrosinphosphatasen notorisch unspezifisch⁹. Darüber hinaus weisen Inhibitoren, die auf die katalytische Stelle abzielen, aufgrund von Designeinschränkungen eine schlechte Permeabilität der Zellmembran^{auf 10}. Eine weitere Einschränkung von Inhibitoren besteht darin, dass sie nur die Untersuchung der Auswirkungen der Phosphatase-Inaktivierung ermöglichen¹¹. Daher besteht ein Bedarf an Werkzeugen, die eine spezifische, zeitlich regulierbare Aktivierung von Phosphatasen ermöglichen. Diese Werkzeuge werden es den Forschern ermöglichen, die direkten Auswirkungen der Phosphatase-Aktivierung zu identifizieren und sie von mehreren parallelen Signalkaskaden zu trennen, die oft durch biologische Reize aktiviert werden. Wichtig ist, dass eine strenge zeitliche Kontrolle der Aktivität die Identifizierung von vorübergehenden Ereignissen ermöglicht, die durch eine Phosphatase induziert werden, und die Auswirkungen von akuter und anhaltender Phosphataseaktivität trennt. Die Kombination von zeitlicher Regulation und Mutationsanalyse wird es ermöglichen, die spezifischen Rollen einzelner Domänen der Phosphatase detailliert zu entschlüsseln und ihre nachgeschaltete Signalübertragung zu hinterfragen¹².

Um den Mangel an gewünschten Fähigkeiten in den bestehenden Instrumenten zu beheben, hat die Karginov-Gruppe das Rapamycin Regulated (RapR) System 13,14,15 entwickelt. Das RapR-System verwendet eine speziell entwickelte Schalterdomäne, iFKBP, die eine allosterische Regulation des interessierenden Proteins (POI) ermöglicht. Die Insertion der iFKBP-Domäne an einer Position, die allosterisch an die katalytische Stelle des POI gekoppelt ist, macht ihn anfällig für eine Regulation durch Rapamycin. In Abwesenheit von Rapamycin stört iFKBP aufgrund der intrinsisch hohen Strukturdynamik von iFKBP die katalytische Stelle und inaktiviert somit den POI. Die Zugabe von Rapamycin induziert die Interaktion von iFKBP mit dem co-exprimierten Protein FRB (Abbildung 1). Dies bewirkt eine Stabilisierung der Switch-Domäne, wodurch die Struktur und Funktion der katalytischen Domäne des POI wiederhergestellt wird. Damit ermöglicht das Tool eine gezielte und zeitlich einstellbare Aktivierung des POI.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des RapR-Shp2-Rapamycin-regulierten Systems. RapR ermöglicht die allosterische Aktivierung des interessierenden Proteins unter Zugabe von Rapamycin. Diese Abbildung wurde von Fauser et ^al.12 modifiziert. Abkürzungen: iFKBP = insertable FKBP12; FRB = FKBP-Rapamycin-Bindungsdomäne; R = Rapamycin; Shp2 = Src-Homologie-2-Domänen-enthaltendes Protein Tyrosinphosphatase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das RapR-Tool kann auf verschiedene Proteinfamilien angewendet werden. Es kann sowohl zur Regulierung von Proteinkinasen als auch von Phosphatasen verwendet werden^12,14. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Anwendung des RapR-Tools zur Kontrolle der Shp2-Phosphatase. Shp2 ist eine ubiquitär exprimierte Protein-Tyrosinphosphatase, die an Signalprozessen wie Proliferation, Migration, Immunmodulation und Differenzierung beteiligt ist ^1,16,17,18. Eine Dysregulation von Shp2 wurde mit einer Reihe von soliden Krebserkrankungen, myeloischer Leukämie und Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht ^5,7. Shp2 ist jedoch den gleichen Tool-Unzulänglichkeiten zum Opfer gefallen wie oben beschrieben. Um diesen Einschränkungen entgegenzuwirken, wurde mit RapR-Shp2 ein spezifisch und zeitlich regulierbares Shp2-Konstrukt entwickelt und charakterisiert¹².

Vor der Entwicklung von RapR-Shp2 war bekannt, dass Shp2 an der Zellmigration beteiligt ist 19,20,21. Seine spezifische Rolle bei der Signalübertragung, die an diesem Prozess beteiligt ist, war jedoch unbekannt. Es war auch nicht bekannt, auf welcher Zeitskala Shp2 die Wanderung von Zellen reguliert und welche spezifischen morphodynamischen Veränderungen es zu verschiedenen Zeitpunkten seiner Aktivierung hervorruft. Darüber hinaus war unklar, ob eine akute und anhaltende Aktivierung von Shp2 unterschiedliche Effekte hervorruft. Unter Verwendung von RapR-Shp2 wurde festgestellt, dass die akute Aktivierung von Shp2 eine vorübergehende Zellausbreitung, eine Zunahme der Protrusionen, die Zellpolarisation und die Migration induziert. Spezifische Signalwege stromabwärts von Shp2, die unterschiedliche morphodynamische Veränderungen regulieren, wurden ebenfalls identifiziert¹². Dieses Protokoll enthält Details für das Design und die Charakterisierung von RapR-Shp2, die zur Entwicklung und Anwendung anderer RapR-Phosphatasen verwendet werden können.

Protokoll

1. Design von RapR-Phosphatasen

1. Planung
   HINWEIS: Am Beispiel von RapR-Shp2 beschreibt dieses Protokoll die wichtigen Schritte zur Erstellung einer Rapamycin-regulierten Tyrosinphosphatase. Das beschriebene Protokoll ist für Shp2 optimiert und es könnten zusätzliche Modifikationen erforderlich sein, um spezifische Eigenschaften einzelner Phosphatasen anzupassen.
   1. Um sicherzustellen, dass die katalytische Aktivität von Shp2 ausschließlich durch Rapamycin und nicht durch endogene Mechanismen gesteuert wird, führen Sie eine Mutation in die Phosphatase ein, um sie in einer konstitutiv aktiven Konformation zu halten. Im Fall von Shp2 führen Sie die D61A-Mutation ein.
      HINWEIS: Wenn für eine bestimmte PTPase keine aktivierende Mutation eingeführt wird, fungiert ihre RapR-Variante als UND-gesteuertes System, das durch endogene Signale und Rapamycin reguliert wird.
   2. Identifizieren Sie iFKBP-Insertionsstellen in der katalytischen Domäne der Phosphatase unter Verwendung der Kristallstruktur, um die Auswahl zu steuern, wie zuvor beschrieben¹³. Wenn keine Struktur verfügbar ist, führen Sie eine Ausrichtung der Aminosäuresequenz mit der katalytischen Domäne der Shp2-Phosphatase durch, um die Insertionsstellen zu identifizieren (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass sich die Insertionsstelle in einer flexiblen Schleife befindet, die strukturell mit der katalytischen Tasche gekoppelt ist, aber von der Tasche weg positioniert ist, um eine sterische Behinderung der Substratbindung durch iFKBP zu verhindern.
      HINWEIS: Weitere Details zum Einfügen werden in der Diskussion erläutert.
   3. Berücksichtigen Sie die Art der Linkersequenz, die zwischen der eingefügten iFKBP-Domäne und der interessierenden Phosphatase verwendet werden soll. Die Wahl der optimalen Linker-Sequenz ist für den Erfolg des RapR-Tools äußerst wichtig und wird in der Diskussion weiter diskutiert (Abbildung 2B).

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Überlegungen beim Design der RapR-Phosphatase. (A) Ausrichtung von Shp2 (violett), PTP1B (grün) und PTP-PEST (rosa) mit den konservierten Insertionsstellen hervorgehoben. (B) Darstellung der Linkerinsertion zwischen Shp2 und iFKBP. (C) Phosphatasedomäne von Shp2 in Beige mit blau markierten Insertionsstellen. Diese Abbildung wurde von Fauser et ^al.12 modifiziert. Abkürzungen: Shp2 = Src-Homologie-2-Domänen-enthaltendes Protein Tyrosinphosphatase; iFKBP = einführbarer FKBP12; PTP = Protein-Tyrosin-Phosphatase; RapR = Rapamycin-reguliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Entstehung der RapR-Phosphatase

1. Insertion von iFKBP in die interessierende Phosphatase mittels modifizierter ortsgerichteter Mutagenese
   1. Generieren Sie einen iFKBP-kodierenden "Megaprimer" per PCR.
      1. Entwicklung von Primern für die "Megaprimer"-Synthese, die 20-25 Nukleotide enthalten, die bis zum 5'- oder 3'-Ende von iFKPB annealen, eine Linkersequenz, die iFKPB mit der interessierenden Phosphatase verbindet, und 28-32 Nukleotide, die der Insertionsstelle entsprechen (Abbildung 3). Bestätigen Sie, dass das resultierende Produkt das iFKPB enthält, flankiert von Fragmenten, die vor und nach der Insertionsstelle in der interessierenden Phosphatase annealen.
      2. Synthetisieren Sie den iFKBP-haltigen "Megaprimer" mittels PCR (10 μl 5x Polymerase-Puffer, 1 μl 50 ng/μl Matrizen-DNA mit iFKBP, 2 μl 10 mM dNTP, 0,5 μl eines 100 μM Stammes jedes "Megaprimer"-Primers [vorwärts und rückwärts], 35 μl Wasser, 1 μl DNA-Polymerase). Teilen Sie diese PCR-Reaktion in 2 separate 25-μl-Reaktionen auf, bevor Sie die PCR durchführen. Führen Sie den PCR-Zyklus gemäß den Empfehlungen des Herstellers der DNA-Polymerase oder dem folgenden Standard-PCR-Zyklus durch: (i) 98 °C für 2 Minuten, (ii) 98 °C für 30 s, (iii) 55-70 °C für 30 s, (iv) 72 °C für 30 s, (v) Wiederholung der Schritte ii-iv 25x, (vi) 72 °C für 2 Minuten.
      3. Reinigen Sie den "Megaprimer" mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese. Laden Sie den PCR-Inhalt aus dem vorherigen Schritt in ein 1%iges Agarose-Gel und legen Sie ihn ca. 30 Minuten lang auf 120 V. Suchen Sie nach dem 400 Nukleotiden langen "Megaprimer" im Gel, entfernen Sie das Fragment und reinigen Sie es mit einem Gel-Extraktionskit (siehe Materialtabelle).
         HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
   2. Modifizierte ortsgerichtete Mutagenese
      1. Bereiten Sie die modifizierte ortsgerichtete Mutagenesereaktion unter Verwendung eines Plasmids vor, das das Gen der interessierenden Phosphatase als Template enthält (5 μl 5x Polymerase-Puffer, 2 μl 50 ng/μl Template, 2 μl 10 mM dNTP, 10 μl extrahierter "Megaprimer", 2,5 μl Wasser, 2,5 μl DMSO, 1 μl DNA-Polymerase).
         HINWEIS: Durch die Zugabe von DMSO in das Reaktionsgemisch wird die Glühtemperatur^{um 22} gesenkt.
      2. Führen Sie den folgenden PCR-Zyklus durch: erster Denaturierungsschritt bei 98 °C für 3 Minuten, gefolgt von 18 Zyklen aufeinanderfolgender Inkubationsschritte bei 98 °C für 30 s, 65 °C für 20 s, 60 °C für 20 s, 55 °C für 20 s, 50 °C für 20 s, 72 °C für 18 min. Führen Sie den Zyklus über Nacht durch (die Zykluszeit beträgt 7 Stunden). Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, lagern Sie die PCR-Reaktion bei 4 °C.
         HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
      3. Nach Abschluss des Zyklus 1 μl DpnI-Enzym zugeben und 1 h bei 37 °C inkubieren.
         HINWEIS: DpnI verdaut das Rest-Template und erhöht so die Ausbeute des neu synthetisierten Produkts.
      4. Wandeln Sie das verdaute Produkt in DH5α kompetenten Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers um. Plattieren Sie die Transformation auf LB-Agarplatten mit dem geeigneten Antibiotikum zur Selektion (Carbenicillin für das pcDNA RapR-Shp2-Konstrukt). Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Sobald die Bienenvölker gewachsen sind, lagern Sie die LB-Platten bis zu 1 Monat bei 4 °C.
         HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
2. Isolierung des gewünschten DNA-Konstrukts, das RapR-Phosphatase enthält
   1. Es wird ein PCR-Screening der Bakterienkolonien^{durchgeführt 23}. Da nicht alle Kolonien, die auf einer LB-Platte gezüchtet werden, das gewünschte Plasmid enthalten, sollten Sie vor der Isolierung der Plasmid-DNA ein Screening durchführen.
      HINWEIS: Verwenden Sie Primer für den Bildschirm, die an der Vorlage und im iFKBP-Gen geglüht werden. Das Screening kann mit Taq-Polymerase-Mastermix durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).
   2. Sobald positive Kolonien identifiziert sind, inokulieren Sie eine positive Kolonie in 3 ml LB-Bouillon einschließlich des richtigen Antibiotikums, inkubieren und über Nacht bei 37 °C schütteln.
   3. Extraktion der Plasmid-DNA aus der Flüssigkultur gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Plasmid-DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle)
      HINWEIS: Es wird empfohlen, das neu erstellte RapR-PTPase-Konstrukt zu sequenzieren, bevor Sie mit der In-vitro-Evaluierung fortfahren.

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Primer-Designs und der modifizierten ortsgerichteten Mutagenese-Klonierungsstrategie. Schritt 1 ist die Synthese des iFKBP-haltigen "Megaprimers" mit "klebrigen Enden", der an der Insertionsstelle der interessierenden Phosphatase geglüht wird, und Schritt 2 ist die Insertion des "Megaprimers" in die Phosphatase von Interesse. Diese Zahl wurde von Karginov et ^al.13 modifiziert. Abkürzung: iFKBP = insertable FKBP12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Bewertung der RapR-PTPase durch in vitro Aktivitätsassay

HINWEIS: Dieses Protokoll wird verwendet, um die Regulation der Aktivität von technisch hergestellter RapR-PTPase zu bewerten. Im Folgenden wird die Analyse von immunpräzipitiertem Shp2 unter Verwendung eines phosphorylierten N-terminalen Fragments von Paxillin als Substrat beschrieben. Möglicherweise muss für eine bestimmte PTPase von Interesse ein anderes Substrat ausgewählt werden.

1. Tag 1
   1. Platte: 800.000 HEK293T Zellen/Well in einer 6-Well-Gewebekulturplatte in DMEM-Medien, ergänzt mit L-Glutamin-Supplement (Endkonzentration von 2 mM) und 10 Vol.-% FBS. Über Nacht in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ stellen.
2. Tag 2
   1. Sobald die Zellen zu ~60–80 % konfluent sind, transfizieren Sie sie gemäß dem bevorzugten Transfektionsprotokoll des Regent-Herstellers (siehe Materialtabelle).
      1. Beispiel für ein Transfektionsprotokoll: Geben Sie 1 μg Plasmid-DNA (pcDNA-mCherry-FRB und pcDNA-flag-RapR-Shp2) zu 200 μl serumfreiem DMEM und 6 μl Transfektionsreagenz und inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie 100 μl Transfektionsmischung pro Vertiefung der Zellen hinzu. Als Kontrollen sind Proben einzuschließen, die mit konstitutiv aktiven und dominanten negativen Shp2-Konstrukten transfiziert wurden. Über Nacht in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
3. Tag 3
   1. Zubereitung von Protein-G-Sepharose
      HINWEIS: Bereiten Sie die abgeschnittenen Pipettenspitzen vor, bevor Sie Sepharose verwenden. Schnittspitzen sollten bei jedem Schritt verwendet werden, bei dem Sepharose gehandhabt wird. Sepharose muss in jedem Schritt vor dem Pipettieren gründlich resuspendiert werden.
      1. Resuspendieren Sie und geben Sie die entsprechende Menge Protein-G-Sepharose in ein 1,5-ml-Röhrchen. Verwenden Sie für jede Vertiefung in einer 6-Well-Platte 10 μl Protein-G-Sepharose. Für eine volle 6-Well-Platte verwenden Sie 60 μl Sepharose.
      2. Waschen Sie die Sepharose mit 1 mL Lysepuffer (siehe Materialtabelle). Mikrozentrifugieren Sie 1 min lang bei 2.000 × g und entfernen Sie vorsichtig den Lysepuffer. 2x wiederholen.
      3. Resuspendieren Sie die Sepharose in 380 μl Lysepuffer. BSA bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml und Antikörper (0,5 μl für jede IP-Probe, Anti-Flag-Antikörper [siehe Materialtabelle]) zugeben. Auf einem Rotator bei 4 °C 1,5 h invertieren.
         HINWEIS: Die optimale Antikörpermenge sollte für jeden verwendeten Antikörper experimentell bestimmt werden.
   2. Bereiten Sie die Zellen auf die Immunpräzipitation vor.
      1. Es wird eine geeignete Menge Rapamycin (1 mM Stammlösung in Ethanol) bis zu einer Endkonzentration von 1 μM zugegeben oder die gleiche Menge Ethanol (Negativkontrolle) den Proben zugegeben. 1 h in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
      2. Legen Sie die 6-Well-Platte mit den Zellen auf Eis und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 3 mL kaltem PBS. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 300 μl Lysepuffer hinzu (entweder mit 1 μM Rapamycin für die aktivierte Phosphatase-Probe oder einem gleichwertigen Volumen Ethanol in der negativen Kontrollprobe) und kratzen Sie mit einem Zellschaber. Die Proben werden in 1,5-ml-Röhrchen umgefüllt und 10 Minuten lang bei 1.000 × g bei 4 °C mikrozentrifugiert.
      3. Übertragen Sie 20 μl des Überstands in ein neues 1,5-ml-Röhrchen, um die Expressionswerte zu überprüfen. Geben Sie 20 μl 2x Laemmli-Puffer mit 5 % β-Mercaptoethanol in jedes Röhrchen, um die Expression zu überprüfen, und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei 95–100 °C. Den restlichen Überstand für die Immunpräzipitation in Schritt 3.3.3.3 verwenden.
   3. Immunpräzipitation von RapR-Shp2
      1. Waschen Sie die Protein-G-Sepharose aus Schritt 3.3.1.3. mit 1 mL Lysepuffer. Mikrozentrifugieren Sie jeweils 1 min bei 2.000 × g bei 4 °C und aspirieren Sie den Lysepuffer vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
      2. Resuspendieren Sie die Sepharose mit abgeschnittenen Spitzen in Lysepuffer (50 μl pro Probe, also für eine 6-Well-Platte in 300 μl Lysepuffer). Pipettieren Sie 50 μl der suspendierten Sepharosemischung in ein separates neues 1,5-ml-Röhrchen für jede Probe.
         HINWEIS: Aufgrund des Volumens der Sepharose bleibt resuspendierte Sepharose in der Lysepufferlösung übrig.
      3. Der verbleibende Überstand aus den vorbereiteten Zellen aus Schritt 3.3.2.3 wird in jedes Röhrchen Sepharose gegeben. Bei 4 °C für 1,5–2 h drehen.
   4. Phosphatase-Aktivitäts-Assay
      HINWEIS: Das Shp2-Substrat sollte durch Phosphorylierung des gereinigten N-terminalen Fragments von Paxillin unter Verwendung einer konstitutiv aktiven Src-Kinase gemäß dem zuvor beschriebenen Kinase-Reaktionsprotokoll¹² hergestellt werden.
      1. Gegen Ende von Schritt 3.3.3.3 die Phospho-Paxillin-Lösung herstellen. Geben Sie pro Probe Phospho-Paxillin-Lösung (Endkonzentration von 3 μg/ml) zu 40 μl Gesamt-Imidazol-Puffer (siehe Materialtabelle). Rapamycin wird bei aktivierten RapR-Shp2-Proben in einer Endkonzentration von 1 μM zum Aliquot der Phospho-Paxillin-Lösung und bei nicht aktivierten Proben ein entsprechendes Volumen Ethanol in die Lösung gegeben.
      2. Stellen Sie den Heizshaker auf 32 °C ein.
         HINWEIS: Andere Phosphatasen benötigen möglicherweise eine andere Temperatur für eine optimale Aktivität.
      3. Sepharose mit Proben aus Schritt 3.3.3.3 2x mit 0,5 mL Lysepuffer waschen (siehe Materialtabelle). Waschen Sie die Proben 2x mit 0,5 mL Waschpuffer. Jeder Puffer sollte entweder Rapamycin mit 1 μM für aktivierte Proben oder ein gleichwertiges Volumen Ethanol für nicht aktivierte Proben enthalten. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche so viel Puffer wie möglich.
         HINWEIS: Sobald dieser Schritt erreicht ist, kann es hilfreich sein, die letzten Mengen des Puffers mit einer Pipette langsam und vorsichtig zu entfernen, um sicherzustellen, dass keine Sepharose aspiriert wird. Übrig gebliebener Puffer beeinflusst die Konzentration von Phospho-Paxillin und führt zu einer ungenauen Ablesung.
      4. 40 μl des vorbereiteten Phospho-Paxillin-Imidazol-Puffergemisches werden zu jeder Probe mit oder ohne Rapamycin (probenabhängig) gegeben. Zum Mischen ganz vorsichtig schnippen und sofort in den Heizschüttler geben und 40 Minuten bei 32 °C inkubieren. Stellen Sie den Heizschüttler auf mindestens 1.000 U/min ein, um sicherzustellen, dass die Probe für die Dauer der Inkubation vollständig gerührt wird.
      5. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie jeder Probe 40 μl 2x Laemmli Puffer hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei 95–100 °C. Kühlen Sie die Proben.
      6. Laden Sie 15 μl jeder Probe (einschließlich der Lysatproben aus Schritt 3.3.2.3.) auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel mit einem Gefälle von 4 bis 15 % und führen Sie ein Standard-Western-Blot-Protokoll mit PVDF-Membranen durch.
      7. Blot mit einem Anti-Flag-Antikörper zum Nachweis des RapR-Shp2-Konstrukts, Anti-mCherry zum Nachweis von mCherry-FRB und Anti-pY118 oder anti-pY31-Paxillin zum Nachweis der Paxillin-Phosphorylierung.
         HINWEIS: Die resultierenden Western Blots sollten in etwa wie in Abbildung 4 aussehen.

4. Analyse der RapR-Shp2-Aktivität in lebenden Zellen

HINWEIS: Dieses Protokoll wird verwendet, um die Fähigkeit von RapR-Shp2 zu bestimmen, endogene Substrate zu dephosphorylieren und nachgeschaltete Signale zu induzieren. Andere RapR-PTPasen erfordern eine Analyse ihrer spezifischen Substrate und Signalwege.

1. Tag 1
   1. Platte: 198.000 A431-Zellen/Well in einer 6-Well-Gewebekulturplatte in DMEM-Medien, ergänzt mit 10 % FBS und L-Glutamin (Endkonzentration von 2 mM). Über Nacht in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ stellen.
2. Tag 2
   1. Infizieren Sie Zellen mit adenoviralen Konstrukten, die RapR-Shp2 und FRB exprimieren, indem Sie das Adenovirus direkt in die bereits in der Schale befindlichen Medien geben. Lassen Sie das Adenovirus über Nacht in einem 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator auf den Zellen. Verwenden Sie mit FRB infizierte Zellen nur als Negativkontrolle.
      HINWEIS: Die Mengen an Adenoviren müssen von Fall zu Fall in Abhängigkeit vom Titer bestimmt werden.
3. Tag 3
   1. A431-Zellen hungern, indem sie 4 Stunden vor dem Experiment mit 0,5 % FBS in DMEM inkubieren.
   2. Rapamycin in einer Endkonzentration von 1 μM oder dem gleichen Volumen Ethanol (Negativkontrolle) für 2–4 h in die Zellen geben.
      HINWEIS: Die Inkubation kann bei anderen Phosphatasen unterschiedlich sein.
   3. Legen Sie die 6-Well-Platte mit den Zellen auf Eis und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 3 mL kaltem PBS. Aspirieren Sie das PBS, fügen Sie 300 μl Lysepuffer hinzu (siehe Materialtabelle) und kratzen Sie kräftig mit einem Zellschaber. Übertragen Sie die Proben in 1,5-ml-Röhrchen und eine Mikrozentrifuge für 5 min bei 2.000 × g bei 4 °C.
   4. Übertragen Sie 250 μl jeder Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. 250 μL 2x Laemmli Puffer mit 5% β-Mercaptoethanol zugeben und 5 min bei 95–100 °C inkubieren.
   5. Laden Sie 25 μl jeder Probe auf ein SDS-PAGE-Gel mit einem Gradienten von 4–15 % und führen Sie ein Standard-Western-Blot-Protokoll mit PVDF-Membranen durch.
   6. Evaluierung der RapR-Shp2-vermittelten Dephosphorylierung von EGFR und PLCγ unter Verwendung von anti-pY992 EGFR und anti-pY783 PLCγ Antikörpern. Bewertung der nachgeschalteten Aktivierung der MAP-Kinase Erk1/2 durch Bewertung ihrer Phosphorylierung an den pT202/pY204-Resten.
      HINWEIS: Die resultierenden Western Blots sollten in etwa wie in Abbildung 5 aussehen.

5. Analyse morphodynamischer Veränderungen, die durch RapR-Shp2-Aktivierung in HeLa-Zellen induziert werden, mittels Lebendzell-Imaging

HINWEIS: Dieses Protokoll wird verwendet, um die Wirkung der RapR-Shp2-Aktivierung auf die Bildung von Zellvorsprüngen, die Zellausbreitung und die Migration zu bestimmen.

1. Tag 1
   1. 700.000 HeLa-Zellen in eine 35-mm-Zellkulturschale geben und in einen 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator geben. Lassen Sie die Zellen an der Schale haften (~2–3 h).
   2. Transfizieren Sie die Zellen gemäß dem bevorzugten Protokoll des Herstellers von Transfektionsreagenzien (siehe Materialtabelle).
      1. Beispiel für ein Transfektionsprotokoll: Fügen Sie 0,5 μg DNA (pcDNA-mCherry-FRB und pcDNA-Venus-RapR-Shp2-Plasmide) zu 100 μl serumfreiem DMEM und 6 μl Transfektionsreagenz hinzu. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie die Transfektionsmischung in die Zellen und inkubieren Sie sie über Nacht in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ . Verwenden Sie Zellen, die mit pcDNA-mCherry-FRB transfiziert wurden, nur als Negativkontrolle.
   3. Beschichten Sie ein 25 mm rundes Glasdeckglas mit Live Imaging #1.5 mit Fibronektin (5 mg/L), indem Sie es 1 h lang bei 37 °C inkubieren.
2. Tag 2
   1. Waschen Sie das beschichtete Glasdeckglas mit PBS.
   2. Plattieren Sie die transfizierten HeLa-Zellen auf dem beschichteten Glasdeckglas mit DMEM-Medien, die mit 10 % FBS und L-Glutamin (Endkonzentration von 2 mM) ergänzt werden, um 4 h vor der Bildgebung eine Konfluenz von 30 % zu erreichen.
   3. Wechseln Sie das Medium in der Platte zwei Stunden lang vorsichtig für 2 Stunden auf vorgewärmte serumfreie Leibovitz L-15 Medien.
   4. Färben Sie die Zellen mit der Plasmamembranfärbung CellMask Deep Red gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   5. Legen Sie das Deckglas in eine saubere Kammer der Bildgebungszelle (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 1 mL vorgewärmtes L-15-Medium hinzu und bedecken Sie es mit 1 mL vorgewärmtem Mineralöl, um eine Verdunstung zu verhindern. Halten Sie die Kammer bis zur Aufnahme bei 37 °C.
   6. Bilden Sie die Zellen bei 37 °C mit einem beheizten Tisch ab.
      1. Wählen Sie die richtigen Kanäle für die Bildgebung des RapR-Konstrukts und der CellMask für die Epifluoreszenzbildgebung aus. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie das referenzierte 40x-Objektiv (siehe Materialtabelle) und die folgenden Filtersätze: 514/10 Anregungs- und 540/21 Emissionsfilter für die Venus-RapR-Shp2-Bildgebung, 561/10 Anregungs- und 595/40 Emissionsfilter für die mCherry-FRB-Bildgebung und 640/20 Anregungs- und 655LP-Emissionsfilter für die CellMask Deep Red-Bildgebung. Verwenden Sie einen polychroitischen Multiband-Spiegel für alle Fluoreszenzkanäle (siehe Materialtabelle).
      2. Nehmen Sie Bilder alle 2 Minuten für 4–4,5 Stunden auf.
         HINWEIS: Schnellere morphodynamische Änderungen erfordern eine häufigere Erfassung.
      3. Nach 1 Stunde Bildgebung fügen Sie Rapamycin bis zu einer Endkonzentration von 1 μM hinzu, um RapR-Shp2 zu stimulieren.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Erstellung von Zellmasken basierend auf . TIF-Stack-Dateien, die aus Live-Imaging-Experimenten gesammelt wurden. Anschließend wird beschrieben, wie ein Makro in ImageJ erstellt wird, um die Masken zu analysieren, was zu einer Tabelle mit dem Zellbereich führt, die dann auf Veränderungen im Laufe der Zeit analysiert wird. Schließlich wird die protrusive und retraktive Aktivität der Zellen mit Metamorph analysiert.

1. Generieren Sie eine binäre Maske von CellMask-Bildern mit der MovThresh-Funktion aus dem CellGeo-Softwarepaket²⁴.
2. Kopieren Sie den Ordner MovThresh in den Ordner für die Bildanalyse.
3. Kopieren Sie die Bilder des CellMask oder anderer Membranmarker-Kanäle in den Ordner MovThresh.
   1. Wenn mehrere Zellen an einer einzigen Position abgebildet wurden, schneiden Sie die Bilder zu, um Dateien zu generieren, die nur eine einzelne Zelle enthalten, bevor Sie die Maske in MatLab erstellen.
4. Stellen Sie sicher, dass das Verzeichnis korrekt auf den Ordner MovThresh in MatLab eingestellt ist.
5. Führen Sie MovThresh aus.
6. Importieren Sie Bildstapel nacheinander.
7. Wählen Sie "Geglättete Kurve " aus, und führen Sie dann "Schwellenwert zurücksetzen" aus.
8. Speichern Sie Mask_Image Nummer in einem neuen Ordner mit der Bezeichnung Masken.
9. Nachdem alle Bildstapel in Masken konvertiert wurden, öffnen Sie die Bildstapel in der ImageJ-Software²⁵.
   1. Zellflächenanalyse in ImageJ
      1. Öffnen Sie alle Masken-Bildstapel in ImageJ.
      2. Passen Sie die eingestellten Maße an die Fläche an.
      3. Klicken Sie auf Plugins | Makros | Aufzeichnung.
      4. Klicken Sie auf Prozess | Binär | Binär machen.
         1. Wählen Sie die Standardoption aus.
            HINWEIS: Klicken Sie während der Aufzeichnung des Makros nicht auf etwas Extras. Wenn zusätzliche Schritte enthalten sind, wird empfohlen, von Schritt 6.9.1.3 aus neu zu starten.
      5. Klicken Sie auf Analysieren | Partikel analysieren.
         1. Deaktivieren Sie alle Kontrollkästchen außer Zusammenfassung.
      6. Beenden Sie die Aufnahme und klicken Sie auf Erstellen , um das Makro zu erstellen.
      7. Klicken Sie für jeden Image-Stack auf Ausführen , nachdem Sie ihn ausgewählt haben, und speichern Sie die Ergebnistabelle für jeden Image-Stack. Die Standardoption wird als CSV-Datei gespeichert.
      8. Speichern Sie das Makro und verwenden Sie es für zukünftige Analysen (optional).
   2. Verarbeiten von Flächendaten in einer Tabellenkalkulation
      1. Für jede analysierte Zelle wird die Fläche der Zelle anhand von Bildern gemittelt, die vor der Aktivierung mit Rapamycin aufgenommen wurden.
      2. Dividieren Sie alle Flächenwerte durch die durchschnittliche Fläche der Zelle vor Rapamycin addition.
      3. Berechnen Sie den Durchschnittswert für jeden Zeitpunkt für alle abgebildeten Zellen und bestimmen Sie die 90 %-Konfidenzintervalle. Plotten Sie die Daten.
   3. Analyse der protrusiven Aktivität von Zellen
      1. Kopieren Sie den ProActive-Ordner in den Bildanalyse-Ordner.
      2. Kopieren Sie die maskierten Bildstapel aus MovThresh in den neu erstellten ProActive-Ordner.
      3. Öffnen Sie MatLab und legen Sie das Verzeichnis auf den ProActive-Ordner fest.
      4. Führen Sie ProActive aus.
      5. Importieren Sie die Stack-Dateien für maskierte Zellen in die ProActive-GUI.
      6. Definieren Sie die Art der Aktivität. Die Analyse der protrusiven Aktivität generiert Daten über die gewonnene Fläche ; Die Analyse der retraktiven Aktivität generiert Daten über verlorene Flächen ; und "Gesamtaktivität" generiert Daten zur Gesamtflächenänderung (sowohl verloren als auch gewonnen).
      7. Legen Sie den Bereich auf Normalisierung definieren fest.
      8. Glätten Sie die Kurve entweder mit den vorgeschlagenen Schwellenwerten oder mit dem Mittelwert, um jeden Zeitpunkt neu zu schwellenwerten. Dadurch werden die Schwellenwerte über ein bestimmtes Fenster gemittelt, wodurch Inkonsistenzen bei der Schwellenwertvergabe zwischen den Zeitpunkten minimiert werden.
      9. Klicken Sie auf Datei | Speichern unter | Ergebnisse (.mat)
         1. Wenn Sie alle drei Arten von Flächenaktivitäten verarbeiten, benennen Sie die verarbeiteten Datendateien wie folgt: ProResultData #, RetResultData # oder ResultData #.
            HINWEIS: Fügen Sie das Leerzeichen vor die Zahl ein und nummerieren Sie die Daten beginnend bei 1.
      10. Wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 6.9.3.6. für alle importierten maskierten Bildstapel.
      11. Nachdem alle Zellen verarbeitet wurden, schließen Sie die ProActive-GUI.
      12. Öffnen Sie DataToFileTotalArea im Matlab-Editor, um "ResultData"-Dateien für die Gesamtaktivität zu verarbeiten.
      13. Ändern Sie die Anzahl der Zellen so, dass sie der Anzahl der generierten Ergebnisdateien entspricht. Wenn in den Schritten 6.9.3.5 bis 6.9.3.10 7 Zellen verarbeitet wurden, stellen Sie sicher, dass die ersten drei Zeilen des Skripts wie folgt lauten:
          filename='Ergebnisdaten ';
          Zellen = 1:7;
          Verzögerung = 1;
      14. Klicken Sie auf Ausführen , und wiederholen Sie diesen Vorgang für DataToFileProtArea und DataToFileRetArea, um herstehende bzw. zurückziehende Daten zu verarbeiten. Bei dieser Analyse werden drei Textdateien "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" und "AllCellsRet.txt" erstellt
      15. Öffnen Sie die .txt Dateien in einer Tabelle und normalisieren Sie sie wie in Abschnitt 6.9.2. Berechnen Sie den Durchschnittswert für jeden Zeitpunkt für alle abgebildeten Zellen und bestimmen Sie Konfidenzintervalle von 90 %. Plotten Sie die Daten.
          HINWEIS: Die resultierenden Diagramme aus den obigen Schritten sollten in etwa wie in Abbildung 6 aussehen.

Ergebnisse

Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse, die von dem Paxillin-basierten Phosphatase-Aktivitäts-Assay erwartet werden können. In diesem Experiment wurde die konstitutiv aktive und dominante negative Shp2-Phosphatase-Aktivität mit der von aktivem und inaktivem RapR-Shp2 verglichen, wobei Phospho-Paxillin als Messwert verwendet wurde. Die Shp2-Konstrukte wurden immunpräzipitiert und dem Aktivitätsassay unterzogen, wie im Protokoll beschrieben. Die Phospho-Paxilli...

Diskussion

Dieses Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung chemogenetisch kontrollierter Phosphatasen. Das RapR-Shp2-Tool basiert auf einem Rapamycin-regulierten Schalter, der in die katalytische Shp2-Domäne eingefügt ist. Die Stärke dieses Werkzeugs liegt in der Spezifität und engen zeitlichen Kontrolle der Phosphatase-Aktivität. Das Werkzeug ist auf andere Phosphatasen anwendbar und ermöglicht in Kombination mit der zuvor beschriebenen R...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690