Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Yeni anti-HER2 monoklonal antikorlar kullanılarak valide edilmiş bir sandviç ELISA testi sunuyoruz. Bu test, in vitro kültürlenmiş hücrelerden ve kan ve dokular dahil olmak üzere diğer örneklerden hücreye bağlı ve salınan HER2 proteininin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.
İnsan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) iyi bilinen bir kanser belirtecidir. Özellikle meme kanseri ve diğer HER2 eksprese eden kanser türlerinde çok başarılı bir tanı ve tedavi hedefi haline geldi. Klinikte, membrana bağlı reseptörün ekspresyon seviyesini ölçmek için spesifik anti-HER2 antikorlarını kullanan altın standart immünohistokimyasal tanı yöntemleri kullanılmaktadır. Aşırı eksprese eden hücrelerden salınan HER2'nin çözünür hücre dışı alanı (ECD) kanda dolaşır ve reseptörün doku ekspresyonunu yansıtabilir. Dolaşımdaki HER2 proteininin konsantrasyonunu hastalık klinik belirtileri ile ilişkilendirmek için doğru ve doğrulanmış tahlillere ihtiyaç vardır.
Ekibimiz, HER2'nin zara bağlı ve hücrelerden salınan ECD alanının miktar tayini için yeni sandviç enzime bağlı immünosorbent testini (ELISA) geliştirdi ve doğruladı. Test, daha önce geliştirilen HER2'ye özgü iki benzersiz monoklonal antikor kullanır. Kantitasyon aralığı, in vitro kültürlenen kanser hücreleri için beklenen ve 0.5 ng/mL seviyesinde duyarlılık gösteren 1.56-100 ng/mL arasındaki HER2 konsantrasyonunu içerir. Yöntemin tatmin edici tahlil içi ve tahliller arası hassasiyeti ve doğruluğu, hücre kültürü ortamı, serum ve katı tümör dokusu dahil olmak üzere çeşitli biyolojik numune türlerinde HER2 miktar tayini için uygulanabilir olmasını sağlar. Burada, in vitro kültürlenmiş kanser hücreleri tarafından salgılanan ve reseptörle ilişkili olanın kapsamlı bir şekilde belirlenmesine odaklanıyoruz. Makale, çeşitli hücre hatlarını, kanı ve dokuları test etmek için kullanılabilecek HER2 proteininin miktar tayini için adım adım bir protokol sunmaktadır.
Modern terapötiklerin başarısı genellikle tedaviye duyarlı hastaların doğru bir şekilde tanımlanmasına dayanan hassas tıpla ilgilidir1. Bu tedaviler arasında meme, endometriyum, mide, akciğer ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli tümörlerde aşırı eksprese edilen reseptörü hedef alan anti-HER2 ilaçları bulunur. HER2 pozitif kanserli hastalarda, HER2 düşük tip2 dahil olmak üzere, kanıtlanmış faydaları olan çeşitli HER2 hedefleme ajanları mevcuttur. HER2 pozitif durumun doğrulanması, potansiyel yanıt veren hastaların tanımlanması için kritik öneme sahiptir; ancak, özellikle HER2 düşük grubunda bir zorluk olmaya devam ediyor.
Klinik ortamlarda rutin olarak HER2 testi için kullanılan altın standart yöntemler, immünohistokimya (IHC) protein ekspresyonu ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) yaklaşımları ile HER2 gen amplifikasyonunu içerir. Ek olarak, HER2 mRNA ekspresyonu için Oncotype DX testi kullanılır. Bu yöntemler için gerekli olan doku biyopsisi, hastanın uygun tedavi için uygunluğunun belirlenmesini ve tedavilere potansiyel yanıtlarının belirsiz olmasını sağlar. Amerikan Klinik Onkoloji Derneği (ASCO) ve Amerikan Patologlar Koleji (CAP) tarafından test birimleri arasındaki değişkenliği azaltmak için güncellenen 2018 kılavuzlarına rağmen, HER2 uyumu iyileştirilmesi gereken bir konu olmaya devam etmektedir3.
HER2, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesinin bir proto-onkogen üyesidir ve patolojik durumlarda aşırı ekspresyon ve aktivasyon agresif bir sonuca neden olur veya kötü prognoza katkıda bulunur4. HER2, bir sitoplazmik tirozin kinaz ve bir hücre dışı alan (ECD) içeren hücre zarına sabitlenmiş 185 kDa'lık modüler bir proteindir. HER2 ECD, kanda daha fazla dolaşan hücre dışı protein olarak hücre dışı matriks5'e salınmak üzere hücrelerden dökülebilir. Artmış HER2 ekspresyonu, dolaşımdaki ECD'nin daha yüksek seviyesi ile yansıtılabilir, değerli bir prediktif ve prognostik belirteç 6,7, tedavi yanıtının vekil bir belirteci 8 veya anti-HER2 tedavisi9 için uygun hastaları belirlemek için IHC'ye tamamlayıcı bir yöntem olarak sunulabilir. Bununla birlikte, tümör HER2 ekspresyonu ile kandaki reseptörün sistemik seviyesi arasında klinik bir anlamı olabilecek korelasyonun kurulmasında zorluk devam etmektedir.
Serbest bırakılan HER2 ECD, Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)10 kullanılarak ölçülebilir. Sandviç ELISA, aynı hedef antijene farklı epitopları bağlayan iki spesifik antikor kullanan bir yaklaşımdır. Kolayca erişilebilen kan ve sıvı bazlı biyolojik materyaldeki (sıvı biyopsi olarak adlandırılır) çözünmüş proteinlerin doğru ölçümünü sağlar. Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı tahlillerin varlığına rağmen, HER2 ECD teşhisinin5 faydası ve kandaki artmış HER2 seviyesi için kesme değeri konusunda tartışmalar vardır. Tahlillerin uygulanabilirliğini doğrulamak için doğrulanmış yöntemler ve tek tip olarak kabul edilen eşiklerle daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır11.
Herhangi bir ELISA'nın kritik bileşenleri, antikorun yakalanması (plaka üzerinde hareketsiz hale getirilmesi ve test özgüllüğünün ve duyarlılığının tanımlanması) ve antikorların (numuneler uygulandıktan sonra eklenir) tespit edilmesidir (Şekil 1). Bu raporda, yakın zamanda geliştirilen yeni anti-HER2 ECD monoklonal antikorlarına (mAb) dayanan, üretilen, bir afinite sütunu üzerinde saflaştırılan ve kapsamlı bir şekilde karakterize edilen ve benzersiz diziler sunan ELISA protokolünü sunuyoruz12. Bu özel antikorları kullanan gelişmiş ELISA, hücre zarı ile ilişkili HER2 proteininin doğru bir şekilde ölçülmesi için faydasını gösterir ve reseptör durumunun kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi için bir kültür ortamına salınır. Tahlil, klinik öncesi testlerde ve devam eden araştırmaları desteklemek için kullanılabilir. Testin performansı, gelecekte araştırma, teşhis ve yeni anti-HER2 tedavilerinin geliştirilmesinde potansiyel göstermek için serum ve doku homojenatları12 dahil olmak üzere farklı kökenlerden biyolojik numuneler üzerinde daha fazla test edilmiştir.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
1. İnsan kanser hücrelerinin kültürlenmesi
2. Numune toplama ve hazırlama
3. HER2 tayini için sandviç ELISA yapılması
Şekil 1: Geliştirilen anti-HER2 sandviç ELISA iş akışının şematik diyagramı. Sandviç ELISA prosedüründeki temel adımlara genel bakış. Bunlar, yakalayan anti-HER2 antikoru 70.27.58 ile plaka kaplaması, numunelerin eklenmesi (eğri standartları, boş, hücre lizatlarının veya kültür ortamının deneysel numuneleri) ve tespit edilen anti-HER2 antikorunun bağlanması gibi kritik adımları (kırmızı bir çerçeve ile vurgulanmıştır) içerir 70.21.73.67. Tahlil, hedef antijenin konsantrasyonunu belirlemek için kolorimetrik sinyalin bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldüğü sinyal algılama ve veri analizi ile sona erer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kalibrasyon eğrisi standart çözeltilerinin hazırlanmasını sunan şema. HER2 rekombinant proteininin seri dilüsyonları, 1.56-100 ng / mL'lik bir konsantrasyon aralığında bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için hazırlanır (şişeler STD 1-STD 7). Ek olarak, HER2 proteini içermeyen negatif kontrol numunesi dahil edilir (STD 8). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Sandviç ELISA doğrulaması
Yeni geliştirilen tahlil, bir doğrulama prosedürü gerektirir. Önemli doğrulama parametreleri arasında doğrusallık, kesinlik ve algılama limitleri, yani alt tespit limiti (LLOD) ve üst tespit limiti bulunur. Önceki makalede, kapsamlı bir yöntem doğrulaması gerçekleştirdik. ELISA doğrusallığı, PBS ve serum gibi HER2'nin miktar tayini için önemli olan diğer matrislerde seyreltilmiş antijenin düşük (2, 5, 10 ng/mL)...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Bir sandviç ELISA yapımında kritik bileşenler arasında, plaka üzerinde hareketsiz hale getirilen ve tahlil özgüllüğüne ve duyarlılığına katkıda bulunan yakalama antikorları vardır. Sunulan testte, yakalama antikoru olarak kendi bünyemizde üretilen ve karakterize edilen yeni monoklonal proteini (HER2/70.27.58) kullandık. Antikor, benzersiz bir CDR dizisine (tamamlayıcılık belirleyici bölge) sahipti ve afiniteye bağlı olarak, 0.0922 nM12'de
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
D.L., A.A., A.M., M.S., SDS Optic S.A.'dan mali destek beyan etti; A.A, A.M., M.S., SDS Optic S.A.'nın hisse senedi sahibi olduğunu beyan etti.
Çalışma, Ulusal Araştırma ve Geliştirme Merkezi hibesi STRATEGMEDII/269364/5/NCBR/2015 ve AB, Horizon 2020 KOBİ Aracı hibesi No. 783818'den bir fon ile desteklenmiştir.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biotin labeling kit-NH2 | Abnova | KA0003 | |
Blotting Grade, powdered milk, low in fat | Roth | T145.1 | |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 cell Counter, Dual-Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
Cell Culture Plates | Biologix | 07-6012 | |
Cell Scrapers | Biologix | 70-1250 | |
Centrifuge | Ohaus | 30130868 | |
Class II Biological Safety Cabinet - Telstar Bio II Advance 6 | Telstar | N/A | |
Clear Flat-Bottom 96-Well Plates | Thermo Fisher | 442404 | |
Culture Safe CO2 Incubators - Touch 190S | Leec | N/A | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
DMEM - high glucose | Sigma Aldrich | D0822 | |
ELISA plate reader | BioTek | 800TSUVI | |
FBS Standard, fetal bovine serum | PAN Biotech | P30-19375 | |
Forced circulation laboratory dryer | BINDER | 9090-0018 | |
HRP-Avidin | Thermo Fisher | 43-4423 | |
Human Her2 / ErbB2 Protein, Fc Tag, premium grade | AcroBIOSYSTEMS | HER2-H5253 | |
Immunowash Microplate Washer | Bio-Rad | 170-7009 | |
L-Glutamine solution | Sigma Aldrich | G7513 | |
mAb a-HER2 (clone 70.21.73.67) | SDS Optic | BIO-ABH-2 | |
mAb a-HER2 (clone 70.27.58) | SDS Optic | BIO-ABH-1 | |
MDA-MB-231 Cell line | ATCC | HTB-26 | |
NaHCO3 | POCH | 810530115 | |
NaOH | POCH | BA0981118 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
RIPA Buffer | Sigma Aldrich | R0278 | |
ROTI Fair PBS | Roth | 1111.2 | |
SK-BR-3 [SKBR3] Cell line | ATCC | HTB-30 | |
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Cell line | ATCC | HTB-77 | |
Stop solution 1x | Abcam | ab210900 | |
TC20 Automated Cell Counter | Bio-rad | 1450102 | |
TMB substrate 1x | Abcam | ab210902 | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
Vortex | Ohaus | 30392117 | |
Wave motion shaker | Ohaus | 30391968 |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır