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Resumo

Apresentamos um ensaio ELISA sanduíche validado usando novos anticorpos monoclonais anti-HER2. Este ensaio permite a quantificação precisa da proteína HER2 ligada e liberada a partir de células cultivadas in vitro e outras amostras, incluindo sangue e tecidos.

Resumo

O receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) é um marcador de câncer bem estabelecido. Tornou-se um alvo diagnóstico e terapêutico muito bem-sucedido, especialmente no câncer de mama e outros tipos de câncer que expressam HER2. Na clínica, os métodos diagnósticos imuno-histoquímicos padrão-ouro que empregam os anticorpos anti-HER2 específicos são usados para medir o nível de expressão do receptor ligado à membrana. O domínio extracelular solúvel (ECD) do HER2 que é liberado das células superexpressivas circula no sangue e pode refletir a expressão tecidual do receptor. Há necessidade de ensaios precisos e validados para correlacionar a concentração da proteína HER2 circulante com as manifestações clínicas da doença.

Nossa equipe desenvolveu e validou o novo ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) sanduíche para quantificação do domínio ECD ligado à membrana e liberado das células de HER2. O ensaio usa dois anticorpos monoclonais exclusivos específicos para HER2 desenvolvidos anteriormente. A faixa de quantificação inclui concentração de HER2 de 1,56-100 ng/mL, que é esperada para células cancerígenas cultivadas in vitro e mostra sensibilidade no nível de 0,5 ng/mL. A precisão e exatidão satisfatórias intra e interensaio do método o tornam aplicável para quantificação de HER2 em vários tipos de amostras biológicas, incluindo meio de cultura de células, soro e tecido tumoral sólido. Aqui, nos concentramos na determinação abrangente do receptor associado e secretado pelas células cancerígenas cultivadas in vitro . O artigo apresenta um protocolo passo a passo para a quantificação da proteína HER2 que pode ser empregado para testar uma variedade de linhagens celulares, sangue e tecidos.

Introdução

O sucesso da terapêutica moderna geralmente está relacionado à medicina de precisão, baseada na identificação precisa de pacientes sensíveis à terapia1. Entre essas terapias estão os medicamentos anti-HER2 direcionados ao receptor superexpresso em uma variedade de tumores, incluindo mama, endométrio, estômago, pulmão e outros. Vários agentes direcionados ao HER2 estão disponíveis com benefícios confirmados em pacientes com câncer HER2-positivo, incluindo HER2-low tipo2. A confirmação do status HER2-positivo é fundamental para a identificação dos pacientes potenciais que respondem; no entanto, continua sendo um desafio, especialmente no grupo HER2-low.

Os métodos padrão-ouro em ambientes clínicos, usados rotineiramente para testes de HER2, incluem a expressão da proteína imuno-histoquímica (IHC) e a amplificação do gene HER2 por abordagens de hibridização in situ fluorescente (FISH). Além disso, o ensaio Oncotype DX é usado para a expressão de mRNA de HER2. A biópsia tecidual necessária para esses métodos torna incerta a determinação da elegibilidade do paciente para o tratamento apropriado e sua potencial capacidade de resposta às terapias. Apesar das diretrizes atualizadas de 2018 pela Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO) e pelo College of American Pathologists (CAP) para reduzir a variabilidade entre as unidades de teste, a concordância do HER2 continua sendo um assunto para melhoria3.

O HER2 é um proto-oncogene membro da família dos receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR) que a superexpressão e ativação nos estados patológicos resultam em um desfecho agressivo ou contribuem para um mau prognóstico4. O HER2 é uma proteína modular de 185 kDa ancorada na membrana celular que contém uma tirosina quinase citoplasmática e um domínio extracelular (ECD). O HER2 ECD pode ser eliminado das células para ser liberado na matriz extracelular5 como a proteína livre de células, circulando ainda mais no sangue. O aumento da expressão de HER2 pode ser refletido pelo nível mais alto da DCE circulante, apresentando um valioso marcador preditivo e prognóstico 6,7, um marcador substituto da resposta ao tratamento8 ou como um método complementar à IHQ para identificar pacientes elegíveis para tratamento anti-HER29. No entanto, o desafio permanece em estabelecer a correlação entre a expressão do tumor HER2 e o nível sistêmico do receptor no sangue que poderia ter um significado clínico.

O HER2 ECD liberado pode ser quantificado usando ensaio imunoenzimático (ELISA)10. O ELISA sanduíche é uma abordagem que emprega dois anticorpos específicos ligando epítopos diferentes no mesmo antígeno alvo. Ele permite a medição precisa de proteínas solubilizadas no material biológico à base de sangue e líquido de fácil acesso (a chamada biópsia líquida). Apesar da presença de ensaios aprovados pela Food and Drug Administration (FDA), há controvérsia sobre a utilidade do diagnóstico de HER2 ECD5 e o valor de corte para um aumento do nível de HER2 no sangue. Mais pesquisas com os métodos validados e limiares uniformemente aceitos são necessárias para confirmar a aplicabilidade dos ensaios11.

Os componentes críticos de qualquer ELISA são a captura (imobilizada na placa e definindo a especificidade e a sensibilidade do ensaio) e a detecção de anticorpos (adicionados após a aplicação das amostras) (Figura 1). Neste relato, apresentamos o protocolo ELISA baseado nos novos anticorpos monoclonais (mAb) anti-HER2 ECD recentemente desenvolvidos que foram gerados, purificados em uma coluna de afinidade e completamente caracterizados, e apresentam sequências únicas12. O ELISA desenvolvido que emprega esses anticorpos personalizados mostra sua utilidade para a quantificação precisa da proteína HER2 associada à membrana celular e liberada em um meio de cultura para avaliação abrangente do status do receptor. O ensaio pode ser utilizado em testes pré-clínicos e para apoiar pesquisas em andamento. O desempenho do ensaio foi testado em amostras biológicas de diferentes origens, incluindo homogeneizados de soro e tecido12, para mostrar potencial no desenvolvimento de pesquisas, diagnósticos e novos tratamentos anti-HER2 no futuro.

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Protocolo

1. Cultura de células cancerígenas humanas

  1. Cultura de linhagens MDA-MB-231, SK-BR-3 e SK-OV-3 em meio de Dulbecco Modified Eagle contendo 4,5 g/L de ᴅ-glicose (DMEM-HG), suplementado com 2 mM de ʟ-glutamina e 10% (v/v) de FBS inativado por calor. Incubar culturas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2.
  2. Quando a cultura atingir ~ 80% de confluência, desprenda as células por tripsinização e colete-as em tubos cônicos separados de 15 mL.
  3. Conte as células com um contador automático de células e células-semente para o experimento em placas de 12 poços a uma densidade de 3 × 105 células/por poço em 1 mL de meio de crescimento. Incubar culturas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2.
    NOTA: Semeie um poço por cada ponto de tempo do experimento. Tanto o meio pós-cultura quanto os lisados celulares serão usados em análises posteriores.

2. Coleta e preparação de amostras

  1. A partir da cultura de 24 horas, colete o meio de cultura de um poço de cada linha celular em um tubo de 1,5 mL.
  2. Centrifugar as amostras recolhidas a 10 000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e armazene a -20 °C para determinar melhor o nível de ECD HER2 secretado.
  3. Lave as células restantes na placa com 1 mL de PBS frio, aspire suavemente e descarte o PBS.
  4. Adicione 200 μL de tampão RIPA (suplementado com 1% de inibidor de protease) em cada poço e incube por 5 min. Raspe as células com o raspador de células e misture pipetando várias vezes para homogeneizar o lisado.
  5. Colete as células lisadas em um novo tubo e aspire lentamente em uma seringa de 2 mL com uma agulha (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Repita a etapa de aspiração 5 a 10 vezes para desintegrar ainda mais as células.
  6. Centrifugar as amostras recolhidas a 10 000 x g durante 10 min a 4 °C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e conservá-lo a -20 °C para posterior determinação da fracção ligada às células da proteína HER2.
  7. Repita a coleta de meio de cultura e materiais celulares, seguindo as etapas de preparação para os pontos de tempo restantes - 48 h e 72 h de cultura.

3. Realizando um ELISA sanduíche para determinação de HER2

  1. Prepare os buffers.
    1. Tampão de revestimento: Prepare a solução de NaHCO3 0,1 M dissolvendo 0,42 g de NaHCO3 em 50 mL de água destilada e misture bem. Ajuste o pH para 9,6 com NaOH 3 M.
    2. Tampão de bloqueio: Prepare 5% de leite desnatado (NFDM) em PBS adicionando 0,5 g de leite em pó a 10 mL de PBS e misture bem.
    3. Tampão de lavagem: Prepare solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 (PBST) adicionando 0,5 mL de Tween-20 a 1000 mL de PBS a 0,05% e misture (evite espuma excessiva).
  2. Biotinilar o anticorpo de detecção.
    1. Biotinilato 50-200 μg de detecção de anticorpo anti-HER2 (clone 70.21.73.67) usando um kit comercial de rotulagem de biotina de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: A confiabilidade e a repetibilidade do processo de biotinilação são baseadas na medição da concentração final de proteína do anticorpo resultante e na comparação lote a lote do produto.
  3. Cubra o prato.
    1. Diluir o anticorpo de captura anti-HER2 (clone 70.27.58) até à concentração de 1 μg/ml no tampão de revestimento. Para revestir uma placa, use 6,5 mL da solução de anticorpo de captura.
    2. Utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 100 μL da solução de anticorpos de captura (preparada no passo 3.3.1) a cada alvéolo numa placa ELISA de 96 poços.
      NOTA: Evite os poços mais externos da placa (por exemplo, A1, H12) para reduzir a variabilidade causada pelo efeito de borda. Os poços mais externos devem ser preenchidos com água destilada para garantir condições de reação estáveis.
    3. Cubra a placa com uma película de vedação.
    4. Incubar a placa durante a noite (O/N) a 4 °C.
    5. Após a incubação O/N, colocar a placa à temperatura ambiente (RT) num agitador horizontal de microplacas (20-30 rpm com um ângulo de inclinação de 4°-6°) durante 1 h.
    6. Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL de PBST por poço).
  4. Bloqueie a placa .
    1. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL de tampão de bloqueio (5% NFDM em PBS) a cada poço revestido para bloquear locais de ligação inespecíficos.
    2. Cubra a placa com uma película de vedação.
    3. Incubar a placa durante 1 h a 37 °C numa câmara de humidade.
    4. Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL de PBST por poço).
  5. Preparar uma curva de calibração e controlo positivo (figura 2).
    1. Preparar a solução-padrão de trabalho do antigénio HER2 adicionando 2 μL de solução-mãe de 1 mg/ml a um μl de PBS a 1998 μL de PBS para obter uma concentração de HER2 de 0,001 mg/ml (1000 ng/ml).
    2. Diluir a solução-padrão de trabalho (WSS) adicionando 200 μl da solução a 1800 μl de PBS para obter a solução-padrão 1 (STD 1).
    3. Prepare seis padrões subsequentes (STD 2-STD 7) por diluições seriadas de STD 1 em PBS (Figura 2).
      1. STD 2: Adicione 500 μL de STD 1 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 50 ng/mL.
      2. STD 3: Adicione 500 μL de STD 2 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 25 ng/mL.
      3. STD 4: Adicione 500 μL de STD 3 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 12,5 ng/mL.
      4. STD 5: Adicione 500 μL de STD 4 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 6,25 ng/mL.
      5. STD 6: Adicione 500 μL de STD 5 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 3,125 ng/mL.
      6. STD 7: Adicione 500 μL de STD 6 a 500 μL de PBS e misture bem para preparar 1,5625 ng / mL.
      7. STD 8: Adicione 500 μL de PBS para preparar 0 ng/mL.
    4. Controle positivo: Diluir STD 1 adicionando 100 μL da solução STD 1 a 900 μL de PBS para obter uma solução de HER2 na concentração de proteína de 10 ng/mL.
  6. Prepare amostras para experimentos de pico e recuperação.
    1. Prepare as amostras de matriz (PBS, lisados celulares e meio de cultura) enriquecidas com a concentração conhecida da proteína HER2. Dilua os lisados celulares 1:2000 adicionando 2,5 μL de lisado celular apropriado a 5 mL de PBS para adquirir uma matriz de amostra com nível de HER2 abaixo do LOD do método.
    2. Use WSS (1000 ng/mL) e STD1 (100 ng/mL) para aumentar as amostras de matriz.
    3. Para cada matriz, prepare 6 amostras com concentrações de 0, 2, 5, 10, 30 e 50 ng/mL.
    4. Para preparar 0 ng/ml, adicionar 400 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular.
    5. Para preparar 2 ng/ml, adicione 8 μL de STD1 a 392 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular e misture bem.
    6. Para preparar 5 ng/ml, adicionar 20 μL de STD1 a 380 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular e misturar bem.
    7. Para preparar 10 ng/ml, adicionar 4 μL de WSS a 396 μl de PBS/meio de cultura/lisado celular e misturar bem.
    8. Para preparar 30 ng/ml, adicionar 12 μL de WSS a 388 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular e misturar bem.
    9. Para preparar 50 ng/mL, adicione 20 μL de WSS a 380 μL de PBS/meio de cultura/lisado celular e misture bem.
  7. Adicione a amostra, em branco e padrão.
    1. Usando uma pipeta de canal único, adicione 100 μL de padrões, branco (PBS) e amostras testadas (lisados celulares e meio de cultura) aos poços apropriados.
      NOTA: É aconselhável executar cada amostra em triplicado.
    2. Cubra a placa com uma película de vedação.
    3. Incubar a placa durante 1 h a 37 °C numa câmara de humidade.
    4. Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL de PBST por poço).
  8. Detecte a ligação de anticorpos.
    1. Diluir o anticorpo de detecção biotinilado (clone 70.21.73.67) em PBS até uma concentração de trabalho de 1 μg/ml. Para uma placa, use 6,5 mL de solução de trabalho de anticorpo de detecção.
    2. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL da solução de trabalho do anticorpo de detecção a cada poço.
    3. Cubra a placa com uma película de vedação.
    4. Incubar a placa durante 1 h a 37 °C numa câmara de humidade.
    5. Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL PBST por poço).
  9. Adicione o conjugado Avidin-HRP.
    1. Dilua o conjugado Avidin-HRP comercialmente disponível 1:40.000 adicionando 1 μL de conjugado enzimático a 40 mL de PBST.
    2. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL do conjugado diluído a cada poço.
    3. Cubra a placa com uma película de vedação.
    4. Incubar a placa durante 1 h a 37 °C numa câmara de humidade.
    5. Usando uma lavadora de microplacas, aspire a solução de revestimento e lave a placa três vezes com um tampão de lavagem (3 x 300 μL de PBST por poço).
  10. Reação colorimétrica
    1. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL de substrato de 3,3',5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço.
    2. Cubra a placa com uma película de vedação.
    3. Incube a placa por 1-5 min a 37 °C longe da luz e monitore o desenvolvimento da cor.
    4. Quando a cor atingir o nível esperado, adicione 100 μL de solução de parada para encerrar a reação.
      NOTA: O nível esperado corresponde a uma cor azul intensa em poços contendo amostras com alta concentração do analito.
  11. Adquira e analise dados.
    1. Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
    2. Usando uma curva de calibração de 4 paramétricas, calcule a concentração da amostra com base na equação da curva.

figure-protocol-10399
Figura 1: Diagrama esquemático do fluxo de trabalho ELISA sanduíche anti-HER2 desenvolvido. Visão geral das principais etapas do procedimento ELISA sanduíche. Isso inclui as etapas críticas (destacadas com uma moldura vermelha), como revestimento de placa com o anticorpo anti-HER2 de captura 70.27.58, a adição de amostras (padrões de curva, branco, amostras experimentais dos lisados celulares ou meio de cultura) e a ligação do anticorpo anti-HER2 de detecção 70.21.73.67. O ensaio termina com a detecção de sinal e análise de dados, onde o sinal colorimétrico é quantificado usando um leitor de microplacas para determinar a concentração do antígeno alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-11410
Figura 2: Esquema que apresenta a preparação das soluções padrão da curva de calibração. Diluições seriadas da proteína recombinante HER2 são preparadas para gerar uma curva de calibração em uma faixa de concentração de 1,56-100 ng / mL (frascos STD 1-STD 7). Além disso, inclui-se a amostra de controlo negativo sem a proteína HER2 (STD 8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Validação ELISA sanduíche
O ensaio recém-desenvolvido requer um procedimento de validação. Os parâmetros de validação importantes incluem linearidade, precisão e limites de detecção, ou seja, limite inferior de detecção (LLOD) e limite superior de detecção. No artigo anterior, realizamos uma validação completa do método. A linearidade do ELISA foi testada usando as amostras simuladas para concentrações baixas (2, 5, 10 ng/mL), médias-altas (30 ng...

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Discussão

Entre os componentes críticos na construção de um ELISA sanduíche, estão os anticorpos capturadores que são imobilizados na placa e contribuem para a especificidade e sensibilidade do ensaio. No ensaio apresentado, empregamos como anticorpo capturador a nova proteína monoclonal (HER2/70.27.58) gerada e caracterizada internamente. O anticorpo possuía uma sequência única da CDR (região determinante de complementaridade) e, com base na afinidade, apresentava uma sensibilidade de ...

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Divulgações

D.L., A.A., A.M., M.S. declaram apoio financeiro da SDS Optic S.A.; A.A, A.M., M.S. declaram a propriedade das ações da SDS Optic S.A.

Agradecimentos

O estudo foi apoiado por fundos do Centro Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento subvenção STRATEGMEDII / 269364/5 / NCBR / 2015 e EU, Horizonte 2020 SME Instrument grant No. 783818.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Biotin labeling kit-NH2AbnovaKA0003
Blotting Grade, powdered milk, low in fatRothT145.1
Cell Counting Slides for TC10/TC20 cell Counter, Dual-ChamberBio-Rad145-0011
Cell Culture PlatesBiologix07-6012
Cell ScrapersBiologix70-1250
CentrifugeOhaus30130868
Class II Biological Safety Cabinet - Telstar Bio II Advance 6TelstarN/A
Clear Flat-Bottom 96-Well PlatesThermo Fisher442404
Culture Safe CO2 Incubators - Touch 190SLeecN/A
Dimethyl sulfoxide Sigma AldrichD2650
DMEM - high glucoseSigma AldrichD0822
ELISA plate readerBioTek800TSUVI
FBS Standard, fetal bovine serumPAN BiotechP30-19375
Forced circulation laboratory dryerBINDER9090-0018
HRP-AvidinThermo Fisher43-4423
Human Her2 / ErbB2 Protein, Fc Tag, premium gradeAcroBIOSYSTEMSHER2-H5253
Immunowash Microplate WasherBio-Rad170-7009
L-Glutamine solutionSigma AldrichG7513
mAb a-HER2 (clone 70.21.73.67)SDS OpticBIO-ABH-2
mAb a-HER2 (clone 70.27.58)SDS OpticBIO-ABH-1
MDA-MB-231 Cell lineATCCHTB-26
NaHCO3POCH810530115
NaOHPOCHBA0981118
Protease Inhibitor CocktailSigma AldrichP8340
RIPA BufferSigma AldrichR0278
ROTI Fair PBSRoth1111.2
SK-BR-3 [SKBR3] Cell lineATCCHTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Cell lineATCCHTB-77
Stop solution 1xAbcamab210900
TC20 Automated Cell CounterBio-rad1450102
TMB substrate 1xAbcamab210902
Tween-20Sigma AldrichP9416
VortexOhaus30392117
Wave motion shakerOhaus30391968

Referências

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