We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Bu protokol ve video daha ayrıntılı 4 yazılım paketi açıklayan orijinal kağıda bir arkadaşı, yanı sıra Danuser Lab web sitesinde yazılım indirme ile birlikte Teknik Rapor olarak hizmet içindir. Okuyucular yazılımını kullanarak ilgili ek sorular varsa dikkatle bu belgeleri inceleyecek teşvik edilmektedir. 1. öncesinde Görüntü Analizi <ol><li> TIFF (Tagged Image File Format) görüntü dosyaları bir dizi halinde her zaman atlamalı film dönüştürün. Birden fazla büyüme konileri / hücreleri belirli bir film varsa, ilk hasat her büyüme konisinin / hücre kendi resim dizisini oluşturmak için. Not: Bu gerekli değildir, her bölge-faiz (ROI) plusTipTracker içinde seçilebilir gibi. Ancak, daha küçük görüntü boyutlarını kullanarak hesaplama işleme hızını artırır, böylece görüntüde belirgin boşluk varsa, bu adım önerilir. </li><li> Kendi her TIFF serisi kaydetMATLAB erişmek için ayarlanmış bir yol içindeki &quot;resim&quot; olarak adlandırılan klasör (&quot;images&quot; harf duyarlı olduğunu unutmayın). &quot;Geçerli Klasör&quot; penceresinde ilgili dosya dizini, yeni bir yol eklemek gezinmek için, dizin simgesine sağ tıklayın ve &quot;Yol Ekle - Seçilmiş Klasörler ve Alt-Klasörler&quot; seçeneğini seçin. Bu plusTipTracker yazılım klasörü yanı sıra, Path ilave edilmesi önemlidir. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Not: görüntü analizinde ilk adım, EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve mikrotübül dinamikleri parametrelerinin belirlenmesidir. Bu komut &quot;plusTipGetTracks&quot; 4 ile elde edilir. <ol><li> Analizi, açık MATLAB uygulamaya başlamak ve komut penceresi içine &quot;plusTipGetTracks&quot; yazın. Bu yeni bir iletişim kutusu görünmesine neden olur. </li><li> &quot;Up Yeni Projeler Set&quot; üzerine tıklayın ve bir (veya mor seçine) Uygun &quot;görüntüleri&quot; klasörünü (veya &quot;görüntü&quot; klasörler) içeren dizinleri seçerek önceki TIFF görüntü serisi. Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, bir dosya dizin (roi_1) (&quot;resimler&quot; tutan aynı klasörde) oluşturulur gelecekteki veri dosyalarını içerecek. Not: &quot;Set Up Yeni Projeler&quot; adım, ayrı bir oturum sırasında, vaktinden tamamlanabilir. </li><li> &quot;Son nokta üzerinde sağ tıklayın, bir çokgen seçin ve &#39;Mask oluşturun&#39; üzerine tıklayın&quot;: Yeni bir pencere açılacaktır. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Seçilen görüntü serisinin ilk görüntü ekrana gelecektir. Tıklayın ve büyüme konisinin bütününü kapsayan bir çokgen oluşturmak için fareyi kullanın. Çift poligonu kapatmak için fareyi tıklayın. </li><li> Poligon kapatıldı edildikten sonra, bir iletişim kutusu belirir: &quot;Başka bir ROI seçmek istiyor musunuz?&quot; Görüntü &quot;Evet&quot; seçeneğini analiz için başka bir büyüme konisi varsa; aksi halde sseçilen &quot;Hayır&quot;. </li><li> Hemen analiz edilecek projeleri seçin. &quot;Projeleri Seç&quot; tıklayın ve analiz etmek klasörü (roi_X) seçin. </li><li> Bir listSelectGUI ekranı görünecektir. Ekranın sol tarafında proje (ler) seçin ve ekranın sağ tarafında bunları üzerinde taşımak. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Proje listesi kaydetmek ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın için bir konum seçin. </li><li> &quot;Algılama&quot;, &quot;İzleme&quot; ve &quot;Post-Processing&quot; seçeneğini seçin. Bu seçimler yapıldıktan sonra, iletişim kutusunun sağ tarafında yapılandırılabilir olacak. Her seçeneği yapılandırın. <ol><li> Bu parametreler MT parça halinde tespit kuyruklu yıldızlar bağlamak için kullanılır. Takibi için bu kontrol parametrelerini seçmek için Ayrıntıları sayfalarında yazılım paketi indir eşlik Teknik Rapor PDF 9-10 dahil edilir; problemlerle karşılaşıldığında dikkatli eğer bu raporu okudum. EB1 Xenop olarak GFP kuyrukluyıldızları izleme amaçları içinBizi büyüme konileri, kullanmak laevis&#39;den aşağıdaki Takip Ayarlar: Arama Radius Aralığı (piksel) 5-12, Minimum Alt Parça Uzunluğu (kare) 3; Maksimum Boşluk Uzunluğu (kare) 8; Maksimum Çekme Faktörü 0.8, Max açısı İleri 50, Max açı Geriye 10, dalgalanma Radius 2.5. Bu ayarlar, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. </li></ol> Not: Max Küçülme Factor &quot;geri boşluklar&quot; olarak tespit &quot;geri boşluklar&quot; sayısını azaltmak için ayarlanır parça bağlantılarda kalabalık koşulları ve olası hataları verilen, büyüme konilerinin bağlamında analiz etmek yararlı değildir. Büyüme konisi MTS büyümeleri ve çekinti ilave olarak, sık sık küçük translokasyon sergilemektedir ve bu kontrol ayarları artan bağlanma adımı sırasında bu artan hareket etmesini sağlar Buna ek olarak, her iki Çok İleri açı olarak Dalgalanma yarıçapı nispeten yüksek bir değere ayarlanmaktadır. <ol><li> İstediğiniz belirli görüntü alma ayarlarına bağlı Post-Processing Ayarlar doldurun. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Ayarları düzenlendikten sonra, &quot;Başlat&quot; üzerine tıklayın. Yazılım seçilmiştir hangisi ayarları çalışacaktır. Bu seçilen projeler ve bunların boyutları sayısına bağlı olarak, saat dakika sürebilir. Komutanlığı Pencere her fonksiyon için kalan tahmini süresini gösterir. PlusTipGetTracks adım tamamlandığında, Command Window &quot;bitirdi!&quot; Görüntüleyecektir Not: mikron (MT dinamikleri belirli parametreleri artık bu yazılım tarafından hesaplanmıştır uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, incelemek için en yararlı parametreler MT büyüme izleme hızı vardır / dakika), saniyede büyüme parça ömrü (), ve mikron büyüme hat uzunluğu (). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Not: Şimdi mikrotübül parçaları tanımlanmış olduğundan, fonksiyon &quot;plustipSeeTracks&quot; iz görselleştirme 4 için kullanılır. Bu fonksiyon,mekansal MT dinamikleri haritalar ve hız filmler dahil görselleştirme için çoklu çıktıları sağlar, ancak burada, odak büyüme konisinin resimlerin üzerine bindirilir MT parçalarını göstermek için &quot;Track Filmler&quot; kullanarak yanlızca yapabilirsiniz. PlusTipGetTracks bir anda birden fazla film analiz ederken, plusTipSeeTracks bir seferde sadece tek bir film analiz edebilirsiniz. <ol><li> Komut penceresine &quot;plusTipSeeTracks&quot; yazın. </li><li> Iletişim kutusu yüklendikten sonra, &quot;Select Project&quot; üzerine tıklayın. Görselleştirmek ve &quot;Klasörü Seç&quot; butonuna tıklayın projeyi içeren ana dizini seçin. Yeni bir pencere açılacaktır: &quot;görselleştirmek istediğiniz projeyi seçin&quot;. Görselleştirmek ve &quot;Tamam&quot; tıklayın dosyayı seçin. </li><li> Sonra, &quot;Select Kayıtlı ROI&quot; üzerine tıklayın. Önceki adımda seçilen biri olarak aynı roi_X klasöre gidin ve &quot;roiYX&quot; adlı dosyayı seçin. </li><li> W belirtmek için &quot;Çıkış Dizin Seç&quot; tıklayınBurada MATLAB parça görselleştirme dosyaları kaydeder. Not: Biz verilerin geri kalanını içeren aynı klasörü kullanmanızı öneririz. </li><li> Seç &quot;Parça Film Yap&quot; ve ekran + TIP kuyruklu hesaplanan parça plusTipGetTracks tüm görüntüleyen görünecektir. Bu adım dosyasındaki &quot;allTracks_X_X_X&quot; in, bir film formatında izlenen zaman serisi kaydeder. Bir AVI olarak film kaydetmek için bir seçenek aksi varsayılan biçim bir Quicktime.mov dosyası olarak, orada. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Not: Bu son fonksiyon analizi ve MT yol parametrelerinin karşılaştırılması için filmler grupları oluşturmak için kullanılır. <ol><li> Komut penceresine &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; yazın. Elle karşılaştırmak için gruplarını seçmek için, ilk &quot;hiyerarşi Auto grubu&quot; de-seçin. Sonra, &quot;Select projeler&quot; üzerine tıklayın. Tüm roi_X klasörleri içeren ana dizinleri gidinanaliz etmek. </li><li> Bir listSelectGUI ekranı görünecektir. Ekranın sol taraftan gruplar içerir ve ekranın sağ tarafına onları taşımak için tüm projelerinin seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Proje listesi kaydetmek ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın için bir konum seçin. </li><li> Bir pencere çıkacaktır: &quot;listeden birinci grubu seçiniz&quot;. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. ListSelectGUI penceresi tekrar gösterecektir. Bu kez, bir araya toplanmış olmalıdır ilk gruba karşılık sadece bu dosyaları seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Ardından, grup adını girin ve &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Buna göre cevap ve grupları seçmeye devam &quot;başka bir grup seçin?&quot;: Bir pencere açılacaktır. Bir pencere çıkacaktır: &quot;grup listesini kaydetmek için bir konum seçin&quot;. Konuma gidin ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın. </li><li> Çıkış klasörler nerede olacak seçmek için &quot;Select Output Directory&quot; üzerine tıklayınsaklanır. </li><li> Yapmak için grup analizi hangi tür seçin - MT parça yapılmalıdır her grup veya hücre analizi başına toplanmış olup olmadığını. Önerilen istatistiksel testler zaten belirlenir. Analizinde tüm parçaları dahil etmek de-seçin &quot;filminin başında / sonunda parça çıkarın&quot;. Aksi halde, seçilen bu kutuyu sahip film başladığı ve bittiği gibi sürecinde herhangi MT büyüme şarkıları kaldırır. </li><li> Grup Analizi Seçim yapıldıktan sonra, &quot;gruplarını karşılaştırma&quot; seçeneğini seçin. </li></ol>

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker hızlı ve otomatik olarak, bir hücre ya da büyüme konisinin hemen hemen tüm görünür EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve MT parametreleri hesaplamak için basit bir grafik kullanıcı arabirimi sağlar. Diğer yayınlar (. Örneğin, Marx ve ark büyüme konileri 18 etiketlendi EB1 dinamikleri de kullanılan kantitatif analiz) yazılımları benzer tipte tasarımı bildirdi. Ama bu yazılım özgürce, açık kaynak tasarlama k...

Bu yöntemin amacı, kantitatif mikrotübül (MT) ile ilgili bilgi, artı sona izleme proteini (+ uç) büyüme konileri canlı dinamikleri elde etmektir. MT + ipuçları MTS 9,10 artı uçları lokalize bir protein grubudur. Onlar polimerizasyon, felakete ve kurtarma oranları dahil olmak üzere MT dinamik istikrarsızlık 11, parametrelerini düzenlemek için fonksiyonları bir dizi yapmak. MT dinamiklerini analiz etmek için bir iyi kullanılan bir yöntem büyüyen MT spesifik olarak bağlanan artı-biter 1,12 + TIP EB1, davranışlarını takip etmektir. EB1 büyüyen MT birkaç diğer proteinleri işe bilinen artı-biter MT büyüme ve afet frekansı 15,16 hem teşvik, 13,14, ve son zamanlarda MT olgunlaşma faktörü 15 olarak kurulmuştur edilir. Büyüme konilerinin içindeki MT dinamikleri pek çok çalışma EB1 localizati gibi, zaman içinde 1-3 EB1-GFP dinamikleri değişiklikleri ölçmek için el-izleme yöntemlerini kullanmışlardırMT ile artı uçları MT polimerizasyonu için bir markör olarak kullanılabilir. MT büyüme için bir vekil olarak EB1-GFP kuyrukluyıldızların incelenmesi için bir anahtar yararı MT dinamikleri bile önemli MT örtüşme bölgelerinde ölçülebilir olmasıdır. El-izleme EB1-GFP kuyrukluyıldızların yöntemi MT yararlı açılımlar sağlamıştır iken, zaman alıcı ve önyargılı olabilir, 1-3 davranışları. Önemli bilgileri kaçırabilir Ayrıca, anormal büyüme gibi koni davranışlar olasılıkla (el-izleme olduğunda genellikle gerekli) MTS sadece küçük bir alt kümesini analiz sitosköletal dinamikleri dakika vardiya, sonucudur. Böylece, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin kazanılmasından sonra, yazılım paketi, plusTipTracker 4 kullanarak küresel MT dinamiği parametreleri ölçmek. Danuser Lab geliştirilen bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamikleri karakterize çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu, bize bir açık-kaynaker-dostu, floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz içerir MATLAB tabanlı bir paket. MT dinamikleri belirli parametreler bu yazılım tarafından hesaplanan uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, en yararlı parametreler (mikron / dakika) MT büyüme izleme hızı vardır, büyüme parça (saniye olarak) ömür boyu, ve (mikron) büyüme hat uzunluğu. Yazılım (&quot;Software&quot; altında) Danuser Lab web sitesinden doğrudan indirilebilir. Danuser Lab şu anda orijinal, stand-alone yazılım mevcut kalacak bir yazılım paketi olarak adlandırılan u-track 2.0, içine dahil edilmiştir + TIP izleme analizi için yeni bir arabirimi destekler iken. İki program arasındaki temel algoritmalar arayüzü ve analiz çıkışların tek bir farkla, (en azından 2014 gibi) aynıdır. Biraz MATLAB ve / veya hesaplama analizleri tecrübeleri acemi kullanıcı içinence, plusTipTracker otomatik istatistiksel parametre çıkışlar dahil olmak üzere daha kullanıcı dostu özelliklere sahiptir. Burada, biz kültürlü Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri görüntüleri analiz etmek için adımları açıklar. Bu protokol MT dinamikleri 17 inceleyen bir son kağıt kullanılmıştır. Ayrıca Lowery ve ark bakın. 2.012 5 EB1-GFP ifade kültürleme büyüme konileri ilişkin ayrıntılı talimatlar için. Bu kağıt öncelikle büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri incelenerek odaklanırken, aynı protokol diğer hücre tipleri 17 için kullanılabilir. Tüm hücre tipleri için, çerçeveler arasındaki zaman aralığının en uygun + TIP takip 0.5-2 saniye arasında olmalıdır. Çerçeveler arasındaki kadar 4 saniyelik bir zaman aralığı mümkündür, ancak bu ek izleme hataları zaman aralığı sonuçları artmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Mikrotubul (MT) artı-son-izleme proteinler (+ TIPler) MTS büyüyen artı uçlarına lokalize ve MT dinamiklerini 1,2 düzenler. MT dinamiklerini analiz etmek için en iyi bilinen ve + yaygın kullanılan ipuçları biri büyüyen tüm MT artı uçları bağlanır Sonu Binding Protein, EB1, ve böylece, MT polimerizasyonu 1 için bir göstergedir. Büyüme konilerinin içindeki EB1 davranışı bir çok çalışmalar bireysel MTlerin 1-3 analiz zaman tüketen ve önyargılı bilgisayar destekli, el-izleme yöntemlerini kullandık. Bizim yaklaşımımız, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin satın Aşağıdaki yazılım paketi, plusTipTracker kullanarak 4 MT dinamikleri küresel parametrelerini ölçmek için olduğunu. Bu yazılım floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz birleştiren bir MATLAB tabanlı, açık kaynak, kullanıcı-dostu paketidir. Burada, biz plusTipT kullanmak için protokol mevcutkültürlü Xenopus laevis büyüme konisi floresan etiketli + TIP kuyrukluyıldızların analizi için racker. Bununla birlikte, bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamiğini karakterize etmek için kullanılabilir.

Burada anlatılan canlı hücrelerin + TIP dinamiklerini ölçmek birkaç bilgi dosyaları sağlayacak bu yazılımı kullanarak. Bu fonksiyon plusTipGetTracks (Şekil 1 &#39;de gösterilen örnek ayarlar kullanılarak) parçaları tanımlar ve ardından + TIP parçaları ile ilgili parametreleri içerir. Yazılım elde ettiği bilgileri görüntülemek için, adım 2.2 oluşturulan roi_X dizine gidin. &quot;Ustalık&quot; klasörü tespit kuyrukluyıldızların gösteren g?...

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

MATLAB tabanlı, açık kaynak yazılım paketi, plusTipTracker, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için floresan etiketli + ipuçları görüntü serilerini analiz etmek için kullanılabilir.

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Büyüme Konileri

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K Görüntüleme.  Boston College.  MATLAB tabanlı, açık kaynak yazılım paketi, plusTipTracker, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için floresan etiketli + ipuçları görüntü serilerini analiz etmek için kullanılabilir. 

Video: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Biyoloji

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.