Başlamak için, 10 mikromolar Y-27632 ve 2.5 mikromolar CHIR-99021 içeren bir organoid kültür ortamı hazırlayın. ECM'yi çip üzerinde bağırsak üzerine kapladıktan sonra, üst mikro kanalın baypas borusunu açık tutarken çıkış borusunu üst mikro kanaldan ayırın. Bir bağlayıcı klips kullanarak, alt mikro kanalın hem girişini hem de çıkışını sabitleyin.
Bir P100 mikropipet kullanarak, üst mikrokanalın çıkış deliğine 20 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Bağlayıcı klipsler kullanarak üst mikro kanalın baypas ve giriş borusunu sabitleyin. Çıkış borusunu üst mikro kanalın çıkış deliğine yeniden takın ve işlem boyunca borunun açık kalmasını sağlayın.
Tamamlandığında, bir bağlayıcı klips kullanarak üst mikro kanalın çıkış borusunu kademeli olarak sabitleyin. Daha sonra, bir mikroskop altında, hücrelerin üst mikrokanal boyunca eşit olarak dağıldığını doğrulayın. Çip üzerinde bağırsak cihazını ve nemlendirilmiş bir karbondioksit inkübatörünü 37 santigrat dereceye yerleştirin.
Çipin üst mikro kanalına bağlı şırıngayı bir inkübatör içine yerleştirilmiş bir şırınga pompasına bağlayın. Akış hızını saatte 30 mikrolitreye ayarlayın ve üst mikro kanal için oturma ortamının sürekli akışını başlatın. Bu süre zarfında, alt mikrokanalı kelepçeli bırakın.
Oturduktan sonraki gün, ortamı yalnızca A-83-01 içeren bir organoid kültür ortamıyla değiştirin. Üst mikro kanal için tek katman oluşturulduktan sonra, alt mikro kanala sürekli oturma ortamı akışını başlatın. Daha sonra, çipte üç boyutlu morfogenezin gelişimini başlatmak için organoid kültür ortamını hem üst hem de alt mikrokanallara sokun.
Çip üzerinde bağırsak tasarımında santimetre kare başına 50 dinlik saf stres elde etmek için akış hızını saatte 0.02 mikrolitreye yükseltin. Bilgisayar tarafından düzenlenen bir biyoreaktör kullanarak, üç boyutlu morfogenez oluşturmak için iki ila üç gün boyunca bir çip üzerinde bağırsak cihazında kültürlenen hücrelere %10 siklik gerinim ve 0.15 hertz frekansı uygulayın. Altı ila dokuz günlük orta akıştan sonra, mikrokanal boyunca köpek bağırsak epitel hücrelerinin üç boyutlu morfogenezinin ara sıra kümelenmesi gözlendi.
İmmünofloresan boyama, mikroakışkan çiplerdeki organoid kaynaklı tek tabakaların ve villus benzeri yapıların üç boyutlu yapısını değerlendirdi. TEER ile ölçülen bağırsak bariyer fonksiyonu, kültürün beşinci gününde stabil TEER değerleri gösterdi.
