Bu yöntem, gen ekspresyonu ile ilgili anahtar soruları cevaplamamıza yardımcı olabilir ve kromatin yapısının gen ekspresyonunu tam olarak nasıl etkilediğini ve kromatin organizasyonunun transkripsiyonel dinamikleri nasıl düzenlediğini bize gösterir. Bu teknolojiyi geliştirdik çünkü uzun menzilli kromatin döngüsünün yaratılmasını sağlamak için kromozom mimarisini kontrol edilebilir şekilde değiştirmek istedik. Aynı zamanda endojen kromozom yapısını geri yüklemek için kromatin bağlamını tersine çevirme yeteneğine sahipken.
Bu yöntem kullanım kolaylığı ve geniş uygulanabilirlik için tasarlanmıştır. Sistemin daha geniş bir şekilde kullanılabilmesi için toksik olmayan bir dimerizer ve ortogonal dcas9 türlerinden yararlandık. Bu yöntemi geliştirdik çünkü gen ekspresyonunun kromozom mimarisine mi yoksa kromozom yapısının gen ekspresyonunda değişikliklere yol açıp açmayacağı sorusuna cevap verebilmek istiyorduk.
CRISPR-guide RNA dizilerinin tasarımı ve hücre kültürlerinin bakımı metin protokolünde açıklanmıştır. Plazmid haritaları ve kullanılan astarlar burada listelenmiştir. Plazmid hazırlamaya, merceksi CRISPR plazmidin beş mikrogramını üç mikrolitre BsmB1 üç mikrolitre alkali fosfataz altı mikrolitre 10x sindirim tamponu ve 0.6 mikrolitre yeni hazırlanmış 100 milimular DTT ile karıştırarak başlayın.
Toplam hacmi 60 mikrolitre çift distile suya getirin ve plazmidi sindirmek ve fosforilat etmek için karışımı 37 derecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Sonra, jel döngü plazmid ve çift distile su sindirilmiş plazmid arındırmak. Daha sonra, kılavuz RNA çiftleri için annealing reaksiyonları hazırlayın.
10x T4 ligasyon tamponunun bir mikrolitresi ile 100 mikromografide her kılavuz RNA'nın bir mikrolitresini ve 10 mikrolitrelik toplam reaksiyon hacmi için 0,5 mikrolitre T4 PNK'yi birleştirin. Kılavuz RNA çiftlerini hedef dizilerine yönlendirmek için karışımları 30 dakikada 37 derecede kuluçkaya yatırın ve ardından 95 santigrat derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın ve dakikada 5 derece düşürerek sıcaklığı kademeli olarak 25 dereceye düşürün. Daha sonra, çift distile su da bir ila iki yüz annelik kılavuzu RNA seyreltmek.
Şimdi, iki ligasyon reaksiyonunu hazırlayın. Seyreltilmiş perivaneal kılavuz RNAse 2.5 mikrolitre 2x ligasyon tampon bir mikrolitre çift distile su ve ligaz 0,5 mikrolitre ile sindirilmiş plazmid bir mikrolitre karıştırın. BsmB1 sindirilmiş plazmid kılavuzlarını sıvılaştırmak için reaksiyonları oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra kararlı üç bakteri içine yeni ligated plazmid dönüştürmek ve herhangi bir plazmid hazırlama yöntemi kullanarak bakterileri yükseltmek. Altı kuyulu bir tabakta, her iyi, tohum 750, 000 2n3 Tcells DMEM ile 10% FBS ve% 1 kalem strep. Her yapı için bir kuyu kullanın ve 24 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, % 10 FBS ile taze antibiyotik serbest DMEM için orta değiştirin. Kaplamalı hücrelerin her kuyu için orta değiştirdikten hemen sonra Lentivirus üretim karışımı bir tüp hazırlamak. Her reaksiyon için, her reaksiyon için Opti-MEM ortamının 150 mikrolitresi ile 11 mikrolitre lipid-baz transfeksiyon reaktifini seyreltin.
Sonra ayrı tüpler DNA hazırlamak. CLOud9 lentiviral vektör plazmid iki mikrogram diğer lentiviral ambalaj bileşenleri iki mikrogram ile birleştirin. Opti-MEM ortamının 150 mikrolitresinde bu karışımı seyreltin.
Daha sonra seyreltilmiş lipid bazlı transfeksiyon reaktifinde seyreltilmiş lentiviral plazmid karışımının eşit hacimli birliğini birleştirin ve karışımları oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Sonra hücrelerin her kuyuya hazırlanan karışımlardan bir tüp ekleyin ve kuluçkaya devam edin. 48 saat sonra, plaka kuyularından viral üretim ortamını koniklere aktarın ve 5 dakika boyunca 300 g'da aşağı doğru döndürün.
Sonra peletli enkaz atmak için taze tüpler için supernatant aktarın. Şimdi, hemen hedef hücreleri transduce veya gelecekteki kullanım için 80 santigrat derecede dondurmak için viral üretim ortamı kullanın. Bu durumda, 80, 000 hücre içeren 50 mililitrelik konik tüp tamamlayıcı CLOud9 plazmidler oluşur ilgi her viral yapı, 250 mikrolitre ekleyerek başlayın.
Sonra çözeltide mililitre başına bir ila sekiz mikrogram arasında olması için yeterli Polibrene ekleyin. Daha sonra antibiyotiksiz ortam kullanarak her tüpteki toplam hacmi bir mililitreye ayarlayın. Şimdi virüs parçacıkları ve hücreler arasındaki teması artırmak için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 800 g hücreleri spin.
Daha sonra borulama ile supernatant hücreleri yeniden askıya. Daha sonra, hücrelerin süspansiyonu kültür plakalarına yükleyin ve 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, hücreleri toplamak.
Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g santrifüj ve normal ortamda yeniden askıya alın. Ertesi gün, iki kat transe hücreleri seçmek için orta puromisin ve higromisin ekleyin. Her hücre tipi için uygun antibiyotik konsantrasyonu önceden belirlenmelidir.
Daha sonra, aşağı akış uygulamaları ile devam etmeden önce en az üç gün için seçim medya hücreleri kuluçka ve hücreleri ve seçim ortamı korumaya devam. CLOud9 seçilen ve transduced hücreleri dimerize için kültür çanak bir milimolar ABA ekleyin. Denetimler için DMSO'yu ekleyin ve deneme süresince ABA veya DMSO ile hücreleri koruyun.
Karartma tersine çevirmek için hücreleri plakayüzeyini iki kez kaplayacak kadar PBS ile yıkayın. Bundan sonra, ABA-free medya kültür hücreleri bir dimerized devlet onları korumak için. CLOud9 sisteminin uygun kullanımı tamamlayıcı CSA ve CSP CLOud9 geri dönüşümlü temas neden hücre kültürü medya ABA eklenmesi veya kaldırılması yoluyla inşa eder.
CSA ve CSP yapıları standart CRISPR kılavuzu RNAAse kullanılarak uygun genomik bölgelere lokalize edilebilmektedir. Her CLOud9 bileşeninin hedeflenmesinde doğru lokalizasyonu sağlamak için nicel PCR ile takip edilen kromatin immünopreplasyonu kullanılmıştır. Ayrıca aba ile ve ABA olmadan koimmünpresipasyon ligand varlığında CSA ve CSP dimerization yanı sıra ligand yokluğunda geri döndürülebilirlik doğrulanmış.
ABA dimerizasyondan sonra beta-globin ile LCR arasındaki daha fazla temas kromozom onayı yakalama ile ölçüldü. Ancak, bu sadece CSA veya sadece CSP yapı içeren kontrollerde gözlenmedi. LCR beta-globin etkileşiminin oluşturulması endojen LCR globin temasından tamamen elenmedi.
Yalnızca orijinal ilgili bağlantıya eklendi. Beta-globin LCR kontaklarında artış, hedeflenen LCR veya beta-globin destekçi söyör bölgesi içinde tam bölgeye bakılmaksızın 72 saatlik dimerizasyon ile gözlendi. Son olarak, aba çıkarıldıktan sonra kromozom onayı yakalama ile sistemin geri döndürüleme doğrulandı.
Bu endojen onay tam yenilenmesi ile sonuçlandı. Bu yordamı çalışırken, medya değiştirmek ve taze dimerized CLOud9 transduced hücreleri her gün eklemek hatırlamak önemlidir. Lentivirus ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve BSL 2'de kullanılan tüm önlemler bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.
