Bu protokol, yüksek çözünürlüklü kromozom döngüleri ve diğer kısa menzilli etkileşim özelliklerini gösterdiği için önemlidir. Bu tekniğin ana avantajı, 3D genom organizasyonunun yüksek sinyal-gürültü oranına sahip nükleozom çözünürlüğü ile haritalanmasıdır. MNase titrasyonunu gerçekleştirmek için, bir kez 10'luk bir peleti 10 dakika boyunca buz üzerinde altıncı hücreye çözün ve hücreleri 500 mikrolitre DPBS'de yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
Hücreleri, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı çıkarın. Peletlenmiş hücreleri 500 mikrolitre MB Number one tamponunda yeniden süspanse edin. Mikrolitre MNaz başına 20 birimlik bir şişeyi çözdürün ve metinde tarif edildiği gibi sindirim koşulları için 10 milimolar Tris ile seyreltin.
10 ila 20 saniyelik uygun zaman aralıklarıyla, dört numunenin tüplerinden birine ilk MNase sindirim çözeltisinden bir mikrolitre ekleyin, girdap yapın ve bir ThermoMixer'da 37 santigrat derecede 800 RPM'de 10 dakika inkübe edin. Kalan MNaz dilüsyonlarından bir mikrolitreyi diğer hücre alikotlarına eklemeye devam edin. Her tüpe 200 mikrolitre taze hazırlanmış durdurma tamponu ekleyerek MNase sindirimini aynı sırayla ve MNase'ın eklendiği aynı zaman aralığında durdurun.
65 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Her örneğe 500 mikrolitre PCI ekleyin ve vorteksleme yaparak iyice karıştırın. Fazları ayırmak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 19.800 G'de santrifüjleyin.
Ve sulu fazı yeni tüplere aktarın. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir DNA saflaştırma kiti kullanarak DNA'yı saflaştırın ve numuneleri 12 mikrolitre elüsyon tamponunda elüte edin. Saflaştırılmış DNA örneğine iki ila beş mikrolitre yükleme boyası ekleyin.
Numuneleri %1.5'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın ve deney için en iyi sindirim derecesini seçin. Optimal bir sindirim derecesi, çok az veya hiç subnükleozomal fragman göstermez veya hiç göstermez ve% 70 ila 90 mono / dinükleozom oranı. Bu temsili örnekte, takip deneyleri için üçüncü ve dördüncü şeritler arasında bir ara sindirim derecesi seçildi.
MNase titrasyonuna dayanarak, her numune alikotuna uygun miktarda MNaz ekleyerek kromatini sindirin. İyice karıştırın ve ThermoMixer'da 37 santigrat derece, 800 RPM'de 10 dakika inkübe edin. Her bir alikot için 1,6 mikrolitre 0,5 molar EGTA ekleyerek MNase sindirimini durdurun ve bir ThermoMixer'da 65 santigrat derecede 10 dakika boyunca 800 RPM çalkalayarak inkübe edin.
Numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyerek toplayın ve süpernatanı atın. Hücre peletini 500 mikrolitre 1X NEB tamponu 2.1 içinde yeniden süspanse edin. Daha sonraki işlemler için beş kez 10 ila altıncı hücreye veya daha azına eşdeğer bir girdiye eşdeğer havuz örnekleri.
Yakınlık ligasyonuna geçmeden önce, MNase sindirim seviyesini izlemek için numunenin %10'unu giriş kontrolü olarak aktarın. Sindirim kontrolüne 150 mikrolitre 10 milimolar Tris, 25 mikrolitre% 10 SDS ve mililitre proteinaz K başına 25 mikrolitre 20 miligram ekleyin ve gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Kalan numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.
Peletleri 90 mikrolitre taze hazırlanmış Micro-C ana karışımında tekrar süspanse edin ve bir ThermoMixer'da 37 santigrat derece, 800 RPM'de 15 dakika inkübe edin. Mikrolitre Klenow parçası başına 10 mikrolitre beş birim ekleyin ve bir ThermoMixer'da inkübe edin. Daha sonra 100 mikrolitre taze hazırlanmış Micro-C master mix iki ekleyin.
25 santigrat derece, 800 RPM'de 45 dakika inkübe edin ve metinde açıklandığı gibi EDTA ile enzimatik reaksiyonu söndürün. Bir Termo Mikserde 65 santigrat derece, 800 RPM'de 20 dakika inkübe edin. Numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.
Numuneyi 500 mikrolitre taze hazırlanmış Micro-C ana karışım üç içinde tekrar süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 ila 20 RPM'de 2,5 saat inkübe edin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra numuneyi 200 mikrolitre taze hazırlanmış Micro-C ana karışım dörtlüsünde yeniden süspanse edin ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ThermoMixer'da 800 RPM'de 15 dakika inkübe edin.
Ters çapraz bağlama ve deproteinasyon için, numuneye mikrolitre proteinaz K başına 25 mikrolitre 20 miligram ve 25 mikrolitre% 10 SDS ekleyin ve aralıklı karıştırma ile gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Örneklere ve giriş kontrolüne 500 mikrolitre PCI ekleyin, ardından vorteksleme ile karıştırın. Fazları beş dakika boyunca 19.800 G'de santrifüjleyerek ayırın ve üst sulu fazı taze bir tüpe aktarın.
DNA'yı konsantre edin ve örnekleri 30 mikrolitrede elüte edin ve giriş kontrolleri 15 mikrolitrede kontrol eder. Mononükleozomları ve dinükleozomları ayırmak için% 1.5 agaroz jeli çalıştırın. Dinükleozomal boyuta sahip DNA parçalarını kesin ve metinde açıklandığı gibi DNA'yı çıkarın.
Numunenin 150 mikrolitresine 150 mikrolitre önceden hazırlanmış boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında inkübe edin. Tüpleri uygun bir mıknatısa yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar bekleyin. Süpernatanı çıkarın ve boncukları 300 mikrolitre 1X TBW'de yeniden süspanse edin ve bu adımı tekrarlayın.
Manyetik ayırmayı tekrarlayın ve çözelti temizlendikten sonra, süpernatanı çıkarın ve boncukları 100 mikrolitre 0.1X TE içinde yeniden süspanse edin. 50 mikrolitre 0.1X TE içinde tekrarlayın ve tekrar süspanse edin. Çözeltiyi PCR tüplerine aktarın ve metinde açıklandığı gibi DNA manipülasyonunu gerçekleştirin. Adaptör ligasyonu tamamlandıktan sonra, numuneyi 1X TBW'de yıkayın, süpernatanı atın ve boncukları 20 mikrolitre 0.1X TE'de yeniden süspanse edin. PCR döngülerinin sayısını optimize edin ve metinde açıklandığı gibi dizi kitaplıklarını yükseltin. Reaksiyon başına 250.000 hücreden elde edilen kromatin, MNaz'ın dört kat seyreltilmesiyle sindirildi.
En yüksek konsantrasyon olan 10 birim, neredeyse tamamen mononükleozomal DNA'dan oluşan aşırı sindirilmiş kromatin gösterdi. 250.000 fare ES hücresinin 0.625 birim MNaz ile sindirimi, Micro-C deneylerinde hazırlayıcı sindirimler için en umut verici başlangıç noktasını sundu. Bununla birlikte, 1 milyon hücre başına beş birime karşılık gelen üçüncü ve dördüncü şeritlerde gösterilen koşullar arasında bir ara MNaz konsantrasyonu dikkate alınmalıdır.
Yakınlık bağlı mononükleozom bandı, dinükleozomlarınkine benzer şekilde yaklaşık 300 baz çifti boyutuna sahipti. Bu nedenle, mono ila dinükleozomal bant sinyal oranı, ağırlıklı olarak mononükleozomlardan dinükleozomlara doğru kaymıştır. Hazırlanan dizileme kütüphanesinin kalitesi ve miktarı minimal PCR ile değerlendirildi.
Görselleştirme, 420 baz çiftinde ayrı bir bant gösterdi ve adaptör dimerleri için bant yoktu. Bu çalışmadaki her iki örnek de yüksek harita oranları sergilerken, iyi örneklem daha yüksek bir cis okuma oranına sahipti. Transkromozomal etkileşimlerin yüksek bir oranı, rastgele ligasyon olaylarını gösterir, ancak bazı transkromozomal etkileşimler önemli olabilir.
Ek olarak, iyi örnek, 500 baz çiftinden daha az mesafelere sahip, orta düzeyde bir ileri-geri eşleme okuma çifti oranına sahipti. Bu, iki yakınlık bağlı nükleozoma benzer bir boyuta sahip olan MNaz tarafından parçalanmayan düşük bir dinükleozom oranını gösterdi. Bu deney için uygun bir MNaz sindirim derecesi çok önemlidir.
Aşırı sindirilmiş nükleozomlar verimsiz bir şekilde bağlanır ve az sindirilmiş kromatin, dizileme kitaplığını kirletebilecek büyük bir sindirilmemiş dinükleozom fraksiyonuna sahiptir. Micro-C, lokusa özgü genom organizasyonunu son derece yüksek çözünürlükle haritalamak için bir yakalama yaklaşımıyla birleştirilebilir.
