Yazarlar sonrasında uyarlanmış ve hibridizasyon için buraya açıklanan protokolü geliştirmek için modifiye edilmiştir Anofel gambiae embriyoların, in situ hibridizasyon için protokollerin tartışma için yumuşak doku ve Yuri Goltsev in situ yöntemler geliştirmek hibridizasyon tavsiye için Marika Walters teşekkür etmek istiyorum Aedes ve Culex embriyoların yerinde. Ayrıca Adam Pare ve David Kosman tarafından verilen yararlı öneriler kabul ediyorsunuz. Biz bilimsel tartışma Osvaldo Marinotti teşekkür ediyor ve protokol metin düzenleme.

<ol>
	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Plasmodium-infected+Mosquitoes:+Salivary+Glands,+Chapter.+5.4.2.">Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2.</a> Methods in Anopheles Research. , (2007).</li><li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+analysis+of+insect+ovaries,+Chapter.+42.3.">Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , (1997).</li><li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos.">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+Embryo+Fixation,+Chapter.+3.7.">Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7.</a> Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). , (2007).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes,+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li><li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+nanos+(nos)+and+oskar+(osk)+orthologues+of+the+vector+mosquito,+Culex+quinquefasciatus.">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. &#38; Embryol. 4, 517-528 (1975).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae):+Organogenesis.">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. &#38; Embryol. 7, 273-296 (1978).</li><li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg.">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li><li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li><li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles.">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584 (2011).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

Yazarlar, herhangi bir açıklamaları var.

Situ ve kolorimetrik boyama protokolünde hibridizasyon tüm montaj sivrisinek doku ve embriyolar için buraya sunulan belirli organ ve hücre tipleri içinde transkript lokalizasyonu için yararlı bir tekniktir. Bu prosedürler bizim daha önce bildirilen yöntemlere göre, hem geniş yıkama adımları hızlandırarak ve ek teknik bilgi ve reaktif kaynaklardan sağlayan bir iyileşme vardır. Deneyimlerimize göre, melezleme sinyallerin kolorimetrik tespiti floresans tabanlı algılama düzenleri göre melezleşme sinyali hassasiyet ve netlik açısından üstündür. Ayrıca kolorimetrik tespiti gereği otomatik floresan olan embriyolar, sinyal ayrımcılık ile ilgili sorunları circumvents. Düşük bolluk transkript hedeflenen zaman hibridizasyon sinyalleri tespit Sınırlamalar, meydana ve arka plan boyama açıktır. 65 hibridizasyon sıcaklığının artmasıyla ° C geri azaltmak için bulunmuşturzemin hibridizasyon sinyalleri, ama tek hedefi özgü RNA probları tasarımı için önerilen bir alternatifi değildir. Bu protokol tüm montaj tükürük Aedes aegypti bezler ve yumurtalıklar ve Anofel gambiae, Anofel stephensi, Ae embriyoların in situ hibridizasyon gerçekleştirmek için kullanılmıştır. aegypti ve Culex quinquefasciatus. Bu yöntem diğer sivrisinek dokulara uygulanan ve muhtemelen diğer böceklerin gelenler. Ayrıca, üç vektör sivrisinek, Ae embriyonik gelişim evreleme için ilk kez karşılaştırmalı kılavuzlar için derlenmiş. aegypti, An. gambiae ve Cx. fatigans. Gözlemler sağduyulu yetiştirme koşullarında bu üç türün belirli suşları için bildirilmiştir. Bu gelişme süresi tabii sivrisinek türlerinin farklı suşları için ve farklı yetiştirme koşullarında değişiklik dikkat etmek önemlidir. In situ ekinde hibridizasyonları ana çabaları devam edenSivrisinek ve diğer eklembacaklıların transcriptomes lyze ve bu organizmaların gen ifadesinin düzenlenmesinde daha iyi bir görüntü sağlayabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ml mikrofüj tüpler </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Örnekleri görselleştirilmesi yardımcıları; az standart tüplere göre daha opak </td></tr><tr><td> Deiyonize formamid </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> DEPC su </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> % 5.25 Sodyum hipoklorit </td><td> Austin&#39;in </td><td></td><td> A-1 Marka </td></tr><tr><td> T3 RNA Polimeraz-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> -20 ° C&#39;de depolanması </td></tr><tr><td> T7 RNA polimeraz </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> -20 ° C&#39;de depolanması </td></tr><tr><td> % 95 Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand atılabilir polietilen transferi pipetler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> % 37 Formaldehit </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-grade metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop cam kapak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-heptan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-ksilen </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-iyi Nokta Plaka </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum hidroksit </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus mikroskop </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Kırmızı Clear-liner peruk bant </td><td> Doğrudan Saç </td><td> KIRMIZI-75R12 </td><td> Poly / x 12 yd bant rulo Cilt temel malzeme 0.75 </td></tr><tr><td> One ile Sequening için TOPOTA Klonlama Takımı Top10 kimyasal yetkili E. Shot coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reaksiyonlar 40 reaksiyonlar </td></tr><tr><td> Sonicated somon sperm DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> -20 ° C&#39;de depolanması </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin-AP Fab fragmanları </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA etiketleme mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> -20 ° C&#39;de depolanması </td></tr><tr><td> NBT / BCIP stok solüsyonu </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> Batı Engelleme Reaktif </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech polyester mesh (330,130) </td><td> Saati Yazdır </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 Konuları / inç, 34 mikron iplik çapı, turuncu renkli </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> PBT% 70 </td></tr><tr><td> Heparin sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> % 37 Formaldehit </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Amber ampul içinde 10 ml hacme </td></tr><tr><td> 16 oz. Kapaklı Yalnız Kağıt konteynerleri </td><td> Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam scintillatbekâr vidalı kapaklı iyon flakon </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 500, 20 ml durumda </td></tr><tr><td> Mühürlü Balonlu şal hücresel yastıklama malzemesi </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 / ayak rulo 0,188 inç kalınlığında </td></tr><tr><td> Tavuk serumu </td><td></td><td></td><td> Tam kan ya kanat damardan ya da bir yavru tavuktan kalp ponksiyonu ile toplanır edildi. Kan soğutulmuş ve daha sonra 30 dakika süreyle buz üzerinde yerleştirilmiş kadar 1 saat 37 ° C&#39;de inkübe edildi. Serum 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de toplandı ve santrifüje edildi. Oluşan yüzey maddesi (serum açıklık), kullanılıncaya kadar toplandı ve -20 ° C&#39;de muhafaza edildi. </td></tr></tbody></table> Tablo 4. In situ melezleştirme için spesifik reaktifler ve ekipman Tablo.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Sivrisinekler Arbovirüsler, protozoon parazit ve nematod gibi patojenlerin çeşitli bir dizi için bir vektör. Üreme yer sivrisinek host ve patojen etkileşim ve organlarda sivrisinek yoluyla bulaşan hastalık bulaşmasını azaltmak ve yumurta gelişimini bozabilir stratejileri için büyük ilgi oldugu dokularda ifade edilir transkript ve gen düzenleyici Araştırılması. Araçların bir dizi gen ekspresyonu zamansal ve doku-spesifik düzenlemeler incelemek ve onaylamak için istihdam edilmiştir. Burada, belirli genlerin ifade ve ürünleri birikir nerede anlayışımızı geliştiren mekansal bilgi elde etmek için geliştirilen protokoller açıklanmaktadır. Açıklanan protokolü yeniden, hangi ifadeyi doğrulamak ve bu kadın tükürük bezlerinin yanı sıra yumurtalık ve embriyoların Subselüler bölmeleri gibi sivrisinek kaynaklı patojen iletimi ile ilgili dokularında transkript birikimi desenleri belirlemek için kullanılmıştırsivrisinek üreme ve gelişme için geç. Aşağıdaki işlemleri hedef spesifik hibridizasyon sinyalleri kaybı olmadan protokolü çeşitli adımlardan etkinliğini arttırır iyileştirilmiş bir yöntem temsil eder. Toplanması, tespiti, ön hibridizasyon ve sivrisinek embriyoların hibridizasyon için belirli adımlar Bölüm B. ayrıntılı iken RNA prob hazırlanması için rehber, yumuşak doku ve fiksasyon ve hibridizasyon için genel prosedürü diseksiyonu, Bölüm A anlatılan

Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Zamansal ve mekansal gen ekspresyon analizleri fonksiyonel genomik önemli bir role sahiptir. Tüm montaj hibridizasyon<em&gt; In situ</em&gt; Doku ve hücre içi bölmeler içinde transkriptlerin Lokalizasyon belirlemek açısından faydalıdır. Burada bir hibridizasyon ana hatlarıyla<em&gt; In situ</emSivrisinekler belirli hedef dokulara değişikliklerle&gt; protokolü.

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

16.4K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Zamansal ve mekansal gen ekspresyon analizleri fonksiyonel genomik önemli bir role sahiptir. Tüm montaj hibridizasyon In situ Doku ve hücre içi bölmeler içinde transkriptlerin Lokalizasyon belirlemek açısından faydalıdır. Burada bir hibridizasyon ana hatlarıyla In situ protokolü.