저자들은 이후 적응과에서 하이브 리다이 제이션을 위해 여기에서 설명한 프로토콜을 개발하기 위해 수정된 아노 펠 레스 gambiae의 배아의 현장에서 하이브 리다이 제이션을위한 프로토콜의 논의 부드러운 조직 및 유리 제품 Goltsev위한 원위치 방법으로 개발 하이브 리다이 제이션의 조언 마리카 월터스 감사드립니다 Aedes과 Culex의 배아의 현장. 또한 아담 정지와 데이빗 Kosman 준 유용한 권장 사항을 인정합니다. 우리는 과학적 논의 Osvaldo Marinotti 감사 및 프로토콜 텍스트 편집.

<ol>
	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Plasmodium-infected+Mosquitoes:+Salivary+Glands,+Chapter.+5.4.2.">Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2.</a> Methods in Anopheles Research. , (2007).</li><li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+analysis+of+insect+ovaries,+Chapter.+42.3.">Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , (1997).</li><li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos.">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+Embryo+Fixation,+Chapter.+3.7.">Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7.</a> Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). , (2007).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes,+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li><li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+nanos+(nos)+and+oskar+(osk)+orthologues+of+the+vector+mosquito,+Culex+quinquefasciatus.">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. &#38; Embryol. 4, 517-528 (1975).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae):+Organogenesis.">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. &#38; Embryol. 7, 273-296 (1978).</li><li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg.">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li><li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li><li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles.">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584 (2011).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

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현장과 colorimetric 염색법 프로토콜의 하이브 리다이 제이션은 전체 마운트 모기 조직 및 배아를 보시려면 여기를 제시하는 것은 특정 장기 및 세포 유형 내에서 성적의 지방화를위한 유용한 기술입니다. 이러한 절차는 우리 이전에 보고된 방법을 통해 모두 광범위한 세차 단계를 능률화 및 추가 기술적인 세부 사항 및 시약 소스를 제공하는 개선입니다. 우리의 경험에서 하이브 리다이 제이션 신호 colorimetric 감지 형광 기반의 탐지 방식에 비해 하이브리드화 신호의 감도와 선명도에서 우수합니다. 또한 colorimetric 감지 본질적 자동 형광 있습니다 배아에서 신호 차별과 관련된 문제를 circumvents. 낮은 풍부 성적이 타겟으로하는 경우 하이브리드화 신호 검출에 한계가 발생 배경 염색법은 분명하다. 65 하이브리드화 온도를 높이면 ° C는 다시 감소하는 것으로 확인되었습니다지상 하이브리드화 신호, 독특 대상 특정 RNA 프로브를 설계를위한 제안 대체할 수 없습니다. 이 프로토콜은 전체 마운트 타액 Aedes aegypti의 분비와 난소 및 아노 펠 레스 gambiae, 아노 펠 레스 stephensi, 애의 배아의 현장에서 하이브 리다이 제이션을 수행하는 데 사용되었습니다. aegypti 및 Culex quinquefasciatus. 이 방법은 또한 다른 모기 조직에 적용, 그리고 아마도 다른 곤충 분들입니다. 또한, 세 벡터 모기, 애의 배아 발달의 준비에 대해 처음으로 비교 지침에 대해 컴파일된. aegypti,. gambiae 및 CX. fatigans. 관찰은 신중하고 양육 조건이 세 종류의 특정 변종을 위해보고되었습니다. 그것은 발달 시간 코스 모기 종의 서로 다른 변종과 다른 양육 조건 하에서 다를 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 현장 보충제의 Hybridizations 아나에 노력을에 지속적모기와 다른 arthropods의 transcriptomes을 lyze, 이러한 생물의 유전자 발현의 조절의 더 나은 사진을 제공할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M 트리스-HCL </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ML의 microfuge 튜브 </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> 샘플 영상에서 에이즈, 이하 표준 튜브보다 불투명 </td></tr><tr><td> Deionized 포름 아미드 </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> 4에 보관 ° C </td></tr><tr><td> DEPC 물 </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5.25 %의 나트륨 차아 염소 산염 </td><td> 오스틴의 </td><td></td><td> A-1 브랜드 </td></tr><tr><td> T3 RNA 중합 효소 플러스 </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> T7 RNA 중합 효소의 </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 95 % 에탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand 일회용 폴리에틸렌 전송 pipettes </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37%의 포름 알데히드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC 등급의 메탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 </td><td> 피셔 과학 </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 덮개 유리 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-헵탄 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-크실렌 </td><td> 피셔 과학 </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9 잘 스팟 플레이트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> 염화나트륨 (소금) </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn 레드 클리어 - 라이너 가발 테이프 </td><td> 직접 헤어 </td><td> RED-75R12 </td><td> 폴리 / X 12야드 테이프 롤의 피부 기지 재료 0.75 </td></tr><tr><td> 하나와 Sequening위한 TOPOTA 클로닝 키트 Top10 화학적-관할 E를 샷 대장균 </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 반응 40 반응 </td></tr><tr><td> Sonicated 연어 정자 DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 안티 digoxigenin-AP 팹 조각 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 1,093,274 </td><td> 4에 보관 ° C </td></tr><tr><td> 쫄지마 RNA 라벨 믹스 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 1,277,073 </td><td> -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> NBT / BCIP 재고 솔루션 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 1,681,451 </td><td> 4에 보관 ° C </td></tr><tr><td> 서양 차단 시약 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11921673001 </td><td> 4에 보관 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech 폴리에스터 메쉬 (330.130) </td><td> Saati 인쇄 </td><td> 330.34 UO PW </td><td> 330 스레드 / 인치, 34 마이크론 나사 직경, 오렌지 색상 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 시그마 </td><td> G6279-1 </td><td> PBT 70 % </td></tr><tr><td> 헤파린 나트륨 소금 </td><td> 시그마 </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37%의 포름 알데히드 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 18,508 </td><td> 호박 ampoules 10 ML aliquots </td></tr><tr><td> 16온스 뚜껑있는 솔로 종이 용기 </td><td> 제지 회사 </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 scintillat무소속의 스크루 캡과 이온 유리병 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 66022-128 </td><td> 500 20 ML 케이스 </td></tr><tr><td> 봉인된 에어 버블 랩 celluar 쿠션 재료 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 500018-081 </td><td> 10 피트 / 롤 0.188 인치 두께 </td></tr><tr><td> 닭 혈청 </td><td></td><td></td><td> 전체 혈액 중 날개 정맥이나 소년 닭의 심장 주사에 의해 수집되었다. 혈액은 coagulated 후 30 분 동안 얼음에 배치 때까지 1 H에 대해 37 ° C에서 incubated되었다. 혈청 10 분 3,000 XG에서 수집된 및 centrifuged되었다. 결과 뜨는가 (혈청을 명확히) 사용하기 전까지 수집 및 -20 ° C에 보관되었다. </td></tr></tbody></table> 표 4. 현장에서 하이브 리다이 제이션을위한 특정 시약 및 장비의 표.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

모기 arboviruses, protozoan 기생충 및 nematodes 포함한 병원균의 다양한 집합에 대한 벡터입니다. 재생에 관련된 모기 호스트와 병원체 상호 작용, 그리고 장기에이 모기 질병일 전송을 줄이고 달걀 개발을 중단하는 전략에 대해 큰 관심되는 티슈로 표현되는 성적 증명서 및 유전자 규제 당국의 조사. 도구의 숫자는 유전자 발현의 시간적 및 조직 관련 규정을 연구하고 검증 고용되었습니다. 여기서는 특정 유전자가 표현하고 그들의 제품이 축적되는 곳이 우리의 이해를 향상시켜 공간적 정보를 얻기 위해 개발되었습니다 프로토콜을 설명합니다. 설명한 프로토콜은 다시하는 표현을 확인하고 이러한 여성 침샘뿐만 아니라 난소와 배아의 subcellular 구획 등 모기 매개로 병원체 전송에 관련된 조직에 성적 축적 패턴을 결정하는 데 사용되었습니다모기 복제 및 개발에 늦었어. 다음 절차는 대상 특정 하이브리드화 신호의 손실없이 프로토콜의 여러 단계의 효율성을 향상 최적화된 방법론을 나타냅니다. 수집, 고정, 사전 하이브리드화 및 모기 배아의 하이브 리다이 제이션을위한 구체적인 단계는 부품 B.에 상세히하는 동안 RNA 프로브 준비에 대한 지침은 부드러운 조직 및 고정과 하이브 리다이 제이션을위한 일반적인 절차의 해부는 부분에 설명되어 있습니다

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Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

시간적 및 공간적 유전자 발현 분석은 기능 유전체학에 중요한 역할을합니다. 전체 마운트 하이브리드화<em&gt; 현장에서</em&gt; 조직 및 subcellular 구획 내에서 성적의 지방화를 결정하는 데 유용합니다. 여기 하이브 리다이 제이션을 설명<em&gt; 현장에서</em모기의 특정 대상 조직에 대한 수정&gt; 프로토콜.

이종 교잡<em&gt; 현장에서</em&gt; 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

16.4K 조회수.  University of California, Irvine. 시간적 및 공간적 유전자 발현 분석은 기능 유전체학에 중요한 역할을합니다. 전체 마운트 하이브리드화 현장에서 조직 및 subcellular 구획 내에서 성적의 지방화를 결정하는 데 유용합니다. 여기 하이브 리다이 제이션을 설명 현장에서 프로토콜.