著者らは、その後にハイブリダイゼーションのためにここで記述されたプロトコルを開発するために適応し、変更された、 ハマダラカの胚の in situ ハイブリダイゼーションのためのプロトコルの議論のための軟組織とユーリGoltsevその場の方法でハイブリダイゼーションの開発に助言をマリカ·ウォルターズに感謝したいと思いますヒトスジシマカとアカイエカの胚の in situ。我々はまた、アダム·パレとDavid K​​osmanによって与えられた有用な提言を認める。我々は科学的な議論とプロトコルのテキストを編集するためのオズワルドMarinottiに感謝します。

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著者らは開示しません。

全体のマウント蚊組織および胚のためにここで紹介する場と比色染色プロトコールでのハイブリダイゼーションは、特定の臓器や細胞型内転写産物の局在のために有用な技術である。これらの手順は、私たちの以前に報告された方法に比べて、両方の広範な洗浄工程の合理化と技術的な詳細および試薬ソースを提供することで改善されています。 我々の経験では、ハイブリダイゼーションシグナルの比色検出は、蛍光ベースの検出方式に比べてハイブリダイゼーションシグナルの感度と透明性に優れています。また、比色検出は、本質的に自動蛍光性である胚の信号差別に関連する問題を回避します。低濃度の転写産物をターゲットにされている場合ハイブリダイゼーションシグナルを検出するのに制限が発生し、バックグラウンド染色は明白である。 65ハイブリダイゼーション温度を上昇させる°Cは、バック減らすことが見出されているグラウンドハイブリダイゼーションシグナルが、固有のターゲットに特異的なRNAプローブを設計するための提案代わるものではありません。 このプロトコルは、全マウント唾液ネッタイシマカの腺、卵巣、 ハマダラカ、ハマダラカ、AEの胚の in situ ハイブリダイゼーションを行うために使用されています。ネッタイシマカとネッタイイエカ 。また、このメソッドは、他の蚊の組織に適用されると、おそらく他の昆虫のものです。さらに、我々は3つのベクトル蚊、 ヒトスジシマカにおける胚発生のステージングのための最初の時間の比較のガイドラインについては、コンパイルされます。ネッタイシマカ、。ハマダラカとCx。 fatigans。観測は控えめな飼育条件下では、これら3種の特定の株が報告されている。開発時間のコースは蚊種の異なる株のために、異なる飼育条件下で異なることに注意することが重要です。 ANAへの努力継続的にその場サプリメントでハイブリダイゼーション蚊やその他の節足動物のトランスクリプトームをlyze、これらの生物における遺伝子発現の調節の良い画像を提供することがあります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> Ambionの</td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1MのTris-HCl </td><td> Ambionの</td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10×PBS </td><td> Ambionの</td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambionの</td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5mlマイクロチューブ</td><td> Ambionの</td><td> AM12400 </td><td>可視化サンプル中のエイズ、標準のチューブよりも小さい不透明な</td></tr><tr><td>脱イオン化ホルムアミド</td><td> Ambionの</td><td> AM9342 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td> DEPC水</td><td> Ambionの</td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td> Ambionの</td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5.25％次亜塩素酸ナトリウム</td><td>オースティンの</td><td></td><td> A-1ブランド</td></tr><tr><td> T3 RNAポリメラーゼプラス</td><td> Ambionの</td><td> AM2733 </td><td> -20°Cでの貯蔵</td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td> Ambionの</td><td> AM2082 </td><td> -20°Cでの貯蔵</td></tr><tr><td> 95％エタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand使い捨てポリエチレン転送ピペット</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLCグレードのメタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-542A </td><td> 18×18ミリメートル</td></tr><tr><td> n-ヘプタン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-キシレン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td>パイレックス9ウェルスポットプレート</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13-748B </td><td> 100x85ミリメートル</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost /プラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75X1.0ミリメートル</td></tr><tr><td> Davlynレッドクリアライナーかつらテープ</td><td>直接髪</td><td> RED-75R12 </td><td>ポリ/ X 12ヤードテープロールのスキン基材0.75 </td></tr><tr><td>ワントップ10化学的にコンピテントE.とSequeningためのTOPOTAクローニングキット大腸菌 </td><td>インビトロジェン</td><td> K457501 K457540 </td><td> 20反応 40反応</td></tr><tr><td>超音波処理サケ精子DNA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15632-011 </td><td> -20°Cでの貯蔵</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-AP、Fabフラグメント</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 1093274 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td> DIG RNAラベリングミックス</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 1277073 </td><td> -20°Cでの貯蔵</td></tr><tr><td> NBT / BCIPストック溶液</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 1681451 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td>西部のブロッキング試薬</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11921673001 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td> Saatileneハイテックポリエステルメッシュ（330.130） </td><td> Saatiプリント</td><td> 330.34 UO PW </td><td> 330スレッド/インチ、34ミクロンのネジ径、オレンジ色</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td> G6279-1 </td><td> PBTの70％ </td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20を</td><td>シグマ</td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド</td><td>テッド·ペラ</td><td> 18508 </td><td>琥珀色のアンプルに10 mlのアリコート</td></tr><tr><td> 16オンス蓋つきのソロ紙容器</td><td>ペーパーカンパニー</td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスscintillatアタッチされていないスクリューキャップ付きバイアルイオン</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 66022-128 </td><td> 500の20ミリリットルの場合</td></tr><tr><td>シールドエアーバブルラップcelluar緩衝材</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 500018-081 </td><td> 10フィート/ロール0.188インチの厚さ</td></tr><tr><td>鶏血清</td><td></td><td></td><td>全血は、どちらの翼静脈から、または幼若鶏から心臓穿刺により採取した。血液が凝固して、30分間氷上に置いたまでは1時間37℃でインキュベートした。血清を10分間3000×gで収集し、遠心分離した。得られた上清（明らかに血清）を使用するまで-20℃で収集し、格納されていました。 </td></tr></tbody></table> 表4。in situでのハイブリダイゼーションの特異的試薬および機器の表。

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

蚊はアルボウイルス、原虫や線虫を含む病原体の多様なセットのベクトルです。蚊の宿主と病原体相互作用の組織で発現し、臓器に繁殖に関与している転写産物や遺伝子レギュレータの調査では、戦略は蚊が媒介する病気の感染を減らすと卵の開発を混乱させるための大きな関心である。ツールの数は、遺伝子発現の時間的および組織特異的調節を研究し、検証するために用いられてきた。ここでは、特定の遺伝子が発現し、それらの製品が蓄積されている場所の我々の理解を高め、空間情報を取得するために開発されているプロトコルについて説明します。記述されているプロトコルは、再され、式を検証し、そのような女性の唾液腺と同様に、卵巣および胚の細胞内コンパートメントなど蚊が媒介する病原体の伝播に関連した組織では転写産物の蓄積パターンを決定するために使用されています蚊の再生と発展に遅い。 次の手順では、ターゲット固有のハイブリダイゼーションシグナルを失わずにプロトコルのさまざまなステップの効率を向上させる最適化された方法論を表しています。 RNAプローブの調製のためのガイドライン、軟組織と固定とハイブリダイゼーションのための一般的な手順の解剖は、蚊の胚の収集、固定、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションのための具体的な手順は、パートBに記載されていながら、パートで説明されています

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Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

時間的·空間的遺伝子発現解析は、ゲノム機能解析において重要な役割を持っています。ホールマウントハイブリダイゼーション<em&gt;その場で</em&gt;組織や細胞内コンパートメント内での転写産物の局在を決定するために有用である。ここでは、ハイブリダイゼーションを概説<em&gt;その場で</em蚊の特定の標的組織のために修正を加えた&gt;プロトコル。

ハイブリダイゼーション<em&gt;その場で</em&gt;唾液腺、卵巣、および媒介蚊の胚の

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

16.4K ビュー.  University of California, Irvine. 時間的·空間的遺伝子発現解析は、ゲノム機能解析において重要な役割を持っています。ホールマウントハイブリダイゼーションその場で組織や細胞内コンパートメント内での転写産物の局在を決定するために有用である。ここでは、ハイブリダイゼーションを概説その場でプロトコル。