Os autores gostariam de agradecer a Marika Walters para o conselho de hibridização desenvolvimento de métodos in situ de tecidos moles e Goltsev Yury para discussão de protocolos para a hibridização in situ de embriões Anopheles gambiae, que foram posteriormente adaptados e modificados para desenvolver o protocolo descrito aqui para hibridização in situ de Aedes e Culex embriões. Reconhecemos também recomendações úteis dadas por Adam Paré e Kosman David. Agradecemos Osvaldo Marinotti para a discussão científica e editar o texto do protocolo.

<ol>
	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

Os autores não têm divulgações.

A hibridização in situ protocolo de coloração e colorimétricas apresentadas aqui para tecidos toda montagem de mosquitos e de embriões é uma técnica útil para a localização de transcritos dentro dos órgãos e tipos específicos de células. Esses procedimentos são um avanço em relação nossos métodos reportados anteriormente, tanto na racionalização etapas de lavagem e proporcionando amplos detalhes técnicos adicionais e fontes de reagentes. Na nossa experiência, a detecção colorimétrica de sinais de hibridação é superior em sensibilidade e clareza de sinal de hibridação em comparação com os regimes de fluorescência de detecção baseados em. Além disso detecção colorimétrica contorna problemas associados com a discriminação do sinal em embriões, que são inerentemente auto-fluorescente. Limitações na detecção de sinais de hibridação ocorrer, quando baixa abundância transcrições são alvejados e coloração de fundo é evidente. O aumento da temperatura de hibridação a 65 ° C, foi encontrada a reduzir para trássolo sinais de hibridação, mas não é um substituto sugerido para a concepção de sondas único alvo-específicas de RNA. Este protocolo tem sido usado para realizar a hibridação in situ de toda montagem glândulas salivares de Aedes aegypti, e os ovários e embriões de Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus. Este método também é aplicável a outros tecidos de mosquito, e presumivelmente aqueles de outros insectos. Além disso, nós compilamos para as diretrizes da primeira vez comparativas para a realização do desenvolvimento embrionário em três mosquitos vetores, Ae. aegypti, An. gambiae e Cx. fatigans. Observações foram relatadas para as estirpes específicas destas três espécies, em condições de criação discretos. É importante notar que o curso de tempo de desenvolvimento podem variar para diferentes estirpes de espécies de mosquitos e sob condições de criação diferentes. Hibridizações em suplemento situ em curso esforços para analisar as transcriptomas de mosquitos e outros artrópodes, e pode fornecer uma melhor imagem da regulação da expressão genética nestes organismos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga de 1,5 ml tubos </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Menos opaco do que os tubos padrão; auxilia na visualização de amostras </td></tr><tr><td> Formamida deionizada </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Água DEPC </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> O hipoclorito de sódio 5,25% </td><td> Austin </td><td></td><td> A-1 Marca </td></tr><tr><td> RNA polimerase T3 Plus- </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> O armazenamento a -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA Polimerase </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> O armazenamento a -20 ° C </td></tr><tr><td> Etanol a 95% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand pipetas de transferência de polietileno descartáveis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído a 37% </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tampa de vidro de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 milímetros </td></tr><tr><td> N-Heptano </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xileno </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex Placa Ponto 9-bem </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 milímetros </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> De hidróxido de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus lâminas de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 milímetros </td></tr><tr><td> Davlyn Red fita Toupee-liner Limpar </td><td> Cabelo Direto </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / material Pele base de 0,75 em x rolo de fita 12 m </td></tr><tr><td> TOPOTA Kit clonagem para Sequening com um tiro Top10 quimicamente competente E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reacções 40 reações </td></tr><tr><td> ADN de esperma de salmão sonicado </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> O armazenamento a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina-AP fragmentos Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA rotulagem mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> O armazenamento a -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP de solução stock </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Reagente de bloqueio Ocidental </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech malha de poliéster (330,130) </td><td> Saati impressão </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 fios / cm, 34 micron diâmetro de rosca, cor de laranja </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% em PBT </td></tr><tr><td> Sal de sódio da heparina </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído a 37% </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Alíquotas de 10 ml em ampolas âmbar </td></tr><tr><td> 16 onças Individuais recipientes de papel com tampas </td><td> O Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro borosilicato scintillatfrasco de íons com tampa de rosca solta </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml de 500 caso </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble Wrap material de enchimento celluar </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 pés / roll 0,188 polegadas de espessura </td></tr><tr><td> Frango soro </td><td></td><td></td><td> O sangue total foi recolhido quer a partir da veia da asa ou por punção cardíaca a partir de uma galinha juvenil. O sangue foi incubada a 37 ° C durante 1 h até coagulado e depois colocado em gelo durante 30 min. O soro foi recolhido e centrifugado a 3000 xg durante 10 min. O sobrenadante resultante (clarificado soro) foi recolhido e armazenado a -20 ° C até à utilização. </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Tabela de reagentes específicos e equipamento para a hibridação in situ.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Os mosquitos são vetores para um conjunto diverso de patógenos, incluindo arbovírus, protozoários e nematóides. Investigação de transcrições e reguladores de genes que são expressos em tecidos em que o mosquito hospedeiro e interagir patógeno, e de órgãos envolvidos na reprodução são de grande interesse para as estratégias para reduzir o mosquito-borne transmissão da doença e impedir o desenvolvimento do ovo. Um certo número de ferramentas foram utilizados para estudar e validar a regulação temporal e tecido específico da expressão do gene. Aqui, nós descrevemos protocolos que têm sido desenvolvidos para obter informação espacial, que aumenta a nossa compreensão de onde genes específicos são expressos e os seus produtos acumular. O protocolo descrito foi utilizado para validar expressão e determinar os padrões de acumulação de transcritos em tecidos relacionados com transmitida por mosquitos transmissão de patógenos, tais como do sexo feminino glândulas salivares, bem como compartimentos subcelulares de ovários e embriões, que retarde para reprodução do mosquito e desenvolvimento. Os procedimentos seguintes representam uma metodologia optimizado que melhora a eficiência de vários passos do protocolo sem perda de sinais de alvo específicas de hibridação. Diretrizes para a preparação do RNA sonda, a dissecção dos tecidos moles e ao procedimento geral para a fixação e hibridação estão descritos na Parte A, enquanto os passos específicos para a coleta, fixação, hibridação e pré-hibridação de embriões de mosquitos são detalhados na Parte B.

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Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Análises de expressão temporal e espacial de genes têm um papel crucial em genômica funcional. Todo mount-hibridização<em&gt; In situ</em&gt; É útil para determinar a localização de transcritos nos tecidos e compartimentos subcelulares. Aqui nós esboçamos uma hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo com modificações para tecidos-alvo específicos em mosquitos.

Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

16.4K visualizações.  University of California, Irvine. Análises de expressão temporal e espacial de genes têm um papel crucial em genômica funcional. Todo mount-hibridização In situ É útil para determinar a localização de transcritos nos tecidos e compartimentos subcelulares. Aqui nós esboçamos uma hibridização In situ Protocolo com modificações para tecidos-alvo específicos em mosquitos.