Die Autoren bedanken sich bei Marika Walters für Beratung bei der Entwicklung von in-situ-Hybridisierung danken Methoden für Weichteile und Yury Goltsev für die Diskussion von Protokollen für die Hybridisierung in situ von Anopheles gambiae Embryonen, die anschließend angepasst und wurden modifiziert, um die hier beschriebene Protokoll für die Hybridisierung in Entwicklung situ von Aedes und Culex Embryonen. Wir erkennen auch hilfreiche Empfehlungen von Adam Paré und David Kosman gegeben. Wir bedanken uns bei Osvaldo Marinotti für wissenschaftliche Diskussion und Bearbeitung der Text-Protokoll.

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	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

Die Autoren haben keinerlei Angaben.

Die Hybridisierung in situ und kolorimetrischen Färbeprotokoll präsentiert hier für whole-mount Moskito Gewebe und Embryonen ist eine nützliche Technik für die Lokalisierung von spezifischen Transkripte in Organen und Zelltypen. Diese Verfahren sind eine Verbesserung gegenüber den bereits zuvor gemeldeten Methoden, die beide bei der Straffung umfangreiche Waschschritte und zusätzliche technische Details und Reagenz Quellen. Nach unserer Erfahrung ist kolorimetrischen Nachweis der Hybridisierungssignale überlegen in der Empfindlichkeit und Klarheit der Hybridisierung Signal im Vergleich zu Fluoreszenz-basierte Erkennung Systeme. Außerdem kolorimetrischen Nachweis umgeht Probleme mit Signal Diskriminierung in Embryonen, die von Natur aus Auto-Fluoreszenz assoziiert sind. Einschränkungen bei der Aufdeckung von Hybridisierungssignale auftreten, wenn Low-Transkripte Fülle ausgerichtet sind und Hintergrundfärbung ist evident. Eine Erhöhung der Hybridisierungstemperatur auf 65 ° C wurde gefunden, zurück zu verringernBoden Hybridisierungssignale, ist aber nicht eine vorgeschlagene Ersatz für die Planung von einzigartigen Ziel-spezifischen RNA-Sonden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um in situ Hybridisierung von Gesamt-Halterung Speicheldrüsen von Aedes aegypti und der Eierstöcke und Embryonen von Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae durchzuführen. aegypti und Culex quinquefasciatus. Dieses Verfahren ist auch auf andere Gewebe Moskitos, und vermutlich auch von anderen Insekten. Zusätzlich haben wir zum ersten Mal vergleichenden Leitlinien für die Inszenierung der embryonalen Entwicklung in drei Vektor-Mücken, Ae zusammengestellt. aegypti, ein. gambiae und Cx. fatigans. Die Beobachtungen wurden für spezifische Stämme von diesen drei Arten, unter diskret Haltungsbedingungen berichtet worden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Entwicklungszeit natürlich können verschiedene Stämme von Stechmückenarten und unter verschiedenen Haltungsbedingungen variieren. In situ Hybridisierungen Ergänzung der laufenden Bemühungen um die analysieren die Transkriptome Mücken und anderen Arthropoden, und kann ein besseres Bild von der Regulation der Genexpression in diesen Organismen bieten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Weniger undurchsichtig als herkömmliche Röhren; Hilfsmittel bei der Visualisierung von Proben </td></tr><tr><td> Deionisiertem Formamid </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC-Wasser </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% Natriumhypochlorit </td><td> Austins </td><td></td><td> A-1 Marke </td></tr><tr><td> T3-RNA-Polymerase-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Einweg-Polyethylen Transferpipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-Heptan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-Xylol </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex-9-und Tüpfelplatte </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748b </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / Plus Objektträger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Red Clear-Liner Toupee Tape </td><td> Hair Direct </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / Haut-Basismaterial in 0,75 x 12 m Klebebandrolle </td></tr><tr><td> TOPOTA Cloning Kit für Sequening mit One Shot Top10 chemisch-kompetente E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 Reaktionen 40 Reaktionen </td></tr><tr><td> Beschallte Lachssperma-DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP-Stammlösung </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Western Blocking Reagent </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech Polyester-Mesh (330,130) </td><td> Saati Drucken </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 Fäden / inch, 34 Mikron Gewindedurchmesser, Farbe orange </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% in PBT </td></tr><tr><td> Heparin-Natrium-Salz </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> 10 ml-Portionen in Ampullen Bernstein </td></tr><tr><td> 16 Unzen Solo Papier Behälter mit Deckel </td><td> Das Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas scintillatIonen-Flasche mit Schraubverschluss ungebunden </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml Fall von 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Luftpolsterfolie celluar Polstermaterial </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10-Fuß-/ Rolle 0,188 Zoll dick </td></tr><tr><td> Hühnerserum </td><td></td><td></td><td> Vollblut wurde entweder vom Flügel Vene oder durch Herzpunktion aus einer juvenilen Hühnern gesammelt. Das Blut wurde bei 37 ° C für 1 h bis koaguliert und dann auf Eis für 30 min inkubiert angeordnet. Das Serum wurde gesammelt und bei 3000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand (geklärte Serum) wurde gesammelt und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Tabelle Reagenzien und Ausrüstung für die in situ Hybridisierung.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Insektenstiche können für eine vielfältige Reihe von Erregern einschließlich Arboviren, Protozoen und Nematoden. Untersuchung der Transkripte und Genregulatoren, die in Geweben, in denen die Mücke Wirt und Pathogen zu interagieren und in Organen der Fortpflanzung beteiligt sind von großem Interesse für Strategien, um durch Moskitos übertragene Krankheit Übertragung zu verringern und zu stören Ei Entwicklung zum Ausdruck kommen. Eine Reihe von Tools wurden eingesetzt, um Untersuchung und Bestätigung der zeitliche und Gewebe-spezifische Regulation der Genexpression. Hier beschreiben wir Protokolle, die entwickelt wurden, um räumliche Informationen, die unser Verständnis von denen spezifische Gene exprimiert werden und reichern ihre Produkte verstärkt zu erhalten. Die beschriebenen Protokoll wurde verwendet, um die Expression zu verifizieren und festzustellen Akkumulation Muster der Expression in Geweben im Zusammenhang mit Mücken übertragene Erregerübertragung, wie weibliche Speicheldrüsen sowie subzellulären Kompartimenten der Ovarien und Embryonen, die neuspät, um Moskito Fortpflanzung und Entwicklung. Die folgenden Verfahren stellen eine optimierte Methodik, die die Effizienz der verschiedenen Schritte in dem Protokoll verbessert, ohne Verlust der Ziel-spezifischen Hybridisierungssignale. Richtlinien für die RNA-Sonde der Aufbereitung werden die Dissektion der Weichteile und der allgemeinen Vorschrift zur Fixierung und Hybridisierung in Teil A beschrieben, während die spezifischen Schritte für die Gewinnung, Fixierung, Pre-Hybridisierung und Hybridisierung von Embryonen Mücke in Teil B sind detailliert

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Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Zeitliche und räumliche Genexpressionsanalysen spielen eine entscheidende Rolle in der funktionellen Genomik. Whole-mount-Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Ist nützlich für die Bestimmung der Lokalisierung von Transkripten in Geweben und subzellulären Kompartimenten. Hier beschreiben wir eine Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Protokoll mit Modifikationen für spezifische Zielgewebe in Mücken.

Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Der Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektor-Mücken

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

16.4K Aufrufe.  University of California, Irvine. Zeitliche und räumliche Genexpressionsanalysen spielen eine entscheidende Rolle in der funktionellen Genomik. Whole-mount-Hybridisierung In-situ- Ist nützlich für die Bestimmung der Lokalisierung von Transkripten in Geweben und subzellulären Kompartimenten. Hier beschreiben wir eine Hybridisierung In-situ- Protokoll mit Modifikationen für spezifische Zielgewebe in Mücken.