Yazarlar yazının eleştiri sağlamak için Dr. Brent Harris teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmalar NIH / NCI hibe P30-CA051008 kısmen desteklenen Lombardi Kapsamlı Kanser Merkezi Histopatoloji ve Doku Paylaşılan kaynağın gerçekleştirilmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

SPOT 1. İnşaat <ol><li> 1 dakika süre ile ya da tamamen çözülene kadar 15 ml konik bir tüp ya da 2 mi mikrofüj tüpüne ve vorteks 1 ml doku markalama boyaya Sığır Serum Albumin (BSA), 50 mg ekleyin. Not: Bu protokol için biyokimyasal Sınıf BSA kullanın. Diğer sınıflarda ve saflık test edilmemiştir iken, sınıf ve saflık SPOT başarısı üzerinde önemli bir etkisi olmazdı beklenmektedir. </li><li> Jel tamamen eriyene kadar 10 saniye artışlarla% 30 güçte bir mikrodalga bir 15 ml konik tüp Isı 9 ml hidroksietil agaroz jel işlem. </li><li> Tek bir 15 ml konik tüp içinde erimiş işleme jel ve boya-BSA çözüm birleştirin ve bir pipet ile iyice karıştırın. Çözüm vorteksleyin. </li><li> Bir kaç saat için ya da katı kadar bir buzdolabı içinde konik tüp yerleştirin. </li><li> Yavaşça konik tüp renkli jel fişi serbest bırakmak için uzun, ince, metal bir spatula ya da prob kullanın. </li><li> Cu bir neşter veya jilet kullanınJel 5 mm kalınlığında kesitler içine enine fişini t. Yuvarlak uçları çıkartın ve atık (Şekil 2A) olarak imha ediniz. </li><li> Histoloji kasetlerinde düz jel fiş bölümleri yerleştirin ve 1 saat% 70 etanol içinde tutun. 24 saatlik bir süre boyunca en az 3 değişiklikler için% 70 etanol çözeltisi 2-4 saat değiştirin. </li><li> (1 saat boyunca her birinin (örneğin, alifatik hidrokarbonlar çözelti, 3 kez temizleme daha sonra açık bir% 70 etanol,% 80 etanol,% 95 etanol,% 100 etanol (3 x değişiklikleri): El, bir etanol serisi (1 saat her birinden jel bölümleri işleme ksilenler yerine)) bu protokol kullanılmıştır, ksilenler ya da el ile ya da bir doku processer altında) da kabul edilebilir, ve 1 saat her), erimiş parafın (3x sızmasıdır. Not:% 100 etanol tam dehidrasyon öncesinde, boya otomatik doku işlemci diğer doku ve sıvı reaktifler etkileyebilecek jel fiş sızabilir. Böyle, manuel rehidrasyon tavsiye edilir gibi, ancak otomatik işleme equ olduğunumüttefiki etkili. </li><li> Metodolojisi (Şekil 2B) katıştırma standart parafin kullanılarak göm birden işlenmiş jel bölümleri. Blok soğumaya ve sertleşmeye ve daha sonra oda sıcaklığına çıkmasına izin verin. </li><li> Blok (Şekil 2C) tükenene kadar gömülü jel kesimlerinden nOKTA çekirdeklerini çıkarmak için istenilen büyüklükte bir dermal yumruk iğne kullanın. Bir tek blok 20 x 2 mm 2 çekirdek kadar sağlayabilir. Serin bir çekirdeği saklayın. Bu protokol dermal yumruk kullanın Şekiller, bkz 1,5 mm (Şekil 1D, 2D ve) ya da 2 mm (Şekil 1B, 1C ve 2C). </li></ol> 2. Orient Olmayan dizilmiş Bloklar noktalar kullanma <ol><li> İstediğiniz yerleri ve birlikte gömülü bireysel doku parçalarının her kimliklerini ve spot yerini belirtmek için bir doku yönlendirme şeması oluşturun. NOT: Doku yönlendirme şeması p içeren resimli haritasıtanımlayıcıları ve spot konumu ile etiketlenmiş tüm doku parçaları hysical yerleri. Bu elektronik oluşturulabilir veya elle çizilmiş olabilir. diyagram en son ürünü kullanırken teknisyen ve araştırmacı uygun ne olursa olsun yöntemi kullanılarak oluşturulmalıdır. Numuneler kolayca mikroskobik analizi sırasında tespit edilebilir, böylece bu harita araştırmacı için rehber olarak görev yapacak. Bu protokolde kullanılan harita elle çizilmiş. Bu doku, her parça ve spot çizilmiş ve gerçek doku bloğu ve slayt aynı pozisyonda etiketli bir doku blok ve cam mikroskop lamı göstermektedir. </li><li> Düzgün grossing ve işlem aşamaları boyunca tespit kalır sağlanması, normal doku parçaları işleyin. % 70 etanol,% 80 etanol,% 95 etanol,% 100 etanol (x3 değişiklikleri), alifatik hidrokarbonlar (ksilen yerine) (x3 değişiklikleri) ve erimiş doku infiltrasyonu parafin at: Bu protokol için 1 saat her dokuları işlemek 60 ° C (x3 değişiklikleri). NOT:ll dokular, standart histoloji laboratuvar prosedürleri takip işleme tabi tutulmalıdır. Bu durum, bireysel laboratuvar prosedürü, doku boyutu ve türü değişken olabilir, ama bu bir oryantasyon aracı olarak nokta kullanma yeteneği etkilemez. </li><li> Doku oryantasyon şemasına göre doğru atanan yerlerde gömme istasyonu doku parçaları düzenlemek. Her blokta nOKTA ve doku parçaları düzenlemek için nasıl teknisyeni rehberlik için bir referans olarak doku oryantasyon şeması kullanın. NOT: şemasında çizildiği gibi gömme teknisyen aynı düzende gömme istasyonu doku parçaları gömme istasyonu yanında elle çizilmiş oryantasyon haritası koymak ve düzenlenmiş bu protokolde. Bu, tüm doku parçaları, nihai ürün içinde doğru bir şekilde tanımlanabilir kalmasını sağlar. Bu çoklu doku blokları başarıyla kullanımı için çok önemlidir. </li><li> Tüm doku parçaları blokta gömülü olarak daha nOKTA çekirdek uzun boylu olduğundan emin olun. </li><li> Standart gömme yöntemi kullanılarak doku oryantasyon şemasına göre uygun yerlerde daha sonra doku parçaları ve son (enine) spot gömün. Gerektiğinde parafin nOKTA (lar) (1-2 dk) üzerinden düşmeyecek yeterince katılaşmış kadar, forseps ile dik nokta (lar) tutun. </li><li> Standart metodoloji kullanılarak nokta ile Bölüm ve leke parafin kesitleri. <ol><li> Bölümler, bir pozitif yüklü cam slayt, 40 ° C&#39;de bir su banyosu üzerinde yüzen ve yapışmış izin verin (yüksüz slaytlar test edilmemiştir). En az 20 dakika süreyle 60 ° C&#39;de bir kurutma fırınında slaytlar kurutun. </li><li> Aşağıdaki reaktifler ile bir otomatik Stainer slaytlar yerleştirin ve işlenmiş: ksilenler (ksilenler 1-5 dakika, ksilenler 2 ve 3-2 dakika, her biri),% 100 etanol (2 dakika),% 95 etanol (1 dakika), 80 % etanol (30 sn),% 70 etanol (30 sn), çalışan musluk suyu (2 dk), hematoksilin (1.5 dakika), çalışan musluk suyu (3 dk), asit alkol (1 dakika), çalışan musluk suyu (2 dk ), bluing reaktif madde (1 dakika), akan su (2 dakika),% 80 etanol (30 sn), eozin (1 dakika), akan su (10 sn),% 80 etanol (1 dakika),% 100 etanol (3 değişikliği, 2 dk), ksilenler (3 değişiklik, 30 saniye) ekstrakte edildi. </li><li> Montaj orta monte cam lamelleri ile slaytlar örtün. NOT: Bu protokol, histotechnician 5 um bölümlerde bir mikrotom üzerinde parafın bloklar kesitli. Biz otomatik bir Boyayıcı kullanılan bu protokol için, ancak eşit sonuçlar manuel boyama ile elde edilebilir. </li></ol></li></ol> TMAlar 3. nOKTA (Manuel TMA Kit) <ol><li> 2.1 tarif ve spot istenen yer (ler) atamak gibi bir doku yönlendirme şeması oluşturun. </li><li> Bir gömme istasyonunda erimiş parafin ile TMA kalıp doldurun. Kalıp soğutma gibi, doku oryantasyon şemasında gösterilen istenen yerlerde TMA kalıp kenarlarında ucundaki nokta (lar) embed. Gerektiğinde, parafin ha kadar dik forseps ile nokta (lar) tutuns nOKTA (lar) (1-2 dk) üzerinden düşmeyecek yeterli katılaşmış. </li><li> Üreticinin talimatlarına ve dizi marjları (Şekil 2D) Spot (lar) ın konumu ile ilgili olarak TMA çekirdekleri toplayın ve standart kesit ve boyama protokolleri uygulayın. NOT: Bu protokolde kullanılan kesit ve boyama yöntemleri görmek için adım 2.6 bakınız. </li></ol>

<ol>
	<li>Jawhar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+rapidly+evolving+diagnostic+and+research+tool.">Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool.</a> Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).</li><li>Dhir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+an+overview.">Tissue microarrays: an overview.</a> Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).</li><li>Saxena, R., Bade, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7+Tissue+Microarray+–+Construction+and+Quality+Assurance.">Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance.</a> Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , (2013).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).</li><li>Rangel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+microarray:+helpful+hints.">The tissue microarray: helpful hints.</a> J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).</li><li>Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+immunophenotyping+of+43+ferret+lymphomas+using+tissue+microarray+technology.">High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology.</a> Vet. Path. 44, 196-203 (2007).</li><li>Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+one+size+does+not+fit+all.">Tissue microarrays: one size does not fit all.</a> Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).</li><li>Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray-based+immunohistochemical+study+can+significantly+underestimate+the+expression+of+HER2+and+progesterone+receptor+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.">Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).</li><li>Wampfler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+numbers+of+cores+based+on+tissue+microarray+antibody+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer.">Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer.</a> J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).</li><li>Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+players+in+hepatocarcinogenesis:+Limits+and+opportunities+of+using+tissue+microarray+(TMA).">Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA).</a> Microarray. 3, 91-102 (2014).</li><li>Miettinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+multitissue+blocks+without+special+equipment.">A simple method for generating multitissue blocks without special equipment.</a> Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li><li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing.">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li><li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).</li><li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft&#8217;s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Noktalar Başarılı hazırlanması ve kullanımı birkaç teknik adımda dikkatli bağlılık gerektirir. Hidroksietil agaroz Erime yavaş ve düşük ısıda yapılmalıdır. Yüksek ısıda hızla Erime optimum sonuçlar daha az agaroz bazı arıza neden olabilir. Işlenmesi için parçalar halinde boya yüklü fişler keserken, her parçanın kalınlığı fazla 4.5 mm ve 7 mm&#39;yi aşmaz emin olun. bunlar kalınlığında üniform 5 mm gibi yuvarlatılmış uçları atık olarak kaldırılır. 5 mm&#39;den az ade...

Tek bir parafin blok içinde birden kişilerden doku örnekleri embed yeteneği, tedavi ve bireyler arasında kolay yan yana karşılaştırma sağlayan slaytlar arasındaki değişkenliği ortadan kaldırır ve kesit ve örneklerin boyanması maliyetini ve iş yükünü azaltır. Bu çok-doku blokları tipik olmayan bir dizi düzeninde birden bireylerden alınan doku içeren her iki doku mikrodizileri (TMA) ya da parafin bloklar olarak üretilir. Örnek kimlik Bakım herhangi bir çok doku analizi başarısı için kritik öneme sahiptir. Araştırmacılar, analiz verimliliğini artırmak slaytlar arasındaki farklılıkları azaltmak, değerli doku kaynaklarını korumak, zaman ve deneyler 1 maliyetini azaltmak için onların gelişimi beri TMAlar kullanarak olmuştur. TMAlar Doğru yönlendirme doku çekirdekleri 2-4 çekirdek gruplarının asimetrik düzenleme 3, 5 (örneğin, contro arasındaki boşluk, satır veya sütun olmak üzere, çeşitli yöntemler kullanılarak yapılabilirTedavi vs l) &quot;işaret&quot; çekirdek 6 ve TMA matrisin 3 dışında bulunan özel oryantasyon çekirdek. Bu yöntemler TMAlar için iyi çalışır rağmen, çoğu doku çekirdekleri zamanla tükenmiş gibi tanımlayıcıları kafa karıştırıcı hale gelebilir olarak boşluklar ve boşluk değerli TMA çekirdek alanı ve TMAlar tüketir. Onlar tanımlayıcı olarak tekdüze mikroarray çekirdek sıkıca sunumda anomaliler güveniyor çünkü Ayrıca, bu yöntemler bir dizi formatında olmadan çoklu doku bloklarında kullanılmak için uygun değildir. Çoğu olmayan dizilmiş çok doku blokları bu sapmaları yerlerinden olarak kılan yapısal dizi ızgara görüntülemek yok, tanımı gereği, düzgün olmayan dokuları uyum ve olmalıdır. Bir TMA, en büyük dezavantajlardan birini kullanarak pek çok avantajı olmasına rağmen, her zaman büyük ölçüde heterojen dokusu 1 temsilcisi değildir çekirdeklerin, küçük boyutudur. Sigara dizilmiş çok doku blokları t birçok sağlamako bir TMA faydaları, ancak daha büyük doku örnekleri, ya da hayvan çalışmalarından elde edilen tüm organları içerir. Tek çekirdeği kullanarak Doku mikrodizileri ilgi protein dayalı tüm doku bölümleri ile uyumu değişen ve birçok artan uyum 7-11 için birden fazla çekirdeği gerektirir. Nedeniyle karmaşıklığı ve bazı biyomarker fenotipleri heterojen doğası, TMAlar hala yetersiz olabilir çekirdek bile çok sayıda (&gt; 10) ile ve analiz 8 mikrodizilerinden farklı yöntemler gerektirebilir. Ayrıca, TMA inşaat teknik olarak zor bir zaman tüketen, ve doku arrayer başlangıç ​​maliyeti ve yatırımı veya erişimi gerektirir. Sigara dizilmiş çok doku blokları önemli ölçüde daha az zaman ve çaba ile herhangi bir temel laboratuvar yapılan ve diziler izin vermek veya maliyetlerini düşürmek ve analizi basitleştirmek için bir araç olarak daha fazla doku gerektiren çalışmalar için geçerli bir alternatif olabilir. Sigara dizilmiş çok doku blokları benzer güvenilir gerektiren veyaientation markör Örnek kimlik izlemek için, ancak, bu markerlerin gelişimi sınırlanmıştır. Doku yönünü anlatan literatürün çoğu bu tür mürekkep 12 ile doku dövme gibi bireysel doku parçaları, gömme için doğru fizyolojik yönü üzerinde duruluyor, işlemden önce 13 agar-jelatin içinde dokuların ön gömme ve çentik 14 veya dikiş 15 ile bazı dokuların işaretleme . Işlevsel olsa da, bu yöntemler nedeniyle sınırlamalara çoklu doku blokları belirteçleri olarak ideal değildir. Bir dikiş hızla aracılığıyla bölümlere edilecek ve her bölümde görünür olmayabilir. Işleme ve gömme sırasında doğru yönlenmede doku devam edebilir agar jelatin teknikler kullanılarak ön gömme ancak parafin bloğu ve slaytlar çoklu numuneler arasında ayırt etmek için bir görsel işaret temin etmez. Doku üzerindeki çentikler veya boya analizi komplike veya önemli morfolojik ayrıntıları occlude. Alternatif olarak, doku, kimlikolmayan bir dizilmiş çoklu doku bloğu bir asimetrik düzenlemesinin doku parçalarının yerleştirilmesi vasıtasıyla yapılmaktadır, ancak bu 3 ya da daha fazla doku parçaları gerektirir ve analiz için dokuların uygun düzenleme için yeterli olmayabilir edilebilir. Numune Oryantasyon Etiketi (Spot) açıkça çoklu doku bloklar halinde dokuları tespit etmek kolay ve ucuz bir yöntem olarak geliştirilen ve mevcut oryantasyon yöntemleri üzerinde birçok faydalar sunmaktadır. NOKTA Hidroksietil agaroz jeli işleme ve doku işaretleme boyası, oluşan ve parafin (Şekil 2C) ile infiltre küçük, renkli, çekirdeğidir. NOKTA çekirdeği çok doku parafin blok içinde tek bir dokuya sonraki ucunda gömülü ve blok ve her bölümde bir parlak renkli nokta olarak görünür - açıkça blok ve bölümlerin doğru yönünü gösteren (Şekil 1A D) Kolay doku tanımlama için.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Çok doku parafin blokları verimlilik artışı, deneysel bütünlüğü ve azaltılmış zaman ve maliyet ile yüksek verimlilik analizi sağlar. Doku mikrodizileri çoklu doku parafin bloklar çoğunluğunu oluşturan, ancak giderek, araştırmacılar planlama ve teçhizat önemli yatırım yapmadan doku mikrodizilerinin avantajları birçok sağlayabilir birden bireylerden daha dokuları içeren olmayan dizilmiş blok kullanıyor. Herhangi bir çok doku analizi önemli bir bileşeni, her bir doku tanımlamak için kullanılan yönlendirme yöntemidir. Yöntemler uygun oryantasyon ve çoklu doku blokları dokuların belirlenmesi korumak için mevcut olmasına rağmen, pek çok, bir dizi içindeki değerli alanı tüketebilir dizilmemiş bloklar için çok uygun değildir ve / veya standart histoloji laboratuarda üretilmesi zordur. Numune Oryantasyon Etiketi (Spot) açıkça parafin blok ve tüm doku kesitlerinde fo görünür basit, düşük maliyetli yönlendirme aracıdizilmiş olan ve olmayan dizilmiş düzenleri r güvenilir örnek tanımlama. Nokta o dokuya doğrudan bir değişiklik gerektirmez olmayan dizilmiş blokları için varolan yönlendirme yöntemlerine göre avantajlar sağlamaktadır, doku parçalarının düzenlemesinde esneklik sağlar.

NOKTA tüm parafin kesitlerde yuvarlak, parafin bloğunda parlak renkli nokta (Şekil 1A ve 2D) olarak görünür, ve H &amp; E veya İHK boyama işlemi ile cam slayt üzerinde kalır (Şekil 1B - 1D ve 2D). Bu bariz bir görsel işaret yardımları, hem her doku parçası belirlenmesinde histotechnician ve araştırmacı ve histotechnician olarak iletişim kolaylaştırır mikroskopta slayt veri toplama araştırmacı doku parçaların...

Watch this Scientific Journal Video about SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks at JoVE.com

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Numune Oryantasyon Etiketi (Spot) amacı çoklu doku parafin bloklar bireysel doku tanımlanmasında yardımcı olmak için bir oryantasyon aracı olarak işlev etmektir. Bu protokoller, ortak, düşük maliyetli histolojisi malzemelerden kolayca inşa edilmiş ve parafin bloklar ve kesitlerde güvenilir bir görsel belirteç olarak hizmet eder gösterilmektedir.

Doğru DOKU Çok doku blokları her zaman nokta

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Görüntüleme.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  Numune Oryantasyon Etiketi (Spot) amacı çoklu doku parafin bloklar bireysel doku tanımlanmasında yardımcı olmak için bir oryantasyon aracı olarak işlev etmektir. Bu protokoller, ortak, düşük maliyetli histolojisi malzemelerden kolayca inşa edilmiş ve parafin bloklar ve kesitlerde güvenilir bir görsel belirteç olarak hizmet eder gösterilmektedir. 

Video: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biyoloji

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...