Name: a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae
Uploaded: 2015-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae at JoVE.com

Biz DNA mikro slayt üretimi ile yardım için Anne de Jong ve Siger Holsappel teşekkür ederiz. Biyoinformatik analiz için Anne de Jong destek de beğeni topluyor. Biz de kağıt gözden Jelle Slager teşekkür ederiz. Muhammed Afzal ve İrfan Manzoor YÖK Pakistan fakülte geliştirme programı kapsamında GC Üniversitesi, Faisalabad, Pakistan tarafından desteklenmektedir.

1. Medya hazırlanması, ve Hücre Kültürü <ol><li> S. büyütün Daha önce açıklandığı gibi 11 pneumoniae D39 yabani tip suşu 21. Kimyasal olarak 6.4 15 bir son pH Ortamı (CDM) Tanımlanmış 50 ml (50 ml, 1/100 oranında steril tüp) ile% 10 gliserol içinde o C -80 ° C&#39;de muhafaza hücreleri ile inoküle, ancak bu amino asit, L-serin ihmal Karışım. Not: İki farklı CDMS kullanıldı; L-serin (10 mM) olan maksimum bir konsantrasyonu ihtiva eden L-serin (150 uM) ve en az bir konsantrasyon ihtiva eden on. Bu minimum konsantrasyonu temelde insan kan plazmasındaki L-serin konsantrasyonudur ve amacı S. gen ekspresyonunu karşılaştırmaktır Bu iki koşul altında pneumoniae D39 suşu. </li></ol> Toplam RNA İzolasyon 2. <ol><li> Malzemeler <ol><li> Toplam RNA&#39;nın izolasyonu için bir asit fenol RNA cinsi kullanın. </li><li> Macaloid: <ol><li> 2 gram Askıya100 mi TE içinde macaloid ve 5 dakika kaynatılır. 50 ml TE, pH 8 ve mağaza 4 ° C, oda sıcaklığında, 5 dakika, tekrar süspansiyon için 2000 x g &#39;de çözelti macaloid gels.Centrifuge kadar oda sonikasyon soğutun. </li></ol></li><li> Çözümler: <ol><li> Dietil pirokarbonat (DEPC) ile tüm çözümleri davranın. 15 dakika için 37 ° C &#39;de O / N inkübe ve otoklav, 100 ul DEPC / 100 ml çözelti ilave edin. </li></ol></li></ol></li><li> Metodoloji <ol><li> S. 50 ml büyümeye orta-üstel faz (OD ~ 0.3) kadar 37 o C (hiçbir sallayarak) 50 ml&#39;lik tüplerde pneumoniae D39 hücre kültürü. 2 dakika boyunca 10.000 x g, 4 ° C&#39;de santrifüje kültürleri. Ortamı atılır ve hemen sıvı nitrojen içinde hücre pelletleri dondurma. </li><li> Karışımlar 300 ul kloroform: IAA, (24: 1) ve 300 ul fenol (asit fenol RNA derecesi). Aşama 2.2.3 organik fazın 500 ul kullanın. </li><li> RNA ücretsiz vidalı kapaklı tüpler önceden aşağıdaki karışımı hazırlayın: 00,5 gr cam boncuklar, 50 ul% 10 SDS, 500 ul fenol / kloroform: IAA, (aşama 2.2.2 gibi hazırlanan), macaloid katman (150-175 ml, daha çok yapışkan olduğundan tam olmayan şekilde). 400 ul TE (DEPC) hücre pelletleri tekrar ve vidalı kapaklı tüplere yeniden süspanse hücreleri ekleyin. </li><li> Hücreleri kırmak için, buz üzerinde 1 dakika arayla 2x 60 &quot;bakliyat için bir boncuk çırpıcı (&#39;edilen homojen&#39;) vida kapaklı tüpler yerleştirin. Santrifüj 10,000 x g (4 ° C) &#39;de 10 dakika süre ile numuneler. </li><li> , Yeni bir tüp, üst faz transfer 500 ul kloroform ekleyin: IAA (24: 1) ve santrifüj, 5 dakika boyunca 10,000 x g (4 ° C). </li><li> Lizis / bağlanma tamponu 2 birimleri (1 mi) ilave yeni tüplere üst fazın 500 ul aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole ve üreticisi firmalara tavsiye protokolü izleyin. </li></ol></li></ol> 3. RNA Temizleme &lt;<html> ol&gt; <li> Toplam RNA, DNA kontaminasyonu ortadan kaldırmak 100 ul DNaseI karışımı (90 ul DNAz tamponu ve 10 ul DNaseI) ekleyin ve 15-25 ° C&#39;de 20-30 dakika inkübe etmek. </li><li> Yıkama RNAz kiti kullanılarak RNA temizlenmelidir. Elute edilmiş hacim 50 ul elde edilir. </li></ol> RNA 4. analizi <ol><li> Bir spektrofotometre ile RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. (Şekil 2) aşağıdaki gibi bir tahlil kullanılarak RNA kalitesini belirler. <ol><li> 20-200 ng / ul konsantrasyon elde etmek için saf suyun 50 ul örnek 1 ul seyreltin. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre BioAnalyser kaliteyi kontrol etmek 1 ul seyreltilmiş RNA örneği kullanın. </li></ol></li><li> Not: 23S bir oranı yaklaşık 2.0 16S iyi sayılır 1 A260 ünite RNA 40 ug / ml &#39;ye karşılık gelir.. Etiketleme için önerilen miktar 10-20 mikrogram olduğunu. </li></ol> 5. cDNA Hazırlama ve Etiketleme ntent &quot;&gt; Not: Aşağıdaki protokol cDNA hazırlanması ve etiketleme için izledi. <ol><li> Tavlama <ol><li> Ev yapımı slaytlar veya şirket yapılan slaytlar için 5 ug toplam RNA 10-15 mikrogram konsantrasyonunu tutarak, 300 ul PCR tüpleri tavlama reaksiyonu gerçekleştirin. 2 ul Rasgele nonamers (1.6 ug / ul) ile RNA karıştırın ve 18 ul bağlanma karışımının nihai bir hacim kalacak gerektiğinde nükleaz içermeyen su ilave edin. </li><li> 5 dakika boyunca 70 ° C &#39;de tavlama karışımı tutun. Bundan sonra, 10 dakika (tavlama) oda sıcaklığında karışımı soğumaya ve gerekirse, tüpün dibine tepkileri aşağı doğru döndürün. En az 1 dakika boyunca buz üzerinde, reaksiyon tüpleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Ters Transkripsiyon <ol><li> T, 18 ul bağlanma karışımına ul ters 6 ul 5x birinci zincir tamponu oluşan 12 ul ana karışım (3 ul 0.1 M DDT, 1.2 ul 25x AA dUTP / nükleotid karışımı ve 1.8 ekleyin: aşağıdaki gibi ters transkriptaz karışımı hazırlayınranscriptase (şirket yapımı slaytlar için 1 ul). 42 ° C&#39;de 2-16 saat boyunca, reaksiyon karışımı tutun. </li></ol></li></ol> 6. mRNA Bozulması ve cDNA saflaştırılması <ol><li> Reaksiyon karışımından mRNA indirgeme, yaklaşık 15 dakika boyunca 37 ° C de 3 2.5 M NaOH ul ve yeri ekleyin. 2M NaOH etkisiz hale getirmek için serbest asit HEPES Daha sonra, 15 ul ekle. </li><li> PCR temizleme sütunlar kullanılarak cDNA karışımı arındırın ve üreticinin protokolünü takip ediniz. </li></ol> CDNA Konsantrasyon 7. ölçümü <ol><li> Bir spektrofotometre üzerinde cDNA konsantrasyonları ölçün. Etiketleme ile devam etmek, cDNA konsantrasyonu en az 60 ng / ul (ev yapımı slaytlar) veya 20 ng / ul (şirket yapımı slaytlar) olup olmadığını kontrol edin. </li></ol> Amin reaktif boya kullanılarak ve saflandırma için cDNA 8. Etiketleme <ol><li> CDNA etiket amin-reaktif boya kullanın. Doğrudan bir alikot (5 ul) ile cDNA karışımıamin-reaktif boya. </li><li> 60-90 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe karışımı ve boya etiketli cDNA arıtılmadan doğrudan devam edin. PCR, temizleme kolonu kullanılarak ve üreticinin protokolü izlenerek, boya etiketli cDNA saflaştırılır. Elüsyon tamponu, 50 ul cDNA Zehir. </li></ol> Etiketli cDNA 9. Ölçüm <ol><li> CDNA&#39;ya amin-reaktif boyalar dahil edilmesini ölçmek için bir spektrofotometre kullanılır. Amin reaktif boyaların konsantrasyonu 50 ul bir toplam hacim içinde en azından 0.5 pmol / ul olduğundan emin olun. </li></ol> Etiketli cDNA Örneklerinin 10. Karıştırma <ol><li> Ev yapımı slaytlar için cDNA konsantrasyonda en fazla 30% &#39;den fazla bir farkla hibridizasyon için tüm etiketli cDNA kullanın. Şirket yapımı slaytlar için, cDNAkonsantrasyonuyla 2 kat fark daha fazla olan cDNA kullanın. Not: normal olarak, cDNA yaklaşık 300 ng şirketi yapımı slaytlar için gerekli olan, req ile karşılaştırıldığında çok küçük olanEv yapımı slaytlar için cDNA miktarını edinilmiş. </li></ol> 11. Hibritleşme ve Yıkama <ol><li> (40 ul maya RNA ile ev yapımı) demi su, etanol% 99, SHY Tampon: Aşağıdaki reaktifler kullanın. SHY maksimum 1 ml hazırlayın. </li><li> Cihaz ve çözeltiler hazırlanması <ol><li> Kurutmadan önce vakum soğutucular ve ısıtıcı en az 1 saat açın. (45 ° C kullanın, S. pneumoniae DNA mikrodizilerinin için) doğru hibridizasyon sıcaklığı ayarlanabilir set noktası ile, hibridizasyon fırın açın. Benzer şekilde, 30-60 dakika boyunca melezleme kasetini ve yerleåtirmeden. </li><li> En az 30 dakika boyunca 68 ° C&#39;de ÇEKİNMEYEN tampon ısıtın. </li></ol></li><li> Örnek hazırlanması (cDNA etiketli) <ol><li> Etiketli cDNA&#39;lann (maksimum% 30 fark) eşit miktarda birleştirin. Hacmi daha küçük 7 ul kadar yüksek sıcaklığı (yakl. 40 dk) vakum konsantratörü kullanarak örnek kurulayın. </li></ol></li><li> Kaldırma-slip <ol><li> Temiz kaldırıcı-fişleri kullanın.Not: 30 ul slayt üzerinde yüklenebilir ±. </li><li> Sabun, musluk suyu ve% 100 etanol bol kaldırıcı-fişleri temizleyin. Not: Kirli kaldırıcı fişleri yüksek arka plan verin. </li><li> Hava toz parçacıklarını uçurmak için havalı tabanca ile kaldırıcı-fişleri kurulayın. Yanlarda beyaz teflon kaplama aşağı bakacak şekilde slayt temiz bir kaldırıcı-slip yerleştirin. </li></ol></li><li> (Etiketli cDNA) hibridizasyon tamponu ekleme <ol><li> 7 ul H2O içinde kurutulmuştur boya örnekleri eritin ve 2 dakika boyunca 94 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hemen, 35 ul ısıtılmış SHY tampon (68 ° C) ekleyin çökeltilerin kurtulmak için 1 dakika maksimum hızda yavaşça ve spin karıştırın. Yüklenene kadar yaklaşık 5 dakika boyunca 68 ° C&#39;de prob önceden ısıtın. </li></ol></li><li> Slide-kaldırıcı-kayma montaj ve ön ısıtma. <ol><li> 50 ° C&#39;de bir ısı blokta hibridizasyon slayt tutucu yerleştirin. Isıtmalı hibridizasyon slayt tutucu ve p kaldırıcı kayma DNA mikroarray slaytlar yerleştirinBir dakika için kaldırıcı-kayma ile slayt ısıtın. Mümkün olduğunca çabuk bir sonraki adımları uygulayın. </li><li> Sürgünün sonunda örnek hedef 40 ul ekle. Sıvı kılcal zorla cam yüzeyler arasında akmasına izin verin. Yavaş ve dikkatlice pipetlenmesini gerçekleştirin. </li><li> Her zaman kaldırıcı kayma yatay ile slaytlar tutun ve kaldırıcı kayma kıpırdamadı emin olmak için yavaşça hareket ettirin. </li><li> Melezleme fırın dışına önceden ısıtılmış hibridizasyon kaseti alın ve makineyi kapatın. Yer filtre kağıdı hibridizasyon kaset 3 ml 2x SSC (standart salin sitrat) ile ıslatılmış. </li><li> Yavaşça melezleme kaset slaytlar ile melezleme slayt tutucu yerleştirin. Melezleme kasetini kapatın ve (yaklaşık 16-18 saat) fırında tekrar hibridizasyon koymak. </li></ol></li><li> Slayt yıkama <ol><li> I, II ve III, taze yıkama tamponları (yıkama adımı başına 750 mi) hazırlayın. 500 I-yıkama tamponu mi için, 2 x SSC /% 0.5 SDS kullanın. 500 için yıkama-buff mler II, 1 x SSC /% 0.25 SDS kullanın. 500 ml için yıkama tamponu III kullanımı 1 x SSC /% 0.1 SDS (isteğe bağlı) </li><li> 30 ° C sıcaklıkta yıkama tampon yerleştirin (emin olmak için, SDS çözündürülür). </li><li> Cam borunun konik alt üzerinde durana kadar 50 ml dolu bir Falcon tüpü içine, çok yavaşça mümkün olduğu kadar çabuk slaytlar daldırın ama yıkama tamponu. </li><li> Tüpün dibine kaldırıcı-kayma lavabolar, dizi çizmeden cımbız ile slayt çıkar ve yıkama istasyonu rafa koymak bir kaç saniye sonra. Hiçbir zaman boşluğu ile yıkama ile devam edin. </li><li> Yıkama tamponu ml (bir yıkama istasyonu) 500, 5 dakika için slaytlar yıkayın. Yıkama tampon ml 500 20-30 dakika (çamaşır istasyonu) II ikinci bir yıkama ver. Benzer bir şekilde, yıkama tampon ml 500, 5 dakika için slaytlar yıkama III (isteğe bağlı) (yıkama istasyonu). </li><li> 2000 rpm&#39;de 2 dakika için slaytlar kurutun. </li></ol></li></ol> 12. Mikroarray Analizi <ol><li> Tarama görüntülerive tarayıcıya ilgili dalga boylarına sahip bir klasör &quot;Vallahi Projesi&quot; olarak kaydedin. </li><li> Bu yazılımı çalıştırdıktan sonra, daha önce 22. açıklandığı gibi başlangıçta taranmış dosyaları analiz etmek yazılımını kullanın, &quot;Kırmızı&quot; ve yeşil görüntü dosyası (-.635) gibi kırmızı görüntü dosyası (-.550) yüklemek için &quot;Görüntü Aç&quot; sekmesini seçin &quot;Yeşil&quot;. Sekmesini 22 &quot;Yük Dizi Listesi&quot; seçerek görüntü dosyası S. pneumoniae dizi listesi olan gal dosyası (.gal) yükleyin. Not: Bu dizi listesi, 48 ızgaraları oluşan her ızgara üzerinde 16 satır ve 15 sütun vardı. Izgara üzerindeki her nokta bir tek geni temsil ve gen adı da dahil olmak nokta bilgileri spot açıklama dosyası aracılığıyla eklenir. Spot numaraları aşağıya sağa ve yukarıdan soldan verilir. </li><li> Dikkatle ızgaraları seçin sekmesini lekelenme sonra noktalar hizalamak için &quot;Özellikler hizalama, Bloklar bul, Array bulun&quot;. Tüm özellikleri hizalama sonra, &quot;Analiz&quot; t seçerek görüntüyü analizAB. Sonuçlar, histogram ve scatter plot sahip yeni bir dosya oluşturun. &quot;Farklı Kaydet sonuçları&quot; sekmesi bu dosyayı kaydedin daha fazla analiz için bir .gpr dosyası olarak. </li><li> 9 açıklandığı gibi in-house geliştirilen Microprep yazılım paketi ile daha da normalleşmesi ve veri işleme gerçekleştirin. </li><li> Boya-takas DNA mikroarray verileri için bağımsız biyolojik çoğaltır kullanın. T-test1 bir varyantının CyberT uygulanmasını gerçekleştirmek ve hesaplamak yanlış keşif oranları (YTO) 9 tarif edilen. </li><li> Farklı olarak ifade edilen genler için, bir standart olarak p &lt;0.001 ve FDR &lt;0.05 alır. </li><li> Bir GEO (Gen İfadesi Omnibus) katılım numarası almak için NCBI gönderme sayfasından DNA mikroarray verileri yükleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Kayala, M. A., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyber-T+web+server:+differential+analysis+of+high-throughput+data.">Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data.</a> Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).</li><li>Chang, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+cells+to+matrixes+of+distinct+antibodies+coated+on+solid+surface.">Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface.</a> J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).</li><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li><li>Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+procedure+for+the+isolation+of+RNA+from+high-phenolic-containing+tissues+of+pecan.">A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan.</a> 27 (12), 1316-1318 (1992).</li><li>Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+extraction+of+intact+RNA+from+fruits+rich+in+polysaccharides+using+ripe+mango+mesocarp.">A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp.</a> (5), 440-442 (1992).</li><li>Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates.">A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).</li><li>Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+protocol+for+isolation+of+functional+RNA+from+plant+tissues+rich+in+secondary+metabolites.">A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites.</a> Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).</li><li>Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+isolating+high-quality+RNA+from+leaves+of+grapevine.">Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine.</a> Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).</li><li>Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPreP:+a+cDNA+microarray+data+pre-processing+framework.">MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework.</a> Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).</li><li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease.">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).</li><li>Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacR+is+a+repressor+of+lacABCD+and+LacT+is+an+activator+of+lacTFEG,+constituting+the+lac+gene+cluster+in+Streptococcus+pneumoniae.">LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).</li><li>Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UlaR+activates+the+expression+of+the+ula+operon+in+Streptococcus+pneumoniae+in+the+presence+of+ascorbic+acid.">UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid.</a> Microbiol. Read. Engl. , (2014).</li><li>Hendriksen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+contributions+of+glutamine-dependent+regulator+GlnR+and+GlnR-regulated+genes+to+virulence+of+Streptococcus+pneumoniae.">Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae.</a> Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).</li><li>Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arginine+acquisition+and+virulence+gene+expression+in+the+human+pathogen+Streptococcus+pneumoniae+by+transcription+regulators+ArgR1+and+AhrC.">Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC.</a> J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).</li><li>Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+have+neighbour's+fare:+extending+the+molecular+toolbox+for+Streptococcus+pneumoniae.">To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).</li><li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIVA:+Functional+Information+Viewer+and+Analyzer+extracting+biological+knowledge+from+transcriptome+data+of+prokaryotes.">FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes.</a> Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).</li><li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prosecutor:+parameter-free+inference+of+gene+function+for+prokaryotes+using+DNA+microarray+data,+genomic+context+and+multiple+gene+annotation+sources.">Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources.</a> BMC Genomics. 9, 495 (2008).</li><li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCLOSE+:+DISsection+of+CLusters+Obtained+by+SEries+of+transcriptome+data+using+functional+annotations+and+putative+transcription+factor+binding+sites.">DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites.</a> BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).</li><li>Baerends, R. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome2D:+a+visualization+tool+for+the+rapid+analysis+of+bacterial+transcriptome+data.">Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data.</a> Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).</li><li>De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PePPER,+a+webserver+for+prediction+of+prokaryote+promoter+elements+and+regulons.">PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons.</a> BMC Genomics. 13, 229 (2012).</li><li>Lanie, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+Avery's+virulent+serotype+2+strain+D39+of+Streptococcus+pneumoniae+and+comparison+with+that+of+unencapsulated+laboratory+strain+R6.">Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6.</a> J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).</li><li>Molecular Devices, Corp. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , (2005).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Bu bakteri tüm transcriptome analizini gerçekleştirmek için uygulanabilir bir kullanıcı dostu bir protokol açıklar. Bu özel tekniği ile ilgili önemli bir nokta hücreler toplanır altında koşulu değişecektir olmasıdır. Hücreler ve RNA izolasyonu hasat ettikten sonra, bu teknik bakteri örnekleri, her türlü eşit hale gelir ve tam olarak aynı adımlar takip eder ve bu nedenle, bakteri kültürü her türlü tatbik edilebilir. protokol çok basit ve kullanışlı ve RNA izolasyonu başlar. (A Macaloid...

gen aşırı ifadesi veya nakavt de dahil olmak üzere, belirli bir zamanda veya belirli koşullar altında bir tek hücreli organizma ya da bir ökaryotik hücrenin genomu tarafından kodlanan mRNA bolluğu (transcriptome) tüm dizi çalışma, transkriptomik olarak adlandırılır. Transcriptomics bize ölçüde genlerin bir zaman noktası, X de, belirli bir koşullar altında ifade edilmiştir ne gözlemlemek sağlar ve bize genler referansına göre ifade edilmiştir ne kadar güçlü hakkında bilgi verir. Bir mikro-dizi, bir katı substrat üzerinde bir iki boyutlu dizi (genellikle bir cam slayt, veya silikon ince film hücre), yüksek ölçüde nüfus ayırımına ile biyolojik maddenin büyük miktarlarda analiz etmek için kullanılan ve küçültülmüş olabilir, birden fazla mesaj göndermiş ve paralel işleme ve tespit edilmesi yöntemleri. Mikrodiziler DNA mikrodiziler, protein mikrodizilerinin, peptid mikrodizilerinin, doku mikrodizilerinin, antikor mikroarrayler, hücresel mikroarray&#39;ler ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli türleri, gelir. DNA mikrodizi olantemel olarak mikroskopik bir DNA noktalarından oluşan bir düzenek, katı bir yüzey, genellikle, cam sabitlenir. DNA mikro sıraları, bir genin ekspresyon seviyelerini ya da eş zamanlı olarak gen bir dizi ölçmek ya da bir genom 2,3 birden fazla bölge genotiplemesi için kullanılır. Bir prob pikomol (10 -12 mol), bir raportör olarak bilinen özel bir DNA dizisini temsil eder, her biri, DNA nokta içinde mevcuttur. örneklerden etiketli mRNA molekülleri &#39;hedefler&#39; denir. Fluorophores prob-hedef hibridizasyonu ve fluoroforla işaretlenmiş hedeflerin tespiti ölçmek için kullanılan hedef nükleik asit dizilerinin göreceli olarak tespit eder. Bir dizi onlarca prob binlerce içerebilir çünkü mikroarray deney paralel çoklu genetik testler gerçekleştirebilirsiniz. basit bir mikro-dizi deney düzeni Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Son zamanlarda, bu diziler, bu teknik, oldukça maliyet-etkiliğin kılan, yeniden kullanılabilir bizim ve diğer laboratuarlarda kurulmuşör. 8 - Farklı RNA izolasyon ve saflaştırma teknikleri C-TAB, SDS ve GT yöntemleri dahil olmak üzere 4 yılda geliştirilmiştir. Ayrıca, birçok kit de kullanılabilir. Gen ekspresyonu için, yüksek kaliteli bir RNA çok önemlidir. Bu nedenle, bir RNA izolasyon yöntemleri RNA&#39;nın bir maksimum miktarda elde etmek için modifiye edilir. Benzer şekilde, cDNA cDNA hazırlanması ve etiketleme için adımlar en aza indirilir. Taramadan sonra veri Normalleşme da in-house inşa yazılım paketleri ve araçları 9 kullanılarak verimli yapılır. Streptococcus pneumoniae nazofarenks kolonize ve pnömoni, sepsis, orta kulak iltihabı gibi çoklu enfeksiyonlar nedenidir ve 10 menenjit bir Gram-pozitif patojendir. bakteri büyümesi ve hayatta kalma 11,12 için gerekli bir besin ve çeşitli kullanabilir. Bazı çalışmalar üzerinde gerçekleştirilmiştirAmino asitlerin önemi ve virülans 13,14 rollerini vurgulayan pnömokok azot metabolizması ve düzenlenmesi. Bu çalışmada, S. transkriptomik tepki pneumoniae L-serin, insan kan plazmasındaki bol miktarda bir amino asit, konsantrasyonlarının değiştirilmesi DNA mikrodizileri kullanılarak rapor edilmiştir. S. Transkriptomik tepki L-serin (150 uM), en az bir konsantrasyonda büyütüldü pneumoniae maksimum konsantrasyon serin (10 mM) yetiştirilen ile karşılaştırıldı. Kimyasal olarak tanımlanmış ortam (CDM veya minimal ortam) 15 serin konsantrasyonunu kontrol etmek için, bu çalışma için kullanılmıştır. Bu çalışmanın odak noktası bu teknik kullanıcı dostu yapmak ve veri normalleşmesi ve analizi için farklı araçları sağlamaktır. Bu nedenle, bir dizi araç analizi ve veri yorumlama geliştirilmiştir. FIVA (Fonksiyonel Bilgi Viewer ve Analiz) sahip genlerin kümeler halinde bulunan bilgi işlem için bir platform sağlarBenzer gen ifade kalıpları ve fonksiyonel profilleri 16 oluşturmak için. Savcı varsayılan fonksiyonları ve genlerin 17 açıklamaları belirlenmesini kolaylaştırır başka bir yazılım paketidir. Kümeleme yöntemlerinin kullanımı yaparak, ACIKLANMASINI bir DNA bağlanma sitesi algılama algoritması sağlar. Genlerin Cis- -regulatory motifleri bu algoritmayı 18 kullanılarak tahmin edilebilir. Genome2D bir genom haritası 19 gen ifadesi seviyelerindeki değişiklikleri karakterize farklı renk aralıkları sunarak görselleştirme ve transcriptome verilerinin analizi için Windows tabanlı bir platform sunuyor. BİBER webserver all-in-bir analiz yöntemi, regulonlar, destekleyiciler ve transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri 20 için madencilik için bir araç kutusuna ek olarak sunmaktadır. Bir bakteri genomuna arası bölgelerde tam açıklama bu paketi kullanılarak elde edilebilir. Bu deney tasarımı için onlara bir platform sunuyor Biyologlar büyük biber yararlanabilirs böylece hipotez bilgi vitro 20 teyit edilebilir. Çoğu serbestçe kullanılabilir ve veri normalleşme ve analiz çok güvenilir yapmak gibi bu yazılım paketleri mikroarray analizi önemli katkı sağlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Acid phenol</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Roche RNA isolation kit</td><td>Roche Applied Science</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads</td><td></td><td>105015</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Boom</td><td>92013505.1000.</td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>First Strand buffer</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY Buffer</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac cooler</td><td>Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>Speedvac concentrator plus</td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td><td></td></tr><tr><td>Lifter-slips</td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>Wipe</td><td>KIMTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Genpix autoloader 4200A1</td><td>MSD analytical technologies</td><td></td><td>Microarray scanner</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

Gen ifadesi ve düzenlenmesi, farklı koşullar altında hücrelerin davranışını anlamak için çok önemlidir. Çeşitli teknikler gen ifadesini incelemek için günümüzde kullanılan, ama en tüm transcriptome ifade genel bir resmini sağlama açısından sınırlıdır. DNA mikro küresel gen ifadesinin tam bir bakış verir hızlı ve ekonomik araştırma teknolojisi, teklif ve binlerce analiz yardımcı da siteleri, hücrelerin transkripsiyonel aktivitesinin karakterizasyonu ve bağlayıcı yeni genlerin ve transkripsiyon faktörünün belirlenmesi gibi uygulamaların geniş bir dizi var genlerin (tek bir deneyde). Bu çalışmada, bir DNA mikro-dizi analizi için hücre hasat bakteriyel transcriptome analiz koşulları optimize edilmiştir. Dikkate zaman, maliyetler ve deneyler doğruluğu alarak, bu teknoloji platformu bakteriyel transcripto çalışmak için çok yararlı ve evrensel applicabale olduğunu kanıtlıyormes. Burada, biz S. transkripsiyonel yanıtları karşılaştırarak bir vaka çalışması olarak Streptococcus pneumoniae DNA mikroarray analizi gerçekleştirmek pneumoniae ortamda L-serin çeşitli konsantrasyonlarda varlığında büyütülür. Toplam RNA, RNA kalite kontrol kiti kullanılarak kontrol edilmiştir, bir RNA izolasyon kiti ve RNA kalitesi kullanılarak bir Macaloid yöntemi kullanılarak izole edilmiştir. cDNA, ters transkriptaz kullanılarak elde edilmiştir ve cDNA numuneleri, iki amin-reaktan bir floresan boyalar biri kullanılarak etiketlenmiştir. Ev yapımı DNA mikro-dizi kayar bir cDNA mikrodizi veri ön-işlem çerçevesi (Microprep) kullanılarak analiz edildi etiketli cDNA numuneleri ve mikro-dizi verileri melezleştirme için kullanıldı. Son olarak, Sanal T istatistiksel olarak anlamlı farklı şekilde eksprese edilmiş genlerin tanımlanması için Microprep kullanılarak oluşturulan verileri analiz etmek için kullanıldı. Ayrıca, in-house inşa yazılım paketleri (BİBER, FIVA, ACIKLANMASINI, Savcı, Genome2D) analiz için kullanıldıEldeki.

RNA, cDNA izolasyonları ve analiz L-serin temel amino asitlerinden biri olup, insan kan plazmasındaki konsantrasyonu, çocuklarda ve erişkinlerde 60-150 uM arasında değişmektedir. Pürin ve pirimidinlerin biyosentezinde rolü metabolizması önemini vurgular ve birkaç amino asitler (glisin, sistein ve triptofan) bir öncüsüdür. S. bütün transcriptome L-serin etkisini incelemek için, pneumoniae D39 vahşi tip suşu, aynı ortam içinde bir maksi...

Watch this Scientific Journal Video about A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae at JoVE.com

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

Bakteriyel Transkriptom Analizi Vaka çalışması için A Hızlı ve Güvenilir Boru Hattı: Serin bağımlı Gen Yönetmelik<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K Görüntüleme.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

Video: A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Genetik

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Biyokimya

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

Sentetik Biyoloji ve Doğal Ürün Uygulamaları için Yüksek Verimli Streptomices Transkripsiyon-Çeviri Araç Seti

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Biyomühendislik

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Biyoloji

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

Serotip 1 Streptococcus pneumoniae suşunda Mutantların İnşası 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is known for its ability to form biofilms that are protected by a matrix of exopolysaccharides. This matrix allows the microorganisms to be more resilient to external factors, including antibiotic treatment. One of the most common methods of biofilm growth for research is in microtiter plates or chambered slides. The advantage of these systems is that they allow for the testing of multiple growth conditions, but their disadvantage is that they produce limited amounts of biofilm for RNA extraction. The purpose of this article is to provide a detailed, step by step protocol on how to extract total RNA from small amounts of biofilm of sufficient quality and quantity for high throughput sequencing. This protocol allows for the study of gene expression within these biofilm systems.

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

This protocol presents a method to isolate RNA from Pseudomonas aeruginosa biofilms grown in chamber slides for high throughput sequencing.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is ...

Bakteriyel Transkriptom Analizi Vaka çalışması için A Hızlı ve Güvenilir Boru Hattı: Serin bağımlı Gen Yönetmelik

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması

Sentetik Biyoloji ve Doğal Ürün Uygulamaları için Yüksek Verimli Streptomices Transkripsiyon-Çeviri Araç Seti

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde

Serotip 1 Streptococcus pneumoniae suşunda Mutantların İnşası 519/43

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression