Mağara hayvanları çeşitli morfolojik, gelişimsel ve davranışsal özellikleri araştırmak için zorlayıcı bir sistem sağlar. Ama bu model sisteminin kurulmasında sınırlayıcı faktörlerden biri gen fonksiyonlarını manipüle etmemizi sağlayacak genetik araçların eksikliğidir. Burada Meksika mağara balığı Astyanax mexicanus'ta gen fonksiyonlarını manipüle etmek için üç farklı yaklaşım gösteriyoruz.
Bu araçlar, yüzey balıkları ve mağara balıkları arasındaki doğal varyasyonların altında yatan genlerin ve bunların fenotiplerle nasıl ilişkili olduğunu araştırmanızı sağlayacaktır. Bethany Stahl, laboratuvarımda yetenekli bir doktora sonrası bu prosedürü gösterecek. İşleme başlamadan önce, 100 mililitrelik Petri kabını balık sistemi suyunda çözünmüş sıcak %3 agarose ile doldurun ve kalıbın altında ki havayı yakalamamak için kalıbı yavaşça agarose'a indirmeden önce agarose'a dikkatlice bir yumurta enjeksiyon kalıbı yerleştirin.
Agarose katılaşmış olduğunda, dikkatlice kalıp çıkarın ve bir hafta kadar dört derece santigrat plaka saklayın. Daha sonra borosilikat cam kılcal damarlardan iğneleri ve üreticinin yönergelerine göre bir elektrot iğnesi çekmecesini çekin. Enjeksiyon günü, tek hücreli yumurtaları enjeksiyon plakasına aktarmak için cam bir pipet kullanın, enjeksiyon plakasının beş sırasını satır başına 30 ila 40 yumurta ile doldurun.
Balık sistemi su küçük bir miktar ile sulu yumurta tutun. Buz üzerinde Morpholino'yu eritin ve enjeksiyon çözeltisini hazırlayın, böylece 400 pikogram Morpholino yumurta başına uzun bir Microloader pipet ucu kullanılarak veya sonuna iki ila dört mikrolitre lik bir bolu ekleyerek enjekte edilir. Tüm iğneler yüklendiğinde, enjeksiyon iğne uçlarından fazla uzunluğu kesmek için forcep kullanın ve ilk iğneyi pikolitre mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edin.
Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında enjeksiyon çanak yerleştirin ve doğrudan sarısı içine Morpholino enjeksiyon çözeltisi bir nanolitre enjekte etmeden önce iğne ile her yumurta nüfuz mikromanipülatör kullanın. CRISPR enjeksiyonu için, 25 pikogram kılavuz RNA'yı CRISPR ile ilişkili protein 9 messenger RNA'nın 300 pikogramı ile karıştırın ve ortaya çıkan RNA çözeltisinin iki nanolitresini gösterildiği gibi her embriyoya enjekte edin. Tol2 transposaz ve Tol2 kanatlı plazmid enjeksiyonu için, Tol2 messenger RNA'nın mikrolitre başına 25 nanogramını Tol2 plazmid yapının mikrolitresine 25 nanogram ve RNase içermeyen suda fenol kırmızısı ile birleştirin.
Sonra her embriyoya az önce gösterildiği gibi bir nanolitre çözelti enjekte edin. Morpholino enjekte edilen hayvanları enjeksiyondan dört gün sonra, ilgi genine bağlı olarak taramak için, balık larvalarını stereo mikroskop altında görselleştirerek enjekte edilen hayvanların fenotipini veya davranışı ölçmek için video kaydını gözlemleyin. CRISPR indels için tarama için, PCR tüpler içine CRISPR enjekte embriyolar transfer ve polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR analizi için standart DNA çıkarma protokolleri uyarınca DNA ayıklamak.
Mutagenez değerlendirmek için, üç saat boyunca 70 volt bir% 3 agarose jel pcr ürün beş mikrolitre çalıştırın. Yabani tip, mutajenize olmayan DNA farklı bir bantla sonuçlanırken mutant DNA smeary bandıile sonuçlanır. Mağara Bir mexicanus bir kontrol Morpholino ile enjekte önemli ölçüde daha fazla lokomotor aktivite sergiler ve 24 saatlik bir süre içinde azaltılmış uyku, bir şifreli Morpholino ile enjekte yüzey balık ile karşılaştırıldığında.
Hipokretin oreksin Morpholino enjeksiyonu kontrol enjekte balık ile karşılaştırıldığında yüzey balık uyku üzerinde çok az etkisi vardır. Buna karşılık, Morpholino enjeksiyonu ile hipokretin oreksin nakavt mağara da yaşayan balık uyku üzerinde önemli bir etkisi vardır, hipokretin oreksin ekspresyonu ve uyku kaybı arasında doğrudan bir bağlantı sağlayan. Yüzey balıklarında albinizm geni OCA2'nin CRPSR aracılı mutagenezi bazı bireylerin yabani tip OCA2 pozitif alel için homozigot olarak sonuçlanmasına neden olur ve pigmentasyon barındırma ile ilişkilidir, OYSA CRISPR mutasyona uğramış OCA2 negatif alelin iki kopyasına sahip bireyler albinodur, mağara balıklarında mutant OCA2 geni ile albinizm arasında doğrudan bir bağlantı sağlar.
Kararlı F1 çizgileri oluşturmak için tol2 iletilmiş transgeni niçin yabani tipe arkadan çapraz olarak F0 pozitif'ini seçin. Bu, nöronal aktivitedeki farklılıkları ortaya çıkarmak, mağara ortamındaki davranış değişikliklerine aracılık etmek, a mexicanus'taki gen fonksiyonunu karakterize etmek ve işlemek için birçok ek transgenin ekspresyonuna zemin hazırlamak için canlı kalsiyum görüntülemeyi sağlar. Hatırlanması gereken en önemli şey yumurtaları sıkıca tabağa yüklemek, iğneyi düzgün kesmek ve mikroenjeksiyonu optimize etmektir.
Başarılı bir genetik nakavt, transgen entegrasyonu veya CRISPR aracılı gen düzenleme sonra, bu balık gelişimsel, davranışsal ve beyin aktivitesi analizleri için kullanılabilir.
