Name: assays for the degradation of misfolded proteins in cells
Uploaded: 2016-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
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We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).

시약 1. 준비 <ol><li> 세포 용해 버퍼를 준비한다 (50mM 트리스, pH가 8.8, 100 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 % NP-40). 부록 2 mM의 DTT, 1X 완전한 단백질 분해 효소 칵테일, 250 IU / ml의 벤조 나제 사용하기 전에. </li><li> 펠렛 버퍼를 준비합니다 (20 mM 트리스, 산도 8.0, 15 밀리미터의 MgCl 2). 부록 2 mM의 DTT, 사용하기 전에 1 배 완전한 단백질 분해 효소 칵테일 250 IU / ml의 벤조 나제. </li><li> 3X 비점 버퍼 (6 % SDS, 20 mM 트리스, pH를 8.0)을 준비한다. 사용하기 전에 150 mM의 DTT를 보충합니다. </li><li> 마이크로 형광 판독기를 사용하여 분석을위한 낮은 형광 DMEM 매체를 준비합니다. 25 mM의 글루코스, 0.4 mM의 글리신, 0.4 mM의 아르기닌 0.2 mM의 시스테인, 4.0 mM의 글루타민, 0.2 mM의 히스티딘 0.8 밀리미터 이소류신, 0.8mm의 류신 0.8 밀리미터 리신, 0.2 mM의 메티오닌, 0.4mm의 페닐알라닌, 0.4mm의 세린 0.8 믹스 MM의 쓰 레오 닌, 0.078 mM의 트립토판, 0.4 mM의 티로신, 0.8 MM의 발린, 1.8 mM의 염화칼슘 (2), 0.81 mM의 황산, 5.33 mM의 KCl을, 44.0 밀리미터의 NaHCO3, 110 mM의 염화나트륨, 0.9 mM의의 NaH 2 PO 4. pH가 7.4에 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 용액의 pH를 조정합니다. 여과를 통해 매체를 소독. 참고 :이 매체는 그 철을 제외하고 높은 포도당과 표준 DMEM 매체의 구성 요소가 포함되어 있습니다 (NO 3) 3, 비타민, 페놀 레드는 생략한다. 페놀 레드, 리보플라빈 정규 DMEM 배지에서 피리 독살 크게 형광 신호 (21)의 검출을 방해. 이들 성분이없는 배지 성공적인 생균 GFP 이미징 중요하다. 냉장 저장 될 때 매체는 12 개월 동안 안정하다. </li></ol> Atxn1 82Q의 GFP 2. 열화 분석 <ol><li> 접시 약 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM 배지 35mm 접시에 3 × 105 HeLa 세포, O / N 배양 세포가 트랜시 40-60 %의 합류로 성장 후에되도록. 주 : 필요한 판의 수는 시점 및 치료 (D)의 수에 기초아래 escribed. </li><li> 제조업체의 지시에 9에 따라 각 잘 사용하여 형질 전환 시약에 Atxn1 82Q-GFP / pRK5 플라스미드의 0.3 μg의와 형질 헬라 세포. DNA와 형질 감염 시약을 함유하는 마스터 형질 감염 혼합물을 각 웰에 대 나누어지는. </li><li> 4 ~ 5 시간 게시물 형질 전환, 여기 파장 450-490 nm의와 GFP 발현 거꾸로 형광 현미경으로 살아있는 세포를 검사합니다. 촬영 후 인큐베이터에 다시 세포를 돌려줍니다. 참고 :이 시점에서 핵 모두 확산 GFP 신호와 GFP 신호의 작은 얼룩을 준수하십시오. </li><li> 진공 흡인에 의해 매체를 제거하고 50 μg의 / ㎖의 CHX을 포함하는 2 ml의 신선한 DMEM를 추가합니다. 수확 전에 CHX으로 0, 4, 8, 12 및 16 시간 동안 세포를 처리한다. 프로 테아 좀 저하를 검사하려면 제어로 16 시간 동안 처리 한 접시에 프로 테아 좀 억제제 MG132 (10 μM)를 포함한다. </li><li> 각 시점에서 셀의 한 플레이트를 수확. 진공 흡입에 의해 매체를 제거3 ㎖ 빙냉 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 d는 판. 드라이 아이스에 접시를 스냅 동결. </li><li> 마지막 시점 (16 시간) 후, 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액 150 μL로 (모든 시점에서) 고정 된 세포를 긁어 30 분 동안 얼음 위에서 배양 하였다. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 17,000 XG에서 벤치 탑 원심 분리기에서 세포 용 해물을 원심 분리기. </li><li> 피펫을 사용하여 다른 튜브에, NP-40 수용성 (NS) 단백질을 포함하는 상층 액을 전송합니다. 주 : 필요한 경우 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 측정하기 위해 상청액을 사용한다. </li><li> 부드럽게 펠렛을 방해하지 않고 튜브를 약 200 μL의 1X PBS를 첨가하여 펠릿을 씻어. 조심스럽게 진공 흡인 또는 피펫으로 PBS를 제거합니다. 얼음에 15-30 분간 배양 한 후, 150 μl의 빙냉 세포 펠렛을 완충액을 다시 일시. 주 : 재 부유 펠렛 분율은 NP-40 불용성 (NI) 단백질이 포함되어 있습니다. DIAG 그림 1B를 참조하십시오세제 분별의 램. </li><li> 펠렛에서 재현 탁 NS 분수와 NP-40 불용성 (NI) 분획으로 3 배 끓는 버퍼의 75 μl를 추가합니다. 5 분간 가열 블록에 95 ° C에서 샘플을 가열한다. 참고 : NP-40 불용의 덩어리는 가열 및 샘플 명확해질 것이다 후 용해시킨다. </li><li> 삶은 NS와 NI의 분취 량을 SDS - 겔 로딩 버퍼를 추가합니다. SDS-PAGE 겔에 모든 시간 지점에서 수집 된 샘플의 동일한 볼륨을로드합니다. 시간 0 주에서 수집 된 샘플에서 약 20 μg의 NS의 부피로드에 대응 : NI 파에서 NS뿐만 아니라, SDS-가용성 (SS) 단백질은 SDS 분리 겔 해결할 수 있습니다. 반면, NI 분획에서 SDS-방지 (SR) 집계 겔로드 웰 (그림 1B)에 갇혀있다. 서양 얼룩 검출을 개선하기 위해, NI의 더블 볼륨을로드 할 수 있습니다. </li><li> 반 GFP 항체 및 강화 된 화학 발광 (ECL)를 사용하여 서양 얼룩에 의해 NS 및 SS Atxn1 82Q-GFP를 감지합니다. 주 :이 프로토콜을 사용할 때 SS 분율 Atxn1 82Q 일반적 이하 NS 분수와 비교된다. 긴 ECL 노출은 최적의 신호 필요합니다. </li><li> 도트 오 장치 (그림 1B)를 사용하여 필터 지연 분석하여 펠렛 분획에서 SR Atxn1 82Q를 검사합니다. 간단히, 0.2 μm의 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 들고 도트 오 장치를 설정합니다. 도트 오 장치의 각 웰에 삶은 NI의 부하 80 ~ 120 μL. 주 : SR 응집체의 단지 작은 양의 셀에 형성되기 때문에, 도트 블롯 분석을 위해, 웨스턴 블롯 분석에 사용 된 NS 분획의 부피의 약 10 ~ 15 배이며 SR 분획의 부피를로드. <ol><li> 진공 막을 통해 시료를 여과 한 후, 멤브레인에 부착 Atxn1 82Q-GFP 응집체는 안티 GFP의 면역 9,12,22에 의해 검출 될 수있다. 참고 : 필터 지연 분석의 자세한 설명은 이전 보고서를 9,12,22를 참조하십시오. 이 단계는 선택 사항입니다SR Atxn1 82Q이 프로토콜에 설명 된 짧은 트랜 따라 SS 및 NS 분획에 비해 최소화하기 때문이다. 또한, SR Atxn1 82Q의 레벨은 크게 CHX 체이스 (도 2B)에 걸쳐 동일하게 유지. 그러나, SS Atxn1 82Q의 양이 초기 실험에서 어떠한 약물 치료 나 유전자 발현을위한 시간이 지남에 따라 영향을 받는지의 여부를 검사하는 것이 여전히 중요하다. SS 단백질 종은 서양 얼룩에 의해 검출 될 수 SDS-PAGE 겔 로딩 우물에 머물. 그러나,이 방법은 덜 민감 이상의 가변 결과 (도 1b)를 생성한다. </li></ol></li></ol> SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 사용하여 NLS-루시 페라 제-GFP 3. 열화 분석 <ol><li> 접시 약 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM 배지 35mm 접시에 3 × 105 HeLa 세포. O / N 배양 후 40-60 %의 합류 트랜시 도달된다. 필요한 판의 번호 t의 수에 기초IME 점 치료 후술. </li><li> 제조업체의 지시에 9에 따라 각 잘 사용하여 형질 전환 시약으로 1.0 μg의 NLS - 루시 페라 제-GFP / pRK5의 플라스미드 형질 HeLa 세포. 물론 각각의 나누어지는에 대한 DNA 및 형질 전환 시약을 포함하는 마스터 형질 믹스를 확인합니다. </li><li> O / N 형질 전환 (시간 15 정도) 한 후, 여기 파장 450-490 nm의와 GFP 발현 거꾸로 형광 현미경으로 살아있는 세포를 검사합니다. 촬영 후 인큐베이터에 다시 세포를 돌려줍니다. 주 : 핵 확산 GFP 신호가 세포 (70 %)의 대부분에서 관찰 될 수있다. 세포의 작은 비율 (5 %) 핵 집계 있습니다. </li><li> 진공 흡인에 의해 매체를 제거하고 50 μg의 / ㎖의 CHX을 포함하는 2 ml의 신선한 DMEM를 추가합니다. 수확 전에 CHX와 0, 1.5, 3, 4.5, 6 시간 동안 세포를 치료. 프로 테아 좀 저하를 검사하려면 제어로 6 시간 동안 처리 한 접시에 추가 프로 테아 좀 억제제 MG132 (10 μM)를 포함한다. </li><li> 각 시점에서 셀의 한 플레이트를 수확. 진공 흡인 배지를 제거하고 3ml를 빙냉 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 플레이트를 세척한다. 드라이 아이스에 접시를 스냅 동결. </li><li> 마지막 시점 (6 시간) 후, 세포는 모든 타임 포인트 빙냉 세포 용해 완충액 150 μL로 긁어 30 분 동안 얼음 위에서 배양 냉동 완료된다. </li><li> 최종 2 % SDS의 농도가 50 mM의 DTT에 대한 전체 세포 용 해물에 SDS 겔 로딩 버퍼를 추가합니다. 5 분 동안 95 ℃의 열 블록의 샘플을 인큐베이션. </li><li> SDS-PAGE 및 안티 GFP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 NLS-루시 페라 제-GFP를 분석합니다. SDS-PAGE 겔에 모든 시간 지점에서 수집 된 샘플의 동일한 볼륨을로드합니다. 볼륨은 약 20 μg의 시간 0에서 수집 된 샘플에서 전체 세포 용 해물의와 일치로드. </li></ol> 형광 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 NLS-루시 페라 제-GFP 4. 실시간 열화 분석 <ol><li> 종자는 약 1 × 104투명 바닥을 가진 블랙 96- 웰 조직 배양 플레이트에 HeLa 세포. O / N 배양 후 50-70 %의 합류 트랜시 도달된다. 주 : 완전히 현탁 HeLa 세포를 포함하는 배지 60 ㎕를 각 웰에 직접 파종한다. 파종 후 앞뒤로 추가 매체 또는 바위 플레이트를 추가하지 마십시오, 그렇지 않으면 세포가 고르게 분산 될 수있다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 각 잘 사용하여 형질 전환 시약에 NLS-루시 페라 제-GFP / pRK5 플라스미드 9 0.05-0.1 μg의와 형질 헬라 세포. DNA와 형질 감염 시약을 함유하는 마스터 형질 감염 혼합물을 각 웰에 대 나누어지는. 세포와 세 개의 우물 각 처리 조건에 대한 배경 형광 신호 제어 역할을 DNA로 형질 전환되지 않습니다. 주 : 형질 변화를 감소시키는 다른 방법은 파종 전 세포를 형질 감염이다. 그러나, 세포의 대부분은 잘못 폴딩 된 단백질로 형질의 연결하거나이 방법을 사용하여 감소 가능성을 보여주기 위해 실패합니다. 몇 가지 세포 독성 잘못 접힌 단백질을 표현할 때 트립신 소화로 인한 스트레스를 참을 수 가능성이 높습니다. 그 결과, 전체의 형광 신호는 크게 감소된다. </li><li> 20 ~ 24 시간 형질 전환 한 후, 여기 파장 450-490 nm의와 GFP 발현 거꾸로 형광 현미경으로 살아있는 세포를 검사합니다. </li><li> 진공 흡인에 의해 매체를 제거합니다. 각 웰에 PBS 1X 약 200 μL를 추가 한 후 DMEM 배지의 잔량을 제거 할 대기음. </li><li> 5 % FBS, 50 μg의 / ㎖의 CHX와 낮은 형광 DMEM 매체의 60 μl를 추가합니다. 프로 테아 좀의 열화를 검사하기 위해, 한 세트의 샘플에 추가 테아 좀 억제제 MG132 (10 μM)를 포함한다. 각각의 치료 / 조건 우물 세중를 설정합니다. 참고 :이 FLUO의 저하를 일으킬 수있는 다른 요인을 배제하는 것이 중요하기 때문에 MG132 처리는 프로 테아 좀의 분해 컨트롤로 포함되어 있습니다세포 사멸 형광 소광 포함 rescence 신호. </li><li> CHX를 추가 한 후, 형광 플레이트 판독기에 즉시 GFP의 형광 신호를 측정한다. 주 : 소프트웨어 측정 설정을 표 1에 나타낸다. </li><li> 최대 8 ~ 10 시간 동안 접시마다 시간을 읽으십시오. 읽은 후, 세포 배양 인큐베이터에 다시 접시를 돌려줍니다. </li><li> 스프레드 시트 파일로 데이터를 내 보냅니다. 형광 강도로 잘 각각의 멀티 - 읽기의 평균 값을 사용합니다. 각 그룹의 시간 0의 평균값을 각 데이터 포인트의 값을 정규화한다. 도 4a 및도 4b,도 5, 우측 패널에 도시 된 바와 같이, 시간이 지남에 따라 표준화 형광 강도를 플롯. </li><li> 반복 측정 (23) 양방향 ANOVA를 사용하여 두 가지 조건 사이의 분해 속도의 통계 분석을 수행합니다. 주 :이 분석에서는, &quot;형광 강도&quot;는 &quot;treatm 반면 종속 변수이며엔트 조건 &quot;및&quot;시간 &quot;은 두 가지 요소이다. 대신 개별 시점에서 데이터를 비교, 반복 측정과 양방향 ANOVA 전체 시간 걸쳐서 두 처리 군 사이의 차이를 분석한다. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrasarcoplasmic+amyloidosis+impairs+proteolytic+function+of+proteasomes+in+cardiomyocytes+by+compromising+substrate+uptake.">Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake.</a> Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).</li><li>Link, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+green+fluorescent+protein+into+a+toxic,+aggregation-prone+protein+by+C-terminal+addition+of+a+short+peptide.">Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide.</a> The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

잘못 폴딩 된 단백질의 분해를 조절하는 기전은 세포 단백질의 항상성 유지에 필수적이며, 그들은 가능​​성 신경 퇴행성 장애 및 기타 단백질 미스 폴딩 질환의 치료를위한 유용한 약물 표적을 나타낸다. 여기서, 미스 폴딩 된 단백질의 분해를 조사 분석은 병원성 Atxn1 단백질 (Atxn1 82Q)와로서는 핵 국부 루시퍼 라제 돌연변이 (NLS-LucDM)를 이용하여 설명한다. 분해 18 시간 이?...

단백질은 세포 내에서 가장 풍부한 거대 분자이며, 이들은 거의 모든 생물학적 과정에서 중요한 역할을한다. 대부분의 단백질의 생물학적 활성에 자신 폴딩 필요하며, 천연 입체 구조를 유지. 비정상적인 단백질 입체 형태로는 정상적인 기능을 상실 할뿐만 아니라 자주 다른 단백질의 기능을 저해 세포 독성에 1,2- 수용성 올리고머 종 또는 응집체를 형성하지. 단백질 미스 폴딩 대응하기 위해 세포는 잘못 접힌 단백질 (3)을 제거하는 두 분자 그 나라의 형태에 도달하기 위해 펼친 또는 부분적으로 접힌 폴리 펩타이드를 지원 보호자, 및 분해 경로를 사용합니다. 복잡성과 폴딩 과정의 확률 적 특성상, 단백질 미스 폴딩은 불가피하며, 이는 돌연변이 생합성 오류 및 번역 후 손상 한 경우에 반전 될 수 없다. 따라서, 세포는 궁극적으로 degradat에 의존이온 통로 단백질은 품질을 유지한다. 세포 단백질의 품질 관리의 중요성 (PQC) 시스템은 암, 당뇨, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 근 위축성 측삭 경화증, 헌팅 톤병 (HD)와 같은 다수의 신경 퇴행성 장애를 포함한 단백질 미스 폴딩 질환의 보급에 의해 강조되고 척수 소 뇌성 운동 실조증 (SCA) 4,5. 예를 들면, p53 유전자의 돌연변이는 모든 경우 6 % - 50-70과 연관된 종양에서 가장 자주 유전자 병변이다. p53의 돌연변이의 실질적인 응집체 분획 (7)의 형성으로 이어지는 p53과의 형태를 변경 과오 돌연변이이다. 또한, 확장 된 polyQ 뻗어와 단백질은 유전자 및 병리 HD 및 SCA와 연결되어 있습니다. 영향을받는 단백질의 polyQ 스트레칭의 길이가 특정 Thres를 초과하면이 진보적이고 자주 치명적인 질병 매니페스트보유하고 polyQ 스트레칭의 길이가 8 연장으로 점점 심각해진다. 이들 질환을 치료하기위한 매력적인 방법은 치료 PQC 셀룰러 시스템, 특히 열화 경로를 강화하기위한 것이다. 그러나, 결함이있는 단백질, 포유 동물 세포에서, 특히 이들의 분해에 관여하는 경로가 제대로 이해 남아. 는 프로 테아 좀이 잘못 접힌 단백질의 분해 매우 중요하다는 것을 인식되었지만, 중요한 문제는 정의되지 않은 남아 : 구체적으로 인식 저하를 대상으로하는 방법을 잘못 접힌 단백질. PQC 시스템은 세포질, 소포체 및 미토콘드리아를 포함한 세포 구획에서 확인되었지만 또한, 핵의 PQC 시스템이 불분명 남아있다. 우리 연구소의 최근 연구는 핵으로 잘못 폴딩 된 단백질의 다양성을 인식하고 분해 시스템을 확인한의 포유 동물 세포 9. 이 시스템은 전 골수성 단백질 (PML), 핵 단백질과 노사정 모티브 함유 (TRIM) 단백질 가족의 구성원, 그리고 RNF4, 단백질을 포함하는 RING 도메인으로 구성되어 있습니다. PML 및 다른 여러 TRIM 단백질은 단백질 SUMOylation (10)의 특이성 및 효율을 촉진 SUMO (소 유비퀴틴 같은 개질제) E3 리가 아제 활성을 갖는다. RNF4 그들에게 유비퀴틴 리가 활동 (11)을 준다 링 도메인 이외에 하나 이상의 스모-상호 작용 모티브 (심즈)를 포함 SUMO-대상 유비퀴틴 리가 (STUbL)의 작은 그룹에 속한다. 우리는 PML 특별히 잘못 접힌 단백질에 고유 한 기능을 식별 할 수있다 분리 된 기판 인식 사이트를 통해 잘못 접힌 단백질을 인식하는 것으로 나타났습니다. 바인딩시에, PML 태그 내부 SUMOylation 사이트의 존재로 인해, 폴리 고리를 형성 할 수 SUMO2 / 3의 다결정 체인 거의 동일한 두 개의 포유류 SUMO 단백질과 단백질 미스 폴딩. 에스UMOylated 잘못 접힌 단백질은 그들의 유비퀴틴과 프로 테아 좀 저하로 연결 RNF4에 의해 인식됩니다. 우리는 상기에서 PML 결핍 SCA 유형의 마우스 모델 1 (SCA1) (9)의 행동 및 신경 병리학 적 결함을 악화로 PML-RNF4 시스템은 신경 퇴행에 대한 보호를 위해 중요하다는 것을 보여 주었다. 단백질 수준을 조절할 수있는 다른 셀룰러 메커니즘에서 단백질 분해를 구별하기 위해, 단백질 회전율의 비율은 9를 측정 하였다. 단백질 회전율을 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 방법 중 펄스 추적 및 사이클로 헥시 미드 (CHX) 체이스 있습니다. 이 두 가지 방법은 시간이 지남에 따라 조사, 각각 번역-실력 세포와 번역 - 억제 세포에 대한 관심의 총 기존의 단백질에 대한 관심의 방사성 동위 원소 표지 단백질. 그러나, 병원성 및 미스 폴딩하기 쉬운 단백질 연구에 대한 주요 과제는 상기 단백질의 반감기는 매우 싸다 될 수 있다는NG. 예를 들어, Ataxin-1 Ataxin-7, 헌팅, α-시누 클레인 및 TDP-43 모두는 24 시간 이상에 9,12-16 (12)의 반감기를 갖는다. 이들 단백질을 형질 세포, 장기 번역 억제 생존 할 수 특히 잘못 접힌 단백질 때문에 그 자체가 세포에 독성이 높은 수 있기 때문에 이들 단백질의 느린 회전율은 CHX 체이스 분석의 사용을 배제. 동위 원소 표지와 펄스 추적 분석은 매우 집계-경향이 단백질 도전 할 수있다. 대부분의 펄스 체이스 분석은 방사성 표지 된 모든 다른 단백질로부터 관심의 단백질을 분리하는 면역 침전에 의존하고 있습니다. 이 절차는 일반적으로 부정확 한 SDS-PAGE 전기 영동으로 분석을하고, SDS-불용성 집계를 형성 할 수있는 동안 긴 면역 침전 및 세척 절차를 포함한다. 느린 회전율이 9 설명과 함께 여기 프로토콜은 핵 잘못 접힌 단백질을 분석하는. 82 glutamines (Atxn1 82Q)의 스트레칭을 포함 Ataxin-1 (Atxn1)의 병원성 형태는이 목적을 팔에 사용됩니다. 세포에서 발현되면, 핵 (도 1a)에 Atxn1 82Q의 미시적 형태 보이는 개재물의 개선 된 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합. 펄스 추적 분석 Ataxn1 82Q의 반감기를 통해 18 시간 9 있음을 알 수있다. Atxn1 82Q는 기본 형태와 미스 폴딩 다른 특성의 입체뿐만 아니라 종 종으로 구성되어있다. 이들 종은 다른 속도로 분해되는 것으로, 따라서 개별적으로 분석해야한다. 에서 해물 Atxn1 82Q-GFP 발현 세포가 NP-40 수용성 (수용성 또는 NS 가능성 천연 단백질 또는 잘못 폴딩 올리고머 / 모노머 단백질을 나타내는)와 NP-40 불용성 (NI, 집계 / 미스 폴딩) 부분으로 분별된다. (; 가능성 무질서 응집체 SS) 또는 (SDS 내성 SR 후자는 또한 SDS 가용성으로 나눌 수있다 가능성 아밀로이드 피 브릴을) 분수 (그림 1B). 스케줄링 분획 면역 다음 여과 지연 분석에 의해 검출 될 수있는 반면에 SS 및 NS 분획 웨스턴 블 롯팅 한 다음 SDS-PAGE로 분석 될 수있다. CHX 체이스 세제 분류 방식을 조합 한 SS Atxn1 82Q의 반감기는 SS 분획 쉽게 인식되고 분해 될 수 있다는 것을 나타내는, NS Atxn1 82Q 총 Atxn1 82Q (도 2a)의 것보다 훨씬 짧다는 것을 발견 세포 9인치 따라서,이 방법은 잘못 폴딩 된 단백질의 동역학을 연구 및 분해 패턴을 비교하는 강력한 도구를 제공한다. 또한 미스 폴딩 된 단백질의 분해를 조절할 수있는 작은 고분자 화합물을 식별하기위한 고 처리량 스크리닝을위한 적합한 방법을 설명한다. 이 방법은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (LucDM) (17), 모델 샤페론 기판의 입체 형태 불안정화 변이에 기초한다. 우리는 퓨즈가핵 지역화 신​​호 (NLS)을 개발 LucDM 검출의 편의를 위해이 세포 구획에서 PQC 시스템을 조사하고 GFP (NLS-LucDM-GFP)합니다. 현미경 NLS-LucDM-GFP 형성 세포 (그림 3A)의 작은 비율에 표시 핵 집계. Atxn1 82Q, NLS는-LucWT --GFP 된 PML-RNF4 경로 9 SUMO2 / 3에 의해 수정 및 규제 NLS-LucDM-GFP-하지만 그 야생형 상대 유사합니다. SS 및 SR 종의 상대적인 양에 비해 최소 NS 있지만 NLS-LucDM-GFP는 아래 프로토콜 3에 기재된 조건을 이용하여, SS 및 SR 종을 형성한다. 분석을 단순화하기 위해, 우리는 SDS에게 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로합니다 (NS 및 SS 분획 모두 포함) 가용성 LucDM을 분석 할 수 있습니다. 중요한 CHX 체이스 분석은 SDS 수용성 NLS-LucDM-GFP의 반감기 LucDM 인식하고 열화 시스템의 특정 기판임을 시사는 야생형 카운터 파트 (도 3b)보다 훨씬 짧은 것으로 밝혀잘못 접힌 단백질. LucDM-GFP의 열화 전체 형광 신호의 현저한 저하를 야기한다. 따라서, 우리는 마이크로 플레이트 형광 계 분석을 이용하여 세포 LucDM-GFP의 실시간 검출에 대한 프로토콜을 개발했다. 많은 높은 처리량 화면 (HTS) 시스템은 비정상적인 단백질 18 ~ 20에 의한 세포 단위 및 세포 생존을 수정하는 약물이나 유전자에 대한 개발된다. 그러나, 거의 HTSs은 특히 포유 동물 세포 저하를 대상으로 설계되었습니다. 이 프로토콜은 셀룰러 미스 폴딩 된 단백질 분해에 대한 단백질 발현, 최저 및 약물 치료 효과의 신속한 대규모 분석을위한 강력한 시스템으로서 기능한다. 우리는 이러한 두 미스 폴딩 된 단백질의 분석 프로토콜을 설명하는 아래의 예로서 HeLa 세포를 사용. 형질 전환 조건으로 시간 경과에 개별 세포주에 대해 최적화 될 필요가있을 수 있지만 분석은 또한, 다른 세포주에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11995-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NP40S-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8699</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45000232</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche Boehringer Mannheim</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors GFP Monoclonal Antibody</td><td>Clonetech</td><td>632375</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin mAb Rabbit, IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A45060-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium</td></tr><tr><td>Olympus IX-81&amp;nbsp; Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX81</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom</td><td>Sigma-Greiner</td><td>89135-048</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200&amp;reg; PRO</td><td>TECAN</td><td>Infinite 200&amp;reg; PRO</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose acetate membrane 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sterlitech</td><td>CA023001</td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistical analysis software</td></tr></tbody></table>

assays for the degradation of misfolded proteins in cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

HeLa 세포의 50 %의 형질 감염 (도 1A) 후 20 시간 - 안정된 상태 분석에서, 미시적으로 볼 Atxn1 82Q-GFP의 핵 집합체 (30)에서 관찰 할 수있다. 반 GFP 항체를 이용하여 NS 및 SS 분수의 웨스턴 블롯 분석은 단백질의 분자량 (그림 1B)에 해당하는 100 kDa의 150 kDa의 마커 사이의 Atxn1 82Q-GFP의 고유 한 밴드를 보여줍니다. 스케줄링 분율 Atxn1 82Q-GFP 필터 지연 분석에 ...

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Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.9K 조회수.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening. 

비디오: Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

연구

생화학

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

신경과학

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

생물학

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

Source: Lee, H. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56425">Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Aggregate Formation Assay: 프로테아솜 억제제에 의한 유도 시 배양된 세포에서 단백질 응집을 검출하고 정량화하는 방법

Source: Lee, H. et al. Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells. J. Vis. Exp. (2017)
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Biochemical assays

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

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